常雪花,閆波雯,翟榮臻,張 政,吳 斌,魏 佳,

(1.巴音郭楞職業(yè)技術學院,新疆庫爾勒 841000;2.新疆農業(yè)科學院農產品貯藏加工所,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】木納格葡萄果皮薄,采后貯藏過程中容易受到機械損傷、病原菌和真菌的侵害,又因為葡萄含糖量高達15%～25%[1],長時間貯藏[2]會受到侵染使含糖量下降。二氧化硫(sulfur dioxide,SO2)是常用的鮮食葡萄保鮮劑。目前SO2在葡萄保鮮中的作用研究多集中在提高果實抗病性方面,但關于SO2調控葡萄糖代謝途徑缺乏系統研究。采前不同處理方式會對發(fā)育果實中的糖代謝會產生影響。研究SO2對葡萄采后糖代謝機制的調控作用,對優(yōu)化葡萄采后SO2保鮮技術有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】賴呈純等[3]研究發(fā)現摘心處理有利于巨峰葡萄果實糖分的快速積累。王萌等[4]研究發(fā)現蕓苔素內酯處理有利于提高糖代謝相關酶的活性。賀琰等[5]研究發(fā)現采用外源油菜素內酯處理葡萄能提高果實發(fā)育過程中糖代謝酶的活性?！颈狙芯壳腥朦c】目前,僅有個別研究探討SO2類保鮮劑對葡萄采后糖含量及糖代謝相關酶活性的影響[6, 7],但并未從分子層面探討SO2對葡萄采后糖代謝途徑的影響。需研究SO2對木納格葡萄采后糖含量及糖代謝途徑的影響。【擬解決的關鍵問題】運用高效液相色譜技術(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)與熒光定量PCR(Real-time quantitative-PCR,qPCR)相結合方法,分析SO2調控果實糖代謝的主要途徑,研究SO2對葡萄采后糖代謝機制的調控作用,為葡萄采后SO2保鮮技術的優(yōu)化提供重要理論依據與技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 木納格葡萄

木納格葡萄成熟期(可溶性固形物含量≥18%)采收于新疆阿圖什市商業(yè)果園。采收后用冷藏車立即運輸至新疆農業(yè)科學院,在(0±2)℃預冷24 h,挑選顏色均一、無機械傷的果實。

1.1.2 試 劑

蔗糖、葡萄糖、果糖(標準品) (德國Dr.Ehrenstorfer股份有限公司);十六烷基三甲基溴化銨、酚仿(北京索萊寶科技有限公司);氯仿、異戊醇(天津市致遠化學試劑有限公司);氯化鋰(Sigma公司);“TIAN Script RT Kit”試劑盒(天根生化科技有限公司);FastStart Essential DNA Green Master (羅氏公司)。所有試劑均為分析純。

1.1.3 儀器與設備

AltusA-10型高效液相色譜(美國PerkinElmer公司);MS105DU型分析天平(瑞士Mettler Toledo公司);LDZX-50KBS型滅菌器(上海申安醫(yī)療器械有限公司);Hettich D-78532型微型離心機(德國Hettich公司);OSE-MP25型TGear Plate微孔板離心機(天根生化科技有限公司);DYY-6D型核酸電泳儀(北京市六一儀器廠);BioPhotometer D30型核酸蛋白測定儀(德國Eppendorf公司);Biometra型PCR儀(德國耶拿分析儀器公司)。

1.2 方 法

1.2.1 原料預處理

42筐(每個聚乙烯(PE)筐(35 cm×25 cm×20 cm)中裝約7 kg葡萄)。將42筐葡萄隨機分為2組:(1)SO2處理(21筐),頂部內襯吸水紙和SO2保鮮紙(SO2緩釋型葡萄專用保鮮紙:主要成分為焦亞硫酸鈉,由新疆烏魯木齊格瑞德保鮮科技有限公司提供,經中國綠色食品協會許可);(2)對照組(CK,21筐),置于相同條件下,頂部內襯吸水紙。處理后,將所有葡萄放入0.03 mm厚PE袋中,(0±0.5)℃,相對濕度(RH)為90%～95%,保存60 d。每隔10 d從每個重復樣本中隨機收集50個水果的樣品,液氮凍樣置于-80℃冰箱保存。

對照組(0、10、30、60 d)和SO2處理組(10、30、60 d)分別取冷凍樣品各10 g,將其包裹在錫箔紙中并貼上標簽。每個樣品含3個平行樣本,送公司測序。分別取葡萄組織分析代謝和基因表達。

