黃娜，羅玲，羅惠波, ，黃丹, ，李子健, *

1. 四川輕化工大學(xué)生物工程學(xué)院（自貢 643000）；2. 四川化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院（瀘州 646300）；3. 釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室（自貢 643000）

蘋果酒作為世界上產(chǎn)量第二大的果酒，具有營養(yǎng)豐富、適量飲用有益健康等特點[1]。更為重要的是，蘋果酒保留了蘋果中很多的營養(yǎng)物質(zhì)，相比糧食發(fā)酵制成的酒更具營養(yǎng)[2]。國內(nèi)外研究認為酵母是形成蘋果酒香氣最重要的因素，釀酒酵母具有酒精轉(zhuǎn)化率高且發(fā)酵徹底的特點，但其單獨發(fā)酵通常會造成蘋果酒香氣單一、風(fēng)味同質(zhì)化問題。因此，將葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）[3-4]、異常維克漢姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）[5]、德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）[6]和馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）[7]等產(chǎn)香酵母應(yīng)用于蘋果酒釀造中。結(jié)果表明，這類產(chǎn)香酵母能將原料中的前體物質(zhì)轉(zhuǎn)化為酯、酸和高級醇等風(fēng)味物質(zhì)，并合成多種酶，對蘋果酒色澤、風(fēng)味的形成具有重要的作用[8]。近年來，將產(chǎn)香酵母與釀酒酵母混合發(fā)酵釀造蘋果酒為國內(nèi)外研究的熱點：Satora等[9]發(fā)現(xiàn)在蘋果酒釀造中，與純培養(yǎng)相比，混合培養(yǎng)（在大多數(shù)情況下）能產(chǎn)生更多的乙醇、甲醇和揮發(fā)性酯；Liu等[10]評估釀酒酵母和Williopsis saturnus共發(fā)酵對蘋果酒揮發(fā)性特征的影響，共發(fā)酵導(dǎo)致更復(fù)雜的揮發(fā)性特征，可能會影響蘋果酒的芳香特性；曾朝珍等[11]對德爾布有孢圓酵母（Torulaspora delbrueckii）與釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）單獨和混菌發(fā)酵過程中蘋果酒香氣成分進行測定發(fā)現(xiàn)，混菌發(fā)酵有利于增加蘋果酒香氣成分的復(fù)雜性。

已報道的關(guān)于Candida tropicalis主要是應(yīng)用于木瓜酒[12]、蘋果醋[13]等，而將Candida tropicalis作為產(chǎn)香酵母，與釀酒酵母混合培養(yǎng)應(yīng)用于蘋果酒的釀造還鮮有報道，試驗以單接種釀酒酵母為對照組，對釀酒酵母和Candida tropicalis混菌發(fā)酵不同添加比例對蘋果酒風(fēng)味物質(zhì)合成的影響進行探究，以期為Candida tropicalis在蘋果酒釀造中的應(yīng)用提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅富士蘋果（市售）；釀酒酵母（安琪酵母股份有限公司）；Candida tropicalis（從蘋果中分離得到，保存于釀酒生物技術(shù)及應(yīng)用四川省重點實驗室）；果膠酶（30 000 U/g，上海源葉生物科技有限公司）；檸檬酸（廣西珍露食品有限公司）；焦亞硫酸鉀（煙臺帝伯仕酵母有限公司）；乙酸正戊酯（Adamas試劑有限公司）；氯化鈉（成都市科龍化工試劑廠）。

1.2 儀器與設(shè)備

DZKW-4水浴鍋（北京中興偉業(yè)世紀(jì)儀器有限公司）；ST2100 pH計（奧豪斯儀器有限公司）；ZHJH-C118C超凈工作臺、ZWYR-D2403恒溫培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；50/30 μm DVB/CAR/PDMS纖維萃取頭（美國Supelco公司）；7890A/5975B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）。

1.3 方法

1.3.1 蘋果酒的發(fā)酵試驗

1.3.1.1 工藝流程及操作要點

工藝流程：蘋果→挑選→清洗、去皮、去核、切碎→榨汁→焦亞硫酸鉀→果膠酶→調(diào)糖、調(diào)酸→滅菌→接種→發(fā)酵→蘋果酒

操作要點：將蘋果洗凈去皮，去核，并切為小塊，放入100 ℃左右的熱水中，浸泡5 min左右，果肉與去離子水按1∶1（W/W）比例榨汁，及時添加90mg/L SO2（添加固體焦亞硫酸鉀代替），同時添加50 mg/L的果膠酶充分混合均勻后，分別添加精制白砂糖和檸檬酸來調(diào)整糖度和pH，于100 ℃滅菌5 min，調(diào)整酵母菌濃度為1×106CFU/mL，釀酒酵母按照10%（V/V）的接種量，培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵7 d，糖度＜4 g/L時，即可終止發(fā)酵，得到蘋果酒。

