景贊，呂雪梅，劉超

樂(lè)山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心（樂(lè)山 614000）

三聚氰胺，分子式是C3H6N6，IUPAC命名為1, 3,5-三嗪-2, 4, 6-三胺。它為白色的單斜晶體，幾乎沒(méi)有氣味，常溫下微溶于水[1]。三聚氰胺是重要的化工原料，可用于制造一種熱固性樹脂——三聚氰胺甲醛樹脂，又稱密胺樹脂[2]，也可用于制造餐飲器皿。三聚氰胺對(duì)人身體有害[3-4]，不可用于食品加工或食物添加，曾被違法添加進(jìn)乳制品中，造成對(duì)嬰兒極大的危害[5-7]。以豆?jié){、椰汁為原料，探討各種因素對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)[8-10]的影響。

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)（LC-MS/MS）是將分離性能好的液相色譜串聯(lián)專屬、能提供相對(duì)分子量和結(jié)構(gòu)信息的質(zhì)譜法的一種快速、靈敏、準(zhǔn)確的現(xiàn)代分析技術(shù)，被廣泛用于定量分析復(fù)雜基質(zhì)中的物質(zhì)[11-16]，但LC-MS/MS檢測(cè)中常存在基質(zhì)效應(yīng)，探討基質(zhì)效應(yīng)的影響因素，并研究采用內(nèi)標(biāo)法[17-20]消除三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

高效液相色譜-質(zhì)譜儀（AB-API4000，美國(guó)AB SCIEX公司）；立式高速冷凍離心機(jī)（GL 20M，江蘇新春蘭科技儀器有限公司）；電子天平（ME104E，梅特勒-托利多儀器有限公司）；超純水機(jī)[LKS01-40，科大環(huán)?？萍迹ㄉ钲冢┯邢薰綸；氮吹儀（HSB-B，天津市恒奧科技發(fā)展有限公司）；數(shù)控超聲波清洗機(jī)（KQ700，昆山市超聲儀器制造有限公司）；固相萃取儀（VM24，天津艾杰爾科技有限公司）；WCX前處理小柱[60 mg/3 mL沃特世科技（上海）有限公司]；Cleanert PCX前處理小柱（60 mg/3 mL 天津艾杰爾科技有限公司）；Bond Elut Plexa PCX前處理小柱（60 mg/3 mL安捷倫科技有限公司）。

1.2 材料與試劑

各類豆?jié){樣品（來(lái)源于樂(lè)山當(dāng)?shù)夭煌瑪偽唬灰瑯湟ㄒ瑯浼瘓F(tuán)有限公司）；特種兵生榨椰子汁（湛江市蘇薩食品有限公司）；椰牛椰汁（海南新大食品有限公司）；統(tǒng)一頭道榨椰子汁（統(tǒng)一企業(yè)中國(guó)控股有限公司）；匯源椰子時(shí)光（北京匯源食品飲料有限公司）；銀鷺淳椰汁（廈門銀鷺食品集團(tuán)有限公司）；歡樂(lè)家生榨椰子汁（歡樂(lè)家食品集團(tuán)股份有限公司）；娃哈哈來(lái)一榨（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；光明一只椰子（光明乳業(yè)股份有限公司）；椰島椰汁（海南椰島集團(tuán)股份有限公司）；乙腈（色譜純）；甲醇（色譜純）；三氯乙酸（分析純）；氨水（含量25%～28%）；海沙（化學(xué)純）；乙酸銨（分析純）；三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（99.4%，批號(hào)G976694，Dr.Ehrenstorfer GmbH）；水（GB/T 6682規(guī)定一級(jí)水）；三聚氰胺-13C3（100 μg/mL，壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司）。

1.3 樣品處理

采用GB/T 22388——2008《原料乳與乳制品中三聚氰胺檢測(cè)方法》中4.4.1.1小節(jié)提取，4.4.2小節(jié)凈化。

1.4 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液

準(zhǔn)確稱取10 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品至10 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.5 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)及內(nèi)標(biāo)中間液

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液：準(zhǔn)確移取25 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

三聚氰胺內(nèi)標(biāo)中間液：準(zhǔn)確移取250 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液至25 mL容量瓶中，用50%甲醇水溶解并定容至刻度，混勻后備用。