1.2.2 HPLC測定葡萄中蔗糖、葡萄糖、果糖含量

1.2.2.1 材料預處理

糖含量分析采用文獻方法[8]。將0.50 g葡萄粉加入50 mL超純水中,超聲30 min, 12 000 r/min,4℃離心30 min,取上清液,過0.22 μm水相濾膜后待測。每個處理3個平行。

1.2.2.2 標準品母液和標準工作液

用純水配制1 000 mg /L蔗糖、葡萄糖和果糖標準品母液,避光儲存于-4℃冰箱。標準品工作液由標準品母液稀釋配制并繪制標準曲線,濃度梯度為0.10、0.20、0.50、1.00、2.00、5.00和10.00 mg/L。

1.2.2.3 回收率

通過回收率試驗評價測定方法的準確性。取CK組第30 d樣品、SO2處理組第30 d樣品分別添加已知量的標準溶液(各100 mg/L)。每次添加是在葡萄樣品靜置20 min時加入各標準溶液,在相同色譜下分析,計算回收率。

回收率(%)=

(1)

重復測定(n=3)標準溶液的每一種糖并證明測定方法的準確性。保留時間及峰面積的測量被用來評估測定方法的重復性及再現性。

1.2.2.4 色譜條件

色譜柱:鈣離子交換柱(安捷倫Hi-Plex Ca 8.0 μm,7.7 mm×300 mm)。

儀器條件:流動相:純水;檢測器:RI檢測器;柱溫:60℃;流速:0.4 mL/min;進樣量:10 μL。

1.2.3 糖代謝相關基因熒光定量表達

1.2.3.1 總RNA的提取

木納格葡萄中總RNA的提取方法參考前期研究方法[9]。取200 mg葡萄組織凍樣,放入2.0 mL離心管,依次加入65℃預熱的十六烷基三甲基溴化銨緩沖液1 mL,震蕩混勻,65℃水浴20 min;加入1 mL體積比為24∶1的氯仿-異戊醇混勻,離心,取上清液;將上清液至于1.5 mL離心管,加1/4體積10 mol/L LiCl,4℃冰箱沉降8～12 h;沉降后,離心,去上清液加入預冷75%乙醇500 μL,離心去上清液;加入500 μL SSET緩沖液溶解沉淀,轉移至1.5 mL離心管;加入等體積的酚仿混勻,離心,上清液轉移至1.5 mL離心管;加入等體積24∶1的氯仿-異戊醇,重復上一步驟;取上清,加入2.5倍體積無水乙醇,混勻;-80℃條件下沉降30～60 min;離心,去上清;加1 mL預冷75%乙醇漂洗沉淀,離心,重復2次;添加1 mL預冷無水乙醇再次漂洗管內沉淀,去上清,自然干燥;加入20 μL DEPC-H2O溶解RNA,-80℃保存,待測。瓊脂凝膠電泳檢測RNA的完整性,檢測方法參照前期方法[9]。

1.2.3.2 RNA反轉錄

總RNA采用天根“TIAN Script RT Kit”試劑盒反轉錄為cDNA。

1.2.3.3 糖代謝相關基因cDNA片段擴增

內參基因Actin參照前期設計[9],糖代謝基因特異性引物采用DNAman 6.0根據GeneBank中已登陸的氨基酸保守序列設計,送往生物公司合成。表1

表1 木納格葡萄糖代謝相關基因引物序列

1.2.3.4 實時熒光定量PCR

采用羅氏FastStart Essential DNA Green Master試劑盒測定基因表達水平。

1.3 數據處理

使用Sigma Plot 12.5軟件作圖,SPSS 19.0進行數據分析。*、**、ns分別表示P<0.05差異顯著、P<0.01差異極顯著和P>0.05無顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 木納格葡萄中蔗糖、葡萄糖和果糖含量的測定

研究表明,葡萄糖、蔗糖和果糖相應的驗證參數。校準曲線在范圍內線性回歸良好(R2=0.994 8～0.999 6)。相對標準偏差值介于0.009 0和0.020 0,回收率91.25%～98.00%。建立的測定方法能夠同時定量測定果實中蔗糖、葡萄糖和果糖的含量。圖1,表2

圖1 HPLC色譜圖-標準品(A)和樣品(B)