1.3.1.2 發(fā)酵比例

按表1的4種接種比例同時接種2種酵母菌。其中，A為單接種釀酒酵母，B為熱帶假絲酵母按照5%（V/V）接種量，C為熱帶假絲酵母按照10%（V/V）接種量，D為熱帶假絲酵母按照20%（V/V）接種量；每種接種比例設(shè)置3個重復(fù)，對蘋果酒風(fēng)味物質(zhì)合成的影響進行探究。

表1 發(fā)酵比例

1.3.2 理化指標(biāo)檢測

還原糖、酸度、pH和酒精度的測定分別參考GB 5009.7——2016《食品中還原糖的測定》、GB 5009.239——2016《食品酸度的測定》、GB 5009.237——2016《食品pH值的測定》和GB 5009.225——2016《酒中乙醇濃度的測定》。

1.3.3 揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的測定

揮發(fā)性化合物的測定使用改良的葉萌祺[14]、李記明等[15]的方法。具體操作：采用頂空固相微萃取法（HS-SPME）進行香氣成分的富集。移取5 mL蘋果酒樣品于15 mL頂空瓶中，加入2.8 g氯化鈉和6 μL乙酸正戊酯（內(nèi)標(biāo)），在45 ℃條件下平衡10 min，頂空吸附45 min，進樣，在250 ℃下解析2 min。色譜柱升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min后以3 ℃/min升溫升至120 ℃，以8 ℃/min升溫至230 ℃，保持10 min，載氣He，流速0.8 mL/min，分流方式為不分流；質(zhì)譜電子能量70 eV，離子源溫度200 ℃，掃描范圍33～450amu，燈絲流量0.25 mA，檢測器電壓350 V。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Office Excel 2010和Origin 2022b對理化指標(biāo)和風(fēng)味物質(zhì)進行數(shù)據(jù)處理及分析；使用R軟件繪制揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)網(wǎng)絡(luò)圖；利用SIMCA-P 14軟件建立偏最小二乘-判別分析模型，對風(fēng)味數(shù)據(jù)進行可視化趨勢分析，并篩選差異揮發(fā)性風(fēng)味化合物。

2 結(jié)果與分析

2.1 釀酒酵母與Candida tropicalis不同接種比例下蘋果酒理化指標(biāo)的變化規(guī)律

滴定酸影響蘋果酒的pH，繼而影響到酵母細胞的繁殖能力、細胞活性、營養(yǎng)物質(zhì)的吸收、產(chǎn)物的代謝與分泌[16]。不同接種比例下蘋果酒理化指標(biāo)的變化如圖1所示，在釀酒酵母接種量相同的條件下，Candida tropicalis接種量增加，總酸和pH變化不明顯，可滴定酸度含量范圍為1.35～1.52 g/L，pH范圍為3.73～3.79，適宜的蘋果酒的pH范圍應(yīng)在3.20～3.80[17]。隨著Candida tropicalis接種量增加，酒精度整體上呈先降再升趨勢，但都低于釀酒酵母純種接種的酒精度，混菌接種的還原糖整體上呈下降趨勢，且都低于釀酒酵母純種發(fā)酵的還原糖含量，可見加入Candida tropicalis降低酒精度，Xu等[18]通過順序接種Saccharomyces cerevisiae和Hanseniaspora valbyensis混菌發(fā)酵試驗將酒精濃度降低25.06%～51.38%。

圖1 不同接種比例下蘋果酒理化指標(biāo)的變化

2.2 釀酒酵母與Candida tropicalis不同接種比例下蘋果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)比較