1.6 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜測(cè)定

液相色譜及質(zhì)譜條件參照GB/T 22388——2008。

1.7 基質(zhì)效益評(píng)價(jià)方法

運(yùn)用定量測(cè)定空白基質(zhì)提取液與純?nèi)軇┲型瑵舛确治鑫锏碾x子響應(yīng)程度，通過(guò)式（1）計(jì)算二者比值以評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)。

式中：A和B分別為基質(zhì)溶液和純?nèi)軇┓治鑫锏姆迕娣e；A/B＜80%時(shí)，對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生抑制作用；A/B＞120%，對(duì)分析物的響應(yīng)產(chǎn)生增強(qiáng)作用；80%＜A/B＜120%，不存在基質(zhì)效應(yīng)。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

選取我院2017年6月～2018年2月收治的老年冠心病行介入手術(shù)患者124例作為研究對(duì)象，各62例，干預(yù)組中男35例，女27例，年齡（68～76）歲，平均（72.2±1.4）歲。對(duì)照組中男30例，女32例，年齡（66～80）歲，平均（73.5±1.5）歲。兩組在基本資料的比較上，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，無(wú)顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 取樣量對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別準(zhǔn)確稱取0.5和1 g（精確至0.01 g）的10種豆?jié){樣品和10種椰汁樣品至具塞塑料離心管，按照1.3小節(jié)進(jìn)行提取和凈化處理，按照1.6小節(jié)測(cè)定并記錄峰面積，并按照1.8小節(jié)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見表1，圖1和圖2。

圖1 取樣量對(duì)豆?jié){中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

圖2 取樣量對(duì)椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

表1 取樣量對(duì)豆?jié){、椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)分析

由圖1得到：豆?jié){樣品取樣量為1.00和0.50 g時(shí)，三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別在17.2%～18.1%和29.7%～30.8%之間，可以看出10種豆?jié){樣品中測(cè)得三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)變化比較平緩。由圖2得到：椰汁樣品取樣量為1.00和0.50 g時(shí)，三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別在11.9%～19.3%和20.5%～29.4%之間，可以看出10種椰汁樣品中測(cè)得三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)變化起伏較大。結(jié)合表1，圖1與圖2得出，取樣量對(duì)豆?jié){、椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)均存在顯著性差異。

2.2 溶劑種類對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別稱取1.00 g（精確至0.01 g）的10種豆?jié){樣品和10種椰汁樣品，每種樣品稱取4份至具塞塑料離心管，并編號(hào)為Ⅰ（豆?jié){、椰汁名稱）、Ⅱ（豆?jié){、椰汁名稱）、Ⅲ（豆?jié){、椰汁名稱）、Ⅳ（豆?jié){、椰汁名稱），在Ⅰ號(hào)加入10 mL的水，Ⅱ號(hào)加入6 mL乙腈和4 mL水，Ⅲ號(hào)加入10 mL的三氯乙酸，Ⅳ號(hào)加入8 mL三氯乙酸和2 mL乙腈，按照1.3小節(jié)提取凈化處理后，供LC-MS/MS測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。并按照1.8小節(jié)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見表2，圖3和圖4。

圖3 溶劑種類對(duì)10種豆?jié){中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

圖4 溶劑種類對(duì)10種椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

表2 溶劑種類對(duì)豆?jié){、椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)分析

由圖3得到：豆?jié){樣品分別加入4種不同溶劑，水、乙腈-水（3∶2，V/V）、三氯乙酸、三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）的三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)分別為30.3%～33.7%，24.0%～26.3%，13.7%～14.7%和15.8%～17.8%，可以看出10種豆?jié){樣品中測(cè)得三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)變化相對(duì)比較平緩，變化差異不大。由圖4得到，椰汁樣品分別加入4種不同溶劑，水、乙腈-水（3∶2，V/V）、三氯乙酸、三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）的三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)分別為28.9%～37.0%，23.6%～30.4%，10.8%～16.5%和11.8%～18.8%，可以看出10種椰汁樣品中測(cè)得三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)變化起伏相對(duì)取樣量變化較大，說(shuō)明溶劑種類對(duì)豆?jié){、椰汁的三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)影響相對(duì)較大。結(jié)合表2，圖3與圖4得出，溶劑種類除三氯乙酸與三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）對(duì)豆?jié){、椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)不存在差異，其余均存在顯著性差異。