表2 HPLC法測定葡萄中糖的驗證參數

2.2 SO2對木納格葡萄中蔗糖、葡萄糖和果糖含量的影響

研究表明,貯藏第0 d,葡萄果實中蔗糖、葡萄糖和果糖含量分別為(8.97±0.07)mg/g、(130.97±0.69)mg/g、(98.20±1.05)mg/g。葡萄果實蔗糖含量總體呈下降趨勢。在前30 d,SO2處理組蔗糖含量緩慢下降,30～60 d下降速度加快,貯藏第60 d,SO2處理組與CK組果實中蔗糖含量分別為(7.93±0.05)、(7.47±0.05)mg/g。SO2處理組葡萄糖含量呈先升高后降低趨勢,第10 d達到最大值(134.37±0.81)mg/g;而CK組葡萄糖含量始終呈下降趨勢;貯藏第60 d,SO2處理與CK果實中葡萄糖含量分別為(120.40±1.22)、(114.27±0.87)mg/g。在貯藏過程中,SO2處理組和CK組葡萄果實中果糖含量變化趨勢是相同的,0～30 d呈下降趨勢,30 d達到最低值,分別為(88.97±0.86)、(84.17±0.74)mg/g,30～60 d呈上升趨勢;貯藏第60 d,SO2處理組與CK組果實中果糖含量分別為(99.90±0.77)、(93.50±0.88)mg/g。SO2處理對葡萄果實的蔗糖、葡萄糖和果糖含量有顯著影響,其含量明顯高于CK(P<0.01)。圖2

注:*、**分別表示P<0.05或P<0.01,下同

2.3 總RNA完整性

研究表明,18 s和28 s兩條帶,且28s條帶亮度約為18s條帶的2倍;A260:A280在1.82～1.96,A260:A230大于2.0,提取的總RNA沒有被雜質污染且沒有降解。圖3

圖3 木納格葡萄總RNA瓊脂糖凝膠電泳

2.4 木納格葡萄糖代謝相關基因cDNA片段擴增

研究表明,葡萄的糖代謝相關基因cDNA擴增結果沒有出現雜帶和引物二聚體,條帶清晰且都在100～300 bp,相似程度大于96%,擴增產物即為目的基因。圖4

注(Note):泳道M:DNA標準分子量DL2 000;1:VvActin;2,3:VvCWINV;4:VvPGK;5:VvSuSy;6:VvHxK1;7:VvFRK2;8:VvFRK1;9:VvHxK2;10:VvHxK3;11:VvSPS3;12:VvCIN;13:VvSPP1;14:VvSPP2;15:VvSPS1;16:VvPGM;17:VvGPI;18:VvFBA;19:VvGAPDH;20:VvPGMM;21:Vvenolase;22:VvPK

2.5 SO2對木納格葡萄糖代謝相關基因的影響

研究表明,qRT-PCR分析的20個基因與RNA-Seq數據變化趨勢一致。

與第0 d相比,VvCWINV、VvSuSy、VvHxK1、VvHxK2、VvFRK2、VvFBA、VvPGK和VvPK在葡萄中的表達在貯藏期間有所提高。CK組葡萄在貯藏期間VvCWINV的表達量增加,而SO2處理組的葡萄在0～20 d,VvCWINV的表達量持續(xù)增加,在20～60 d基本保持不變。與CK相比,SO2處理組VvCWINV的表達量較低(P<0.01)。SO2處理組葡萄的VvCWINV表達在60 d時比CK組低2.60倍,SO2處理組葡萄的VvSuSy表達在10 d時顯著高于CK組(P<0.01),50 d時顯著高于CK組(P<0.05),60 d時顯著高于CK組(P<0.05)。在0～20 d,SO2處理組VvHxK1的相對表達量明顯低于CK組(P<0.01),30 d時無顯著性差異(P>0.05)。40～60 d,處理組的VvHxK1表達明顯高于CK組(P<0.01)。SO2處理組VvHxK2的相對表達量明顯高于CK組(P<0.01),表達量在30 d時達到峰值,是CK組的9.38倍,第60 d時表達水平高于CK組,但無顯著性差異。在0～20 d,SO2處理組和CK組的VvFRK2相對表達量有相似的上升趨勢,SO2處理組的樣品的表達水平明顯高于CK組(P<0.01)。在20～60 d,SO2處理組VvFRK2表達水平明顯下調(P<0.01),呈下降趨勢。

0～40 d,SO2處理組VvFBA相對表達量明顯高于CK(P<0.01),30 d時達到最大值,是CK組的2.42倍。CK組中VvFBA表達水平呈上升趨勢,60 d時相對表達量是SO2處理組的3.60倍。CK組VvPGK表達水平先升高后降低,在第30 d達到最高。SO2處理組VvPGK表達水平呈上升趨勢。30 d時的相對表達量比CK組低2.61倍,60 d時的表達比CK組高2.09倍。CK組和SO2處理組的VvPK表達水平均呈上升趨勢,差異不顯著(P>0.05)。

