康靖杰,李欣然,賈天柱,夏林波,尹海波,陳曉霞

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué),遼寧 大連 116600)

中藥白鮮(DictamnusdasycarpusTurcz.)是多年生草本植物蕓香科(Rutaceae)白鮮的根皮,主要分布于黑龍江、甘肅、新疆、安徽、朝鮮、蒙古和俄羅斯等[1]。漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》首次記載了這種植物適應(yīng)性強(qiáng),喜歡溫暖潮濕的環(huán)境,但不喜積水[2],通常被用作傳統(tǒng)的醫(yī)藥治療濕疹、濕熱瘡毒、風(fēng)疹、疥瘡、麻風(fēng)病、風(fēng)濕熱痹、黃疸紅尿等。傳統(tǒng)的中醫(yī)理論認(rèn)為該藥具有熱、清、濕、燥、散風(fēng)、解毒之功效,常用于治療蕁麻疹和其他疾病特應(yīng)性皮炎。到目前為止,已有200多種化合物被提取并鑒定為白鮮皮中的生物堿、糖苷類、萜類及其衍生物[3,4]。其中,白鮮堿、黃柏酮和梣酮是白鮮皮的主要成分?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,白鮮堿具有抗真菌、強(qiáng)心、松弛血管、抗血小板聚集、抗皮膚光損害、抗癌等作用;梣酮具有抑菌、殺蟲(chóng)、保肝降酶、抑制肝纖維化等生物活性;黃柏酮具有降血糖、抗癌等活性作用[5]。

相惡是中藥七情配伍的重要組成部分,其內(nèi)涵在歷代本草中不盡相同。在歷代古本草醫(yī)籍中多從兩方面定義相惡:一種是藥物本身受到其他藥物制約;另一種是可制約其他藥物毒副作用[6]。作為中藥七情配伍之一,相惡最早見(jiàn)于漢代《神農(nóng)本草經(jīng)》:“勿用相反相惡者?！北M管相惡被視作配伍禁忌,然而歷代醫(yī)家使用相惡藥對(duì)同用的方劑卻不鮮見(jiàn)[7]。古籍《新修本草》和《名醫(yī)別錄》中均記載有白鮮惡桑螵蛸、茯苓、桔梗、萆薢,其相惡的原理以及是否在配伍過(guò)程中影響白鮮皮主要化學(xué)成分含量,值得研究。因此,本實(shí)驗(yàn)采用HPLC法對(duì)白鮮分別與桑螵蛸、茯苓、桔梗、萆薢配伍后白鮮中三種主要化學(xué)成分白鮮堿、黃柏酮和梣酮的含量進(jìn)行測(cè)定,并通過(guò)改變不同配伍比例探討與白鮮皮相惡的四種藥物對(duì)白鮮皮三種成分含量的影響規(guī)律,為揭示白鮮皮相惡原理提供實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 白鮮皮購(gòu)于康美藥業(yè)股份有限公司,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定為四年生蕓香科植物白鮮的根皮;桑螵蛸(產(chǎn)地:山東)、茯苓(產(chǎn)地:湖北)、桔梗(產(chǎn)地:河北)、萆薢(產(chǎn)地:亳州)均購(gòu)于遼寧省大連市海王星辰健康大藥房,經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室李峰教授鑒定均為正品。白鮮堿對(duì)照品(純度≥98 %,江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司,批號(hào):YJ0102);黃柏酮(純度≥98%,中國(guó)食品藥品鑒定研究院,批號(hào):111923-20160);梣酮對(duì)照品(純度均≥98%,中國(guó)食品藥品鑒定研究院,批號(hào):111700-201603);甲醇(色譜純,天津科密歐有限公司)。

1.1.2 儀器 高效液相色譜儀(安捷倫公司,美國(guó),型號(hào):1260 Agilent型);十萬(wàn)分之一電子天平(島津公司,日本,型號(hào):AUW220D型);電熱恒溫水浴鍋(上海赫田科學(xué)儀器有限公司,型號(hào):HH-M4型);小型粉碎機(jī)(溫州頂力醫(yī)療器械有限公司,型號(hào):DFT-300型);超聲清洗機(jī)(昆山市超聲儀器有限公司,型號(hào):KQ5200DE型);電熱鼓風(fēng)干燥箱(天津泰斯特儀器有限公司,型號(hào):101-2A型)。