2.3 溶劑用量對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別稱取1.00 g（精確至0.01 g）的10種豆?jié){樣品和10種椰汁樣品，每種樣品稱取3份放入具塞塑料離心管，并編號(hào)為Ⅰ（豆?jié){、椰汁名稱）、Ⅱ（豆?jié){、椰汁名稱）、Ⅲ（豆?jié){、椰汁名稱），在Ⅰ號(hào)加入4 mL三氯乙酸和1 mL乙腈，Ⅱ號(hào)加入8 mL三氯乙酸和2 mL乙腈，Ⅲ號(hào)加入12 mL三氯乙酸和3 mL乙腈，按照1.3小節(jié)提取凈化處理后，供LC-MS/MS測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。并按照1.8小節(jié)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果見表3，圖5和圖6。

圖5 溶劑用量對(duì)豆?jié){中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

圖6 溶劑用量對(duì)椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

表3 溶劑用量對(duì)豆?jié){、椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)分析

由圖5得到：豆?jié){樣品分別加入5，10和15 mL的提取液（三氯乙酸-乙腈，4∶1，V/V），三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為20.9%～24.3%，17.0%～18.1%和13.0%～14.2%，可以看出10種豆?jié){樣品中測(cè)得三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)變化比較平緩。由圖6得到：椰汁樣品分別加入5，10和15 mL的提取液（三氯乙酸-乙腈，4∶1，V/V），三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為18.1%～25.9%，12.1%～18.9%和8.9%～14.9%，可以看出10種椰汁樣品中測(cè)得三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)變化起伏相對(duì)較大。由表3，圖5與圖6結(jié)合得出，溶劑用量對(duì)豆?jié){、椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)存在顯著性差異。

2.4 三聚氰胺濃度對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別稱取1 g（精確至0.01 g）的10種豆?jié){樣品和10種椰汁樣品，每種樣品稱取3份放入具塞塑料離心管，并編號(hào)為Ⅰ（豆?jié){、椰汁名稱）、Ⅱ（豆?jié){、椰汁名稱）、Ⅲ（豆?jié){、椰汁名稱），按照1.3小節(jié)的方法提取處理。處理后，取0.1 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液水加入Ⅰ號(hào)樣液中搖勻，取0.5 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液水加入到Ⅱ號(hào)樣液中搖勻，取1.0 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液水加入到Ⅲ號(hào)樣液中，按照1.3小節(jié)的方法進(jìn)行凈化處理，供LC-MS/MS測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。并按照1.8小節(jié)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表4，圖7和圖8。

圖7 三聚氰胺濃度對(duì)豆?jié){三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

圖8 三聚氰胺濃度對(duì)椰汁三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

表4 三聚氰胺濃度對(duì)豆?jié){、椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)分析

由圖7得到：豆?jié){樣品將溶液分別稀釋配制成10，50和100 ng/mL，三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為17.1%～19.0%，15.9%～18.7%和17.6%～20.3%，可見10種豆?jié){樣品中測(cè)得三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)變化相對(duì)比較小。由圖8得到，椰汁樣品將溶液分別稀釋配制成10，50和100 ng/mL，三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為11.0%～19.0%，12.0%～19.3%和12.5%～18.2%，可得10種椰汁樣品中測(cè)得三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)變化相對(duì)較大。結(jié)合表4，圖7與圖8得出，三聚氰胺濃度對(duì)豆?jié){、椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)均不存在顯著性差異。

2.5 凈化方式對(duì)基質(zhì)效應(yīng)的影響

分別稱取1.00 g（精確至0.01 g）的10種豆?jié){樣品和10種椰汁樣品，每種樣品稱取4份至具塞塑料離心管，并編號(hào)為Ⅰ（豆?jié){、椰汁名稱）、Ⅱ（豆?jié){、椰汁名稱）、Ⅲ（豆?jié){、椰汁名稱）、Ⅳ（豆?jié){、椰汁名稱），按照1.3方法進(jìn)行提取處理后。將Ⅰ號(hào)中的凈化液進(jìn)行不過(guò)柱，Ⅱ號(hào)中的凈化液轉(zhuǎn)移固相萃取柱WCX中，Ⅲ號(hào)中的凈化液轉(zhuǎn)移固相萃取柱Cleanert PCX中，Ⅳ號(hào)中的凈化液轉(zhuǎn)移固相萃取柱Bond Elut Plexa PCX中，并且按照1.3小節(jié)的方法進(jìn)行凈化處理，供 LC-MS/MS測(cè)定并記錄數(shù)據(jù)。按照1.8小節(jié)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表5，圖9和圖10。