與第0 d相比,VvGPI、VvSPS1、VvSPS3和VvHxK3在貯藏期間的表達水平呈持續(xù)下降趨勢。VvGPI與VvSPS3的表達趨勢相似,在第30 dVvSPS3的表達顯著高于對照組(P<0.05),在其余貯藏時間VvGPI與VvSPS3的表達水平無顯著性差異(P>0.05)。0～40 d,SO2處理組VvHxK3的表達水平顯著高于CK組,40～60 d顯著低于CK組(P<0.01)。

SO2處理組與CK組VvSPP2和VvFRK1的表達趨勢相似,在0～30 d時持續(xù)下降至最低,30～60 d時表達量有所提高,但始終低于第0 d時的表達水平。在SO2處理組中,VvSPP2在第10、20、30和50 d的相對表達量,及VvFRK1在第20 d和第30 d的相對表達量均顯著高于CK(P<0.05)。

SO2處理組VvSPP1的相對表達量顯著高于CK組。SO2處理組第20 d和CK組第10 d,VvSPP1表達水平開始降低。0～40 d,VvSPP1表達水平顯著高于CK(P<0.01),第60 d時顯著低于CK(P<0.05)。

VvCIN表達水平總體呈下降趨勢。在貯藏早期,SO2處理組VvCIN的表達水平的表達下降緩慢,在20 d時無顯著性差異。30～60 d時,SO2處理組VvCIN相對表達量顯著低于CK(P<0.01)。

VvPGM表達水平呈先升高后降低趨勢。SO2處理組VvPGM相對表達量在第10 d達到最大值,而CK組在第30 d達到最大值。SO2處理組在10～50 d時VvPGM表達水平顯著高于CK(P<0.01),在60 d時無顯著性差異(P>0.05)。

在10、50和60 d SO2處理組VvGAPDH表達水平顯著低于CK(P<0.05)。20～40 d時,SO2處理組VvPGMM表達顯著高于CK(P<0.01)。SO2處理組和CK組的VvPK表達水平均呈上升趨勢,但無明顯差異(P>0.05)。圖5

3 討 論

3.1葡萄果實含糖量高,糖分積累在果肉(中果皮)細胞的液泡中,占成熟果實鮮重的65%～91%[10]。在葡萄中,葡萄糖和果糖占大多數,其他糖如蔗糖、棉子糖、麥芽糖和半乳糖占其余部分[11]。SO2處理可以維持葡萄果實中較高的糖含量?？扇苄蕴?如葡萄糖、蔗糖和果糖)濃度的增加可以提高植物對干旱、鹽堿和寒冷等非生物脅迫的耐受性[12]。

植物不能直接利用蔗糖,必須被分解以提供碳和能量。一部分在細胞外分解,一部分由蔗糖特異性載體運輸進入細胞。采后離體組織的CWINV基因的表達水平會增高,CWINV可以通過己糖供應給韌皮部的伴生細胞提供能量[13-15]。高CWINV活性是匯組織的一個特征,通過蔗糖水解促使韌皮部卸載[16, 17]。SO2處理消除了通常由葡萄采后引起的VvCWINV表達的增加。SuSy和CIN也是植物細胞質中促進蔗糖裂解的兩個主要酶。糖的反應機制通過向細胞和器官發(fā)送信號來調節(jié)蔗糖的代謝,以適應光合產物可用性的變化[18]。SO2處理在貯藏前期和后期顯著提高VvSuSy基因的表達,加速水解蔗糖,而VvCIN基因表達水平在貯藏后期比CK低,在SO2處理組果實細胞質中,蔗糖的水解在貯藏前期是由2種酶共同控制的,而貯藏后期蔗糖水解主要是VvSuSy基因起作用。果實中高蔗糖含量主要是由于SO2處理組VvCWINV和VvCIN的相對表達量高于CK組。

在貯藏過程中,VvPGM表達先升高后降低。在貯藏中期,SO2處理組的VvPGM表達高于CK組,蔗糖含量與VvPGM表達一致。SO2處理對VvGPI表達水平無明顯影響。

