郎亞昆 范鈺 范廷璐

肝癌是最常見的六種惡性腫瘤之一，也是全世界癌癥相關(guān)死亡的第二大原因[1]。由于其缺乏高特異性和敏感性的早期診斷生物標(biāo)志物，且轉(zhuǎn)移率高，導(dǎo)致預(yù)后欠佳[2]。所以，尋找肝癌相關(guān)的潛在生物標(biāo)志物對肝癌的診斷和治療異常重要。研究表明長鏈非編碼RNA（lncRNA）參與增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物學(xué)行為[3]。lncRNA 在如肝癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、前列腺癌等的發(fā)生中均有參與[4]。癌癥基因組圖譜（The cancer genome atlas，TCGA）數(shù)據(jù)集的生物信息學(xué)分析已被證明是一種尋找多種惡性腫瘤診斷和預(yù)后標(biāo)志物的新工具[5，6]。因此，本研究通過對TCGA 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)進(jìn)行挖掘，研究LINC02802 的表達(dá)水平在肝癌中的價值，探索LINC02802 表達(dá)水平與肝癌預(yù)后的關(guān)系，為進(jìn)一步研究肝癌的發(fā)生發(fā)展提供依據(jù)。此外，我們分析了LINC02802 的表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤的相關(guān)性，為篩選免疫治療潛在獲益人群提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集通過TCGA 數(shù)據(jù)庫收集424 例腫瘤組織和正常組織中LINC02802 表達(dá)水平，分析LINC02802 表達(dá)差異。

1.2 LINC02802 的表達(dá)與臨床病理學(xué)特征及預(yù)后相關(guān)性分析在TCGA 數(shù)據(jù)集中搜集到原始研究總樣本數(shù)為424 例，包括肝癌組織374 例，正常組織50 例，以LINC02802 表達(dá)量的中位數(shù)為界，分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，進(jìn)一步分析LINC02802 表達(dá)量與肝癌患者臨床病理特征及預(yù)后之間的關(guān)系。

1.3 LINC02802 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤相關(guān)性分析采用R 軟件“GSVA”包對TCGA 數(shù)據(jù)庫肝癌TPM數(shù)據(jù)進(jìn)行單樣本基因集富集分析（ssGSEA）[7]，得到免疫細(xì)胞類型評分，ssGSEA 免疫細(xì)胞類型的標(biāo)記基因依據(jù)Bindea 等[8]的研究，評估腫瘤中的免疫細(xì)胞浸潤水平。然后進(jìn)行Spearman 秩相關(guān)分析來檢測LINC02802 表達(dá)量與相應(yīng)免疫細(xì)胞浸潤水平之間的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法應(yīng)用R（v.3.6.3）軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用Shapiro-Wilk normality test 對數(shù)據(jù)正態(tài)性進(jìn)行檢驗，對服從正態(tài)分布的計量資料，組間比較采用t檢驗，否則應(yīng)用Mann-Whitney U 或Wilcoxon 符號秩檢驗，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗或Fisher 檢驗。用Kaplan-Meier 法行生存分析，多因素分析采用Cox 回歸模型。檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 肝癌組織和正常組織中LINC02802 的表達(dá)差異通過TCGA 分析樣本424 例，包括肝癌組織374 例，正常組織50 例。非配對分析中374 例肝癌組織中LINC02802 的表達(dá)量為0.621±0.699，50 例正常組織中LINC02802 的表達(dá)量為0.115±0.119，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）（見圖1A）。配對分析中50 例正常組織中LINC02802 的表達(dá)量為0.115±0.119，50 例肝癌組織中LINC02802 的表達(dá)量為0.406±0.329，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.001）（見圖1B）。相對于正常組織，LINC02802在肝癌組織中的表達(dá)量顯著增高。以正常組織為對照，做ROC 曲線，結(jié)果顯示AUC 為0.835，截尾值為0.165，敏感度和特異性分別為78.0%和78.3%（見圖1C）。

圖1 LINC02802 在肝癌組織及正常組織中的表達(dá)

2.2 LINC02802 的表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系將374 例肝癌患者以LINC02802 在肝癌組織中表達(dá)量的中位數(shù)為界值分為兩組，包括187 例低表達(dá)患者和187 例高表達(dá)患者。對LINC02802的表達(dá)與肝癌臨床病理特征進(jìn)行分析，結(jié)果顯示LINC02802 的表達(dá)與組織學(xué)分級、血管浸潤及甲胎蛋白水平相關(guān)（P<0.05），見表1。

表1 LINC02802表達(dá)與肝癌患者臨床病理特征的關(guān)系[n（%）]

2.3 LINC02802 對肝癌患者預(yù)后的影響Kaplan-Meier 分析顯示LINC02802 表達(dá)量與肝癌患者總生存期明顯相關(guān)，與低表達(dá)患者相比，高表達(dá)患者的總生存期差（P=0.007）（見圖2）。單因素分析顯示，肝癌患者的T分期、M 分期、TNM 分期和LINC02802 表達(dá)量與預(yù)后有關(guān)。多因素Cox 回歸分析顯示，LINC02802 表達(dá)量是肝癌患者的獨(dú)立預(yù)后影響因素，且LINC02802 高表達(dá)患者的死亡風(fēng)險是低表達(dá)患者的1.634 倍。見表2、3。

