蔡衛(wèi)吉， 凌 珺， 王寶禎， 馬 磊， 王彥鳳， 李 濤， 陳 靜

（1.寧夏醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 2.寧夏醫(yī)科大學(xué)生育力保持教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，銀川 750004；3. 寧夏醫(yī)科大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院，銀川 750004； 4.寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院腫瘤醫(yī)院腫瘤外二科，銀川 750004）

乳腺癌是人類最常見的癌癥之一，是一種具有不同組織病理學(xué)特征的異質(zhì)性疾病，其發(fā)生發(fā)展是由多因素共同作用的結(jié)果[1-2]。研究[3-5]發(fā)現(xiàn)，年齡、家族史、月經(jīng)初潮年齡或更年期年齡、生殖因素、雌激素和生活方式等均是導(dǎo)致乳腺癌發(fā)生的重要危險(xiǎn)因素。近年來個(gè)體化治療方案使乳腺癌各分子亞型的患者無病生存率和總生存率明顯提高[6-7]。然而，我國乳腺癌發(fā)病率仍逐年上升，且發(fā)病年齡呈年輕化趨勢(shì)[8-10]。因此，尋找新的治療靶點(diǎn)對(duì)于提高乳腺癌患者的生存率及降低復(fù)發(fā)率具有重要意義。雌激素受體陽性（ER +）乳腺癌是最常見的乳腺癌亞型，約占所有乳腺癌的70%[11]。Narasin 是一種從白色鏈霉菌中分離出的羧基聚醚離子載體，目前作為一種治療家禽球蟲病的抗生素被添加在飼料中[12]。本課題組前期研究[13]發(fā)現(xiàn)，Narasin 能夠通過TGF-β/SMAD 和IL-6/STAT3 信號(hào)通路來抑制ER+乳腺癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和生長(zhǎng)，但具體機(jī)制還需要進(jìn)一步探究?；谝陨涎芯勘尘埃狙芯坷蒙镄畔W(xué)方法分析經(jīng)Narasin 作用后ER+乳腺癌細(xì)胞基因的改變，尋找其發(fā)揮作用的分子機(jī)制及關(guān)鍵靶標(biāo)，以期為Narasin 抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移提供更充分的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要儀器設(shè)備 CO2培養(yǎng)箱（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）；4 ℃低溫離心機(jī)（Eppendorf 公司）；ABI 9700 RCR 儀（ABI 公司）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、NanoDropR2000、GeneChipRHybridization Oven 645、GeneChipRFluidics Station 450、GeneChipRScanner 3000 7G（Thermo Fisher 公司）。

1.1.2 細(xì)胞培養(yǎng)試劑 ER+乳腺癌細(xì)胞系MCF-7（美國Type Culture Collection 公司），TRIzol（Ambol 公司），總RNA 提取試劑盒（Macherey-Nagel公司），3’IVT PLUS 試劑盒（Affymetrix 公司），GeneChipR雜交、洗滌和染色試劑盒（Affymetrix公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 所有細(xì)胞用含有10%胎牛血清（MultiCell Technologies 公司）的DMEM（Multi-Cell Technologies 公司）培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每48 h 更換1 次培養(yǎng)基。Narasin（適馬-阿爾德里奇公司）溶解在100%二甲基亞砜中，生成10 mmol·L-1溶液，并以小份儲(chǔ)存于-80 ℃環(huán)境中。

1.2.2 RNA 的提取 將ER+乳腺癌細(xì)胞MCF-7按照2×106個(gè)/孔的密度接種在100 mm 組織培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞貼壁后將其分為對(duì)照組C（未經(jīng)Narasin 處理的3 個(gè)重復(fù)對(duì)照組C1、C2、C3）和實(shí)驗(yàn)組T（經(jīng)0.05 mmol·L-1的Narasin 處理的3個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)組T1、T2、T3）。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞密度達(dá)90%時(shí)用PBS 清洗，加入TRIzol，反復(fù)吹打，使細(xì)胞充分裂解。加入氯仿，室溫靜置15 min，隨后4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，吸取上清，加入異丙醇，靜置10 min，再次4 ℃、12 000 r·min-1離心10 min，75%乙醇洗滌沉淀，離心后室溫靜置5 min，充分干燥后，加入DEPC 輕彈溶解RNA，55～60 ℃放置10 min，使RNA 充分溶解，-70 ℃保存。采用分光光度計(jì)和瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定其濃度和質(zhì)量，總RNA 純化的詳細(xì)步驟嚴(yán)格按照3’IVT PLUS 試劑盒說明書操作。本實(shí)驗(yàn)中的對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均獨(dú)立重復(fù)3 次。