SPS活性與蔗糖的有效性有關[19]。SPS活性所反映的蔗糖合成能力決定了蔗糖的積累,而蔗糖積累是果實品質的重要組成部分[20]。貯藏期間,果實中VvSPS表達量和蔗糖含量呈下降趨勢,隨著果實成熟,VvSPS基因在果實蔗糖合成中的主要作用減弱。葡萄是非躍變型水果,隨著貯藏時間的延長,其呼吸作用減弱,無法為合成蔗糖所需的底物UDP-葡萄糖提供足夠的ATP。SPP在催化蔗糖生物合成的最后一步中起作用,SPS產生的6-磷酸蔗糖不可逆水解為蔗糖[21]。Salerno等[22]提出,SPS純化過程中存在一種改變SPS催化活性的蛋白被鑒定為SPP,SPS可能與SPP相互作用,從而促進更有效的蔗糖合成。雖然SO2處理VvSPP1和VvSPP2表達水平高于CK組,整體上VvSPS相對表達量的降低減少了底物(6-磷酸蔗糖)的含量,導致蔗糖含量的降低。

注:*、**、ns分別表示P<0.05、P<0.01、P>0.05

3.2HxK是一種具有獨特調節(jié)功能的雙功能酶,是葡萄糖信號傳感網絡的組成部分。酵母菌中,糖信號傳感器YHxK2的過表達在轉基因植物中能夠增加HxK的催化活性從而降低糖信號敏感性而導致負效應的產生,過表達酵母YHXK2雖然可以提高酶催化活性,但在轉基因植物中并沒有對糖信號有調控功能[23]。HxK是一種抑制光合相關基因的糖傳感器[24]。HxK2是EMP途徑第一步的限速酶,具有負調控作用。SO2處理組光合作用的增加與VvHxK2表達水平的提高密切相關,需要進一步分析。VvHxK2相對表達量的變化與葡萄糖含量的變化趨勢一致。

葡萄果實中有兩種不同的果糖激酶同工酶,分別是FRK1和FRK2。FRK2對果糖的親和力遠遠高于FRK1。高濃度的果糖能抑制FRK2的活性,而不能抑制FRK1的活性[25]。研究中,VvFRK的表達水平與果糖含量變化之間也存在這種關系,并且在SO2處理組中表現得更為明顯。

3.3SO2處理組在貯藏第10 d葡萄糖含量的升高主要與VvCIN和VvSuSy表達水平高有關,而貯藏期間的高葡萄糖含量也與VvSPS1表達低有關。SO2處理組貯藏期間的高果糖含量與VvCIN、VvSuSy的高表達、VvSPS1的低表達有關。

EMP是葡萄糖氧化的一個重要代謝途徑。研究表明,在醛縮酶過表達的植物中,光合速率的增加導致生長和生物量的增加[26]。SO2處理使葡萄中VvFBA基因的表達水平高于CK組,這可能是其能夠促進果實光合作用的原因之一。

研究發(fā)現,SO2處理組VvGAPDH的表達水平低于CK組。需要進一步的試驗來闡明NADP-甘油醛-3-磷酸脫氫酶在光合作用中的失活機制[27]。

在植物中,PGKs不僅參與EMP途徑和糖異生途徑,還參與光合碳代謝。Pgk1.1基因低表達突變體表現出生長速度緩慢和光合能力下降[28]。經過SO2處理后,VvPGK的表達水平不斷提高,激活EMP途徑,從而增強葡萄收獲后的光合活性。

PGK與PGMM在體外存在相互作用[29]。在CK組中,VvPGMM的表達在貯藏期間下降。貯藏中期,SO2處理組VvPGMM的相對表達量低于CK,導致EMP途徑增強。enolase活性的降低會影響次級代謝,但不會抑制呼吸速率[30]。與CK相比,SO2處理組Vvenolase的表達水平在整個貯藏期間都很低,引起了一些次生代謝變化。

丙酮酸通過PK以磷酸烯醇丙酮酸為原料合成。特別是當用于輸出和呼吸過程的可用光同化物較少時,PK在調節(jié)夜間呼吸方面起關鍵作用[31]。SO2處理對VvPK表達水平無明顯影響。

4 結 論

SO2可以調節(jié)木納格葡萄采后貯藏中的糖代謝相關途徑。SO2可以維持葡萄果實中的蔗糖、葡萄糖和果糖含量,主要是0～10 d時葡萄糖含量顯著提高。貯藏第60 d,SO2處理組果實蔗糖、葡萄糖和果糖含量分別比CK組高0.47、6.13、6.40 mg/g。經qPCR驗證,糖代謝相關基因的相對表達量與轉錄組圖譜對應基因的表達量變化趨勢一致;SO2主要通過調控VvCWINV、VvCIN、VvSuSy和VvSPS1基因的表達水平來維持葡萄果實的高糖含量;通過調控VvHxK2、VvFBA、VvGAPDH和VvPGK基因的表達水平來激活葡萄果實采后貯藏過程中的光合活性。