由釀酒酵母與Candida tropicalis不同接種比例下蘋果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的組成及相對含量如圖2所示。通過熱圖對蘋果酒風(fēng)味成分可視化分析可知，蘋果酒中共鑒定出38種揮發(fā)性化合物，包括7種酸、15種醇、7種酯、8種羰基化合物和2種萜烯類化合物。通過聚類分析可知，將樣品聚類為2類，分別為：1∶0，1∶0.5，1∶1.0和1∶2.0；顯然，不接種Candida tropicalis和接種Candida tropicalis的蘋果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)明顯區(qū)分。將風(fēng)味物質(zhì)聚類為4類，分別為Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ。釀酒酵母純種發(fā)酵下蘋果酒中第Ⅱ類風(fēng)味物質(zhì)相對含量明顯高于其他組，第Ⅱ類風(fēng)味物質(zhì)主要包括乙酯類化合物；乙酯類化合物是蘋果酒中重要的酯類化合物，大多呈現(xiàn)花香和果香，給酒體帶來怡人香氣[15]。釀酒酵母與Candida tropicalis接種比例1∶0.5時，蘋果酒中第Ⅲ類風(fēng)味物質(zhì)相對含量明顯高于其他組，第Ⅲ類風(fēng)味物質(zhì)主要為乙酸乙酯和高級醇；產(chǎn)香酵母是最重要的乙酸乙酯產(chǎn)生菌[19]，劉婷婷等[20]從發(fā)酵堆積料和出池酒醅中獲得1株乙酸乙酯產(chǎn)生菌Candida tropicalisZ4；高級醇主要通過酵母菌的酒精發(fā)酵途徑或氨基酸降解途徑生成，作為次級代謝產(chǎn)物釋放至酒體中[21]，適量的高級醇類物質(zhì)可以賦予酒體愉快的香氣，過量的高級醇則會導(dǎo)致酒質(zhì)下降，其中苯乙醇及其酯類和低級脂肪酸構(gòu)成蘋果酒香氣的基本骨架[22]。釀酒酵母與熱帶假絲酵母接種比例1∶1時，蘋果酒中第Ⅰ類風(fēng)味物質(zhì)相對含量明顯高于其他組，其中乙酸異戊酯是蘋果酒中重要的乙酸酯，乙酸異戊酯呈果味、類似香蕉味[15,23-24]；3-甲硫基丙醇可以賦予獼猴桃酒更強烈的果香[25]；2, 3-丁二醇具有奶油香，是酒中極少數(shù)能夠呈香的多元醇之一[15]。釀酒酵母與Candida tropicalis接種比例1∶2時，蘋果酒中第Ⅳ類風(fēng)味物質(zhì)相對含量明顯高于其他組，其中3-羥基丁酸乙酯在葡萄酒中對水果香氣的感知具有增強作用[26]，呋喃類化合物是糖降解和美拉德反應(yīng)的典型產(chǎn)物[27]?？梢姡劸平湍讣兎N發(fā)酵下，以乙酯類化合物的合成為主；而Candida tropicalis添加則主要影響乙酸乙酯、乙酸異戊酯、高級醇和呋喃類化合物的合成。

圖2 不同接種比例下蘋果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的熱圖分析

2.3 釀酒酵母與Candida tropicalis不同接種比例下蘋果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)伴生關(guān)系

為研究不同接種比例對揮發(fā)性代謝物之間關(guān)聯(lián)的影響，基于共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)分析分別構(gòu)建4個不同接種比例下的揮發(fā)性風(fēng)味網(wǎng)絡(luò)，進一步了解揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)間的伴生關(guān)系。如圖3所示，A組的網(wǎng)路中共存在24種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和127條互作關(guān)系，共被劃分為3個模塊，占比分別為54.17%，33.33%和12.5%，正丙醇、乙酸異戊酯、12-冠醚-4具有較高的度，可以反映這3種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與較多揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有關(guān)聯(lián)。B組的網(wǎng)路中共存在28種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和197條互作關(guān)系，共被劃分為3個模塊，占比分別為60.71%，28.57%和10.71%，糠醇與較多揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有關(guān)聯(lián)。C組的網(wǎng)路中共存在35種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和277條互作關(guān)系，共被劃分為4個模塊，占比分別為31.43%，28.57%，22.86%和17.14%，乙醛、甲基庚烯酮、正己醇、乙酸苯乙酯、苯乙醛、正辛酸和（±）-6-甲基-5-庚烯基-2-醇與較多揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有關(guān)聯(lián)。D組的網(wǎng)路中共存在34種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)和297條互作關(guān)系，共被劃分為3個模塊，占比分別為41.18%，35.29%和23.53%，甲基庚烯酮、苯乙醛、2, 3-丁二醇和3-甲基-1-戊醇與較多揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)具有關(guān)聯(lián)。釀酒酵母與Candida tropicalis不同接種比例混菌發(fā)酵對風(fēng)味物質(zhì)相互作用有較大影響，隨著Candida tropicalis接種量的增加，蘋果酒風(fēng)味物質(zhì)的復(fù)雜性增加。這與Satora等[9]、Liu等[10]和曾朝珍等[11]的結(jié)果相似，產(chǎn)香酵母的加入有利于增加蘋果酒香氣成分的復(fù)雜性。