1.2.3 數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理和差異基因（DEGs）的篩選 將基因數(shù)據(jù)集用Affymetrix 公司提供的Expression Console 軟件進(jìn)行芯片QC 質(zhì)檢，用Robust Multichip Average（RMA）進(jìn)行統(tǒng)一性處理，利用R 語言中的limma 包初篩后得出DEGs。將樣品分組進(jìn)行組間統(tǒng)計(jì)學(xué)Moderated T-test 分析，根據(jù)組間＞1.5 倍差異和組間P≤0.05 進(jìn)行篩選，得到Narasin 處理后的實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組上調(diào)、下調(diào)的DEGs，并以對(duì)照組的基因芯片為驗(yàn)證集，考察所篩選出來的DEGs 表達(dá)值與聚類區(qū)分度。根據(jù)樣本類型和基因表達(dá)量，使用MEV4.9.0（Multi Experiment Viewer）繪制基因聚類熱圖。DEGs 火山圖以差異倍數(shù)（log Fold Change）為x軸，P值為y軸并以灰色粗線標(biāo)示倍數(shù)差異與顯著性的閾值，將過檢的下調(diào)基因標(biāo)示為綠色，上調(diào)基因標(biāo)示為紅色。

1.2.4 KEGG 通路和GO 富集分析 為了進(jìn)一步分析DEGs 的生物學(xué)功能，根據(jù)基因本體（gene ontology，GO）數(shù)據(jù)庫和京都基因與基因組百科全書（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路數(shù)據(jù)庫對(duì)差異表達(dá)顯著的基因進(jìn)行生物學(xué)富集分析。GO 富集分析分為分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）和細(xì)胞組成（cellular composition，CC）3 個(gè)部分，主要對(duì)DEGs 進(jìn)行功能類別或者細(xì)胞定位分析。

2 結(jié)果

2.1 Narasin 處理后MCF-7 細(xì)胞的DEGs 分析

綜合分析后，共篩選出111 個(gè)DEGs（|log2FC|≥1.5，adjustP-value＜0.05），與對(duì)照組相比，用0.05 mmol·L-1Narasin 處理后的實(shí)驗(yàn)組有82 個(gè)上調(diào)基因和29 個(gè)下調(diào)基因（差異在1.5 倍以上）?；鹕綀D和聚類熱圖用于表示這些基因在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中的表達(dá)情況。DEGs 火山圖如圖1A 所示，越偏離中心兩條線的點(diǎn)，代表此基因在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的差異越明顯。DEGs 聚類熱圖（圖1B）顯示，下調(diào)的基因包括細(xì)胞色素P450 24 A1（CYP24A1）、眼缺失蛋白2（eyes absent homolog 2，EYA2）等。

圖1 Narasin 處理后MCF-7 細(xì)胞差異基因的表達(dá)

2.2 GO 富集分析

為進(jìn)一步探究0.05 mmol·L-1Narasin 處理后111 個(gè)DEGs 的生物學(xué)意義，將以上DEGs 上傳到DAVID 數(shù)據(jù)庫以確定重要的GO 類別和KEGG途徑。GO 分析結(jié)果顯示，在BP 中下調(diào)的DEGs主要富集在先天免疫系統(tǒng)、Ⅰ型干擾素信號(hào)通路、病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控、免疫反應(yīng)、傷口愈合、細(xì)胞遷移、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞黏附及細(xì)胞增殖等（圖2A）。在CC 中下調(diào)的DEGs 主要富集在膜的錨定組件、血液微粒、細(xì)胞中心體、核斑點(diǎn)等（圖2B）。而在MF 中下調(diào)的DEGs 主要富集在細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合、DNA 結(jié)合、雙鏈RNA 綁定、受體結(jié)合、鳥苷酸交換因子活性、鈣調(diào)蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔阻遏物活動(dòng)等（圖2C）。

圖2 Narasin 處理后MCF-7 細(xì)胞DEGs 的GO 富集分析

2.3 KEGG 通路分析

KEGG 通路富集分析結(jié)果顯示，DEGs 主要富集于癌癥中的小分子核糖核酸、單純皰疹病毒感染、麻疹、黏著斑、ECM-受體相互作用、PI3KAkt 信號(hào)通路、甲型流感、Rap1 信號(hào)通路及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路等，見圖3。