圖9 凈化方式對(duì)豆?jié){三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

圖10 凈化方式對(duì)椰汁三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響

表5 凈化方式對(duì)豆?jié){、椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)分析

表6 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖9得到，豆?jié){樣品將待凈化液分別進(jìn)行不過(guò)柱，過(guò)3種類型的固相萃取柱中（WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX）中洗脫，三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為8.8%～10.6%，16.9%～18.0%，15.4%～17.3%和16.1%～18.6%，可見10種豆?jié){樣品中測(cè)得三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)變化比較小，變化差異不大。由圖10得到，椰汁樣品將待凈化液分別進(jìn)行不過(guò)柱，過(guò)3種類型的固相萃取柱中（WCX、Cleanert PCX、Bond Elut Plexa PCX）中洗脫，三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)分別為5.4%～11.1%，11.3%～17.7%，10.8%～16.5%和11.8%～18.8%，可見10種椰汁樣品中測(cè)得三聚氰胺的基質(zhì)效應(yīng)變化較大。結(jié)合表5，圖9與圖10得出，凈化方式對(duì)豆?jié){、椰汁中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)不存在差異。

2.6 基質(zhì)效應(yīng)的消除

繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。分別移取不同體積的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間溶液及相同體積的三聚氰胺內(nèi)標(biāo)工作液于6個(gè)25 mL容量瓶中，用50%甲醇水逐漸稀釋并定容，得到10.00，20.00，40.00，80.00，160.00和200.00 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，每毫升三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液中含有三聚氰胺內(nèi)標(biāo)濃度20 ng/mL，在LC-MS/MS中進(jìn)樣檢測(cè)，以三聚氰胺的濃度為橫坐標(biāo)和測(cè)得并計(jì)算三聚氰胺峰面積/內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)作圖，得到標(biāo)準(zhǔn)的回歸方程曲線。

稱量9個(gè)空白樣品至9個(gè)50 mL的具塞塑料離心管中，加入相同體積的20.00 μL內(nèi)標(biāo)中間溶液，分別加入25.00，50.00和100.00 μL三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間溶液，做三水平三平行回收試驗(yàn)，按照1.3小節(jié)進(jìn)行提取和凈化處理，記錄各樣品三聚氰胺峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積，計(jì)算加標(biāo)回收率。

由表7和表8可得，隨著加標(biāo)濃度的變化，回收率均在97.18%～110.5%之間，內(nèi)標(biāo)法對(duì)三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的消除具有非常顯著的效果，徹底消除基質(zhì)效應(yīng)，達(dá)到理想效果。

表7 豆?jié){樣品加標(biāo)回收率（n=3）

表8 椰汁樣品加標(biāo)回收率（n=3）

3 結(jié)論

從取樣量、溶劑種類和用量、三聚氰胺濃度和凈化方式因素研究得出，豆?jié){中三聚氰胺基質(zhì)效應(yīng)的影響不大，但對(duì)椰汁樣品的影響較大，原因可能是選用的豆?jié){樣品是來(lái)自四川樂(lè)山當(dāng)?shù)氐亩節(jié){，采用同一種類的豆子、制作工藝和配方，因此基質(zhì)效應(yīng)相差不大。但選用的椰汁樣品來(lái)自不同廠家，采用的椰汁配方、制作工藝和椰子種類都不太相同，因此基質(zhì)效應(yīng)相差變化較大。從分析來(lái)看：三聚氰胺不同濃度、不同SPE小柱之間和溶劑三氯乙酸與三氯乙酸-乙腈（4∶1，V/V）對(duì)豆?jié){、椰汁不存在基質(zhì)效應(yīng)，其余均存在顯著的基質(zhì)效應(yīng)。內(nèi)標(biāo)法能徹底除去基質(zhì)效應(yīng)的影響。