圖3 不同接種比例下蘋果酒揮發(fā)性代謝物共現(xiàn)性網(wǎng)絡(luò)

2.4 釀酒酵母與Candida tropicalis不同接種比例下蘋果酒揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)與理化指標(biāo)相關(guān)性分析

對不同接種比例的蘋果酒的差異風(fēng)味物質(zhì)進行篩選，以VIP值大于1為標(biāo)準(zhǔn)，確定不同發(fā)酵條件下有顯著差異的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)20種，如圖4（a）所示，包含2, 5-二甲?；秽?、5-甲基呋喃醛、正己酸乙酯、正辛酸、5-羥甲基糠醛、（±）-6-甲基-5-庚烯基-2-醇、辛酸乙酯、正丙醇、乙酸苯乙酯、異丁醇、癸酸乙酯、異戊醇、2-甲基丁酸、乙酸乙酯、正丁醇、正丁酸、乙醇、正己醇、3-羥基丁酸乙酯、苯乙醇。其中，2, 5-二甲?；秽?-甲基呋喃醛、正己酸乙酯是差異最大的前3種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。

圖4 不同接種比例下蘋果酒差異風(fēng)味物質(zhì)與理化指標(biāo)的冗余分析

為進一步解析不同接種比例下蘋果酒主要差異風(fēng)味物質(zhì)與理化相關(guān)性，進行RDA冗余分析，如圖4（b）所示。pH與2, 5-二甲?；秽?-甲基呋喃醛、5-羥甲基糠醛和正丁酸呈正相關(guān)性，與其他大多數(shù)差異風(fēng)味物質(zhì)呈負相關(guān)性；總酸（TTA）與2, 5-二甲?；秽?-甲基呋喃醛、5-羥甲基糠醛和正丁酸、3-羥基丁酸乙酯、正丁醇、正丙醇、異丁醇呈正相關(guān)性，與其他大多數(shù)差異風(fēng)味物質(zhì)呈負相關(guān)性；還原糖（RS）與正己酸乙酯、正辛酸、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、（±）-6-甲基-5-庚烯基-2-醇、異戊醇、2-甲基丁酸、乙酸乙酯、乙醇、正己醇和苯乙醇呈正相關(guān)性，與其他差異風(fēng)味物質(zhì)呈負相關(guān)性。假絲酵母屬、德爾布有孢圓酵母和畢赤酵母屬等產(chǎn)香酵母，可直接參與生化反應(yīng)或調(diào)節(jié)風(fēng)味物質(zhì)的形成，賦予酒體獨特的香氣[28]。不同接種比例下蘋果酒主要差異風(fēng)味物質(zhì)與理化的相關(guān)性分析進一步解析Candida tropicalis對蘋果酒風(fēng)味物質(zhì)合成的影響。

3 結(jié)論

通過改變釀酒酵母和Candida tropicalis混菌發(fā)酵接種比例，測定蘋果酒相關(guān)理化指標(biāo)和揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)。熱圖聚類結(jié)果表明：釀酒酵母和Candida tropicalis不同接種比例下蘋果酒中共鑒定出38種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，釀酒酵母純種發(fā)酵下，共鑒定出24種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，乙酯類化合物相對含量較高；釀酒酵母與Candida tropicalis接種比例1∶0.5時，共鑒定出28種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，乙酸乙酯和高級醇相對含量較高；釀酒酵母與Candida tropicalis接種比例1∶1時，共鑒定出35種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，乙酸異戊酯、3-甲硫基丙醇和2, 3-丁二醇相對含量較高；釀酒酵母與Candida tropicalis接種比例1∶2時，共鑒定出34種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，3-羥基丁酸乙酯和呋喃類化合物相對含量較高。共線性網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果表明，Candida tropicalis的加入提高蘋果酒風(fēng)味物質(zhì)的復(fù)雜性。相關(guān)性分析結(jié)果表明，Candida tropicalis可參與或調(diào)節(jié)風(fēng)味物質(zhì)的形成。試驗結(jié)果為后續(xù)產(chǎn)香酵母在蘋果酒釀造中的應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。