圖3 Narasin 處理后MCF-7 細(xì)胞DEGs 的KEGG 通路分析

3 討論

乳腺癌是全球女性癌癥相關(guān)死亡的主要原因，早期轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是乳腺癌死亡率高的主要原因，并且患者的預(yù)后個(gè)體差異很大[14-15]。現(xiàn)階段針對(duì)乳腺癌的有效治療方法主要是藥物化療，但化療易導(dǎo)致多種不良反應(yīng)，效果欠佳，需要靶向藥物來彌補(bǔ)這一治療缺陷，以提高患者的生活質(zhì)量[16-18]。因此，新的抗乳腺癌藥物的研發(fā)至關(guān)重要。

本課題首先通過基因芯片檢測(cè)未經(jīng)Narasin處理的乳腺癌細(xì)胞和0.05 mmol·L-1Narasin 處理的乳腺癌細(xì)胞DEGs 的表達(dá)情況，結(jié)果得到111個(gè)DEGs，其中有81 個(gè)基因表達(dá)上調(diào)，29 個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。隨后對(duì)DEGs 進(jìn)行GO 富集分析和KEGG 通路分析。GO 富集分析結(jié)果顯示，BP 中下調(diào)的DEGs 主要富集在先天免疫系統(tǒng)、Ⅰ型干擾素信號(hào)通路、病毒基因組復(fù)制的負(fù)調(diào)控、免疫反應(yīng)、傷口愈合、細(xì)胞遷移、基因表達(dá)調(diào)控、細(xì)胞黏附和細(xì)胞增殖等過程中。CC 中下調(diào)的差異基因富集在膜的錨定組件、血液微粒、細(xì)胞中心體、核斑點(diǎn)等。MF 中下調(diào)的差異基因主要富集在細(xì)胞因子活性、酶結(jié)合、DNA 結(jié)合、雙鏈RNA 綁定、受體結(jié)合、Rho 鳥苷-核苷酸交換因子活性、鈣調(diào)蛋白結(jié)合、轉(zhuǎn)錄輔阻遏物活動(dòng)等。KEGG 通路分析結(jié)果顯示，下調(diào)差異基因通路主要富集在小分子核糖核酸、單純皰疹病毒感染、麻疹、黏著斑、ECM-受體相互作用、PI3K-Akt 信號(hào)通路、甲型流感、Rap1 信號(hào)通路及糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE 信號(hào)通路等。

基因芯片分析發(fā)現(xiàn)，Narasin 下調(diào)了CYP24A1、EYA2 等基因。CYP24A1 又稱為25-羥維生素D3-24-羥基化酶，由CYP24A1 基因編碼，在維生素D 的代謝中發(fā)揮重要作用[19-20]。研究[21-22]顯示，維生素D 的代謝與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等有關(guān)，維生素D 缺乏會(huì)增加罹患癌癥的風(fēng)險(xiǎn)。CYP24A1介導(dǎo)的維生素D 缺乏促進(jìn)了乳腺腫瘤的發(fā)展，并且CYP24A1 過表達(dá)與基礎(chǔ)性乳腺癌的預(yù)后不良相關(guān)，提示CYP24A1 可能是一個(gè)候選癌基因[23-24]。EYA2 是EYA 家族蛋白之一，具有高度保守的EYA 結(jié)構(gòu)域，該家族成員可以編碼一系列轉(zhuǎn)錄輔助因子。研究[25-28]表明，EYA2 可以促進(jìn)多種類型的腫瘤發(fā)生，其在乳腺癌組織和細(xì)胞中高度表達(dá)與乳腺癌預(yù)后不良相關(guān)。

IL-6 /STAT3 信號(hào)通路、PI3K-Akt 信號(hào)通路等能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物學(xué)過程[29-31]。本課題組前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Narasin能夠影響STAT3 和Akt 的激活，抑制MCF-7 細(xì)胞的遷移和侵襲能力[13]。本研究中KEGG 通路分析顯示，下調(diào)的差異基因富集在PI3K-Akt 信號(hào)通路，因此推測(cè)Narasin 可能通過調(diào)節(jié)STAT3 的激活影響EYA2 的表達(dá)，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，后續(xù)將通過基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究利用生物信息學(xué)方法從多角度考察了對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組在基因表達(dá)及生物學(xué)過程之間的差異。從基因?qū)用嫣剿髁薔arasin 抑制乳腺癌增殖和轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)及通路，為尋找Narasin 作用的分子機(jī)制及關(guān)鍵靶標(biāo)，以及抗腫瘤轉(zhuǎn)移的治療提供了更好的方向。但更為具體的機(jī)制還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行更加深入的探究。