表2 肝癌患者預(yù)后單因素Cox 回歸分析

表3 肝癌患者預(yù)后多因素Cox 回歸分析

圖2 LINC02802 高、低表達(dá)肝癌患者總生存期曲線

2.4 LINC02802 表達(dá)與免疫浸潤細(xì)胞表面標(biāo)記物的相關(guān)性分析為了確定LINC02802 表達(dá)對肝癌的影響是否與腫瘤免疫細(xì)胞浸潤有關(guān)，我們基于TCGA 數(shù)據(jù)庫中424 例肝癌患者的TPM 數(shù)據(jù)，采用ssGSEA 評估了免疫細(xì)胞浸潤和LINC02802 表達(dá)量之間的關(guān)系。Spearman 相關(guān)分析顯示，LINC02802的表達(dá)與NK CD56bright 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、TFH 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T helper 細(xì)胞、aDC 細(xì)胞、iDC 細(xì)胞呈正相關(guān)（P<0.05），其中NK CD56bright 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、TFH 細(xì)胞是與LINC02802 表達(dá)呈正相關(guān)的前三種免疫細(xì)胞。LINC02802 的表達(dá)與Th17 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、Tcm 細(xì)胞、NK 細(xì)胞的浸潤呈負(fù)相關(guān)（P<0.05）。見圖3、表4。

表4 TCGA 數(shù)據(jù)庫分析LINC02802 與免疫浸潤細(xì)胞表面標(biāo)記物的相關(guān)性

圖3 LINC02802 表達(dá)與免疫細(xì)胞浸潤水平關(guān)系

3 討論

肝癌是一種死亡率很高的常見惡性腫瘤[9]。近年來，越來越多的證據(jù)表明，異常lncRNA 參與了肝癌的發(fā)生和發(fā)展[10～13]。lncRNA 是一種長度超過200 個核苷酸的非編碼RNA[14]。多項研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA 通過不同機(jī)制在調(diào)控基因表達(dá)中發(fā)揮重要作用，如染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后加工等[15～17]。因此，lncRNAs 作為新的腫瘤標(biāo)志物和治療目標(biāo)具有很大的潛力。

本研究中，我們在TCGA 數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)了腫瘤相關(guān)分子LINC02802 在包括肝癌在內(nèi)的多種腫瘤中都有不同程度的表達(dá)，然而目前關(guān)于LINC02802的研究較少。我們通過TCGA 數(shù)據(jù)庫收集了肝癌患者的臨床病理特征和LINC02802 基因表達(dá)的相關(guān)數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)在肝癌組織中LINC02802 的表達(dá)水平明顯高于正常組織（P<0.001），提示LINC02802 可能是預(yù)測和治療肝癌潛在的靶點及腫瘤標(biāo)志物。進(jìn)一步分析LINC02802 的表達(dá)與肝癌臨床病理特征關(guān)系，提示其與組織學(xué)分級、血管浸潤及甲胎蛋白水平相關(guān)（P<0.05）。通過單因素分析發(fā)現(xiàn)患者的T 分期、M 分期、TNM 分期和LINC02802 表達(dá)與肝癌患者生存相關(guān)（P<0.05）。多因素Cox 回歸分析顯示，患者的LINC02802 表達(dá)量是肝癌患者預(yù)后的獨(dú)立影響因素，LINC02802 高表達(dá)患者的死亡風(fēng)險是低表達(dá)患者的1.634 倍。

近年來，研究表明，腫瘤細(xì)胞與腫瘤微環(huán)境的相互影響在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起著關(guān)鍵作用，同時對免疫治療的療效也有重要影響[18～20]。本研究分析了LINC02802 表達(dá)量與相應(yīng)免疫細(xì)胞浸潤水平之間的關(guān)系，結(jié)果顯示，LINC02802 的表達(dá)量與NK CD56bright 細(xì)胞、Th2 細(xì)胞、TFH 細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T helper 細(xì)胞等的浸潤水平呈正相關(guān)，與Th17 細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、Tcm 細(xì)胞等的浸潤水平呈負(fù)相關(guān)。

綜上所述，LINC02802 的表達(dá)與肝癌的預(yù)后不良呈正相關(guān)，且與免疫細(xì)胞浸潤水平有關(guān)，為肝癌的診斷和預(yù)后提供新的生物標(biāo)志物，同時對免疫治療具有重要意義。雖然本研究使用生物信息學(xué)工具對LINC02802 在肝癌中的作用進(jìn)行探索，但尚存在不足，需要大量基礎(chǔ)實驗對本研究的預(yù)測結(jié)果進(jìn)行驗證并探討其作用機(jī)制。