1.2 方法

1.2.1 白鮮皮單煎膏制備 稱取白鮮皮5.00g,加入12倍量的水煎煮1h;然后再加入10倍量的水煎煮1h,趁熱抽濾,蒸干;烘箱烘干成浸膏,計(jì)算浸膏率。

1.2.2 白鮮皮合煎膏制備 稱取白鮮皮5.00g,分別加入不同量的桑螵蛸、茯苓、桔梗或萆薢,配制成1∶1、1∶2、1∶3、1∶4的藥對(duì),按照單煎膏方法制備,計(jì)算浸膏率。

1.2.3 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取白鮮堿、黃柏酮和梣酮對(duì)照品9.30、10.15、10.66mg,加甲醇依次定容至25、10、10mL容量瓶中,然后精密移取白鮮堿、黃柏酮和梣酮對(duì)照品溶液各0.75、1.25、0.5mL混合均勻,配制為混合對(duì)照品母液,低溫、避光保存。

1.2.4 供試品溶液的制備 依據(jù)單煎、合煎藥材所得浸膏率折合含白鮮皮生藥量為1.00g,稱取浸膏溶于25 mL無(wú)水甲醇中,濾過(guò);13 000r離心10min,取上清,0.45μm微孔濾膜濾過(guò),得白鮮皮單煎及不同配比合煎液供試品溶液,置冰箱4℃冷藏保存。

1.2.5 色譜條件 色譜柱為C18;流動(dòng)相為甲醇(A):水(B)(55∶45),流速為1.0mL/min;柱溫為40℃;進(jìn)樣量為10μL;檢測(cè)波長(zhǎng)為236nm;理論塔板數(shù)應(yīng)≥5 000。

1.2.6 含量測(cè)定 取白鮮皮單煎樣品及不同配比(1∶1、1∶2、1∶3、1∶4)合煎樣品,按“1.4”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣,雙樣雙針,每份樣品測(cè)定2次,記錄峰面積,計(jì)算白鮮皮中白鮮堿、黃柏酮和梣酮的含量及RSD值。

2 結(jié)果

2.1 方法學(xué)考察

2.1.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密移取一定量白鮮堿、黃柏酮和梣酮對(duì)照品儲(chǔ)備液混合均勻,將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋2、4、10、20、40、100、200、400、1 000倍,取各混合對(duì)照品10μL按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件注入高效液相色譜中。以對(duì)照品溶液測(cè)得的峰面積為縱坐標(biāo)(y),濃度為橫坐標(biāo)(x),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算回歸方程。其線性考察結(jié)果,見(jiàn)表1。

表1 白鮮堿、黃柏酮和梣酮的線性方程線性范圍和相關(guān)系數(shù)

1.白鮮城 2.黃柏酮 3.梣酮

表2 白鮮堿、黃柏酮和梣酮的加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液10μL,按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積。結(jié)果白鮮堿、黃柏酮、梣酮的色譜峰峰面積RSD值分別為2.39%、2.98%、2.57%,表明儀器精密度良好。

2.1.3 穩(wěn)定性考察 取白鮮皮-茯苓(1∶1)供試品溶液,分別于 0、2、4、6、8、10、12、24、48h 按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,進(jìn)樣量為10μL,記錄峰面積并計(jì)算RSD。48h 內(nèi)白鮮堿、黃柏酮、梣酮色譜峰面積的RSD值依次為2.43%、3.21%、2.66%,表明供試品溶液在48h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4 重復(fù)性考察 取同一批藥材樣品白鮮皮-茯苓(1∶1),稱取6份,每份約1.0g,按“1.2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液,在“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣10μL,進(jìn)行測(cè)定,記錄白鮮堿、黃柏酮和梣酮峰面積的RSD值為1.43%、3.36%、1.03%,表明該方法重復(fù)性良好。

1.白鮮城 2.黃柏酮 3.梣酮

2.1.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取白鮮皮-茯苓(1∶1)粉末6份,分別精密加入白鮮堿、黃柏酮和梣酮混合對(duì)照品溶液5、1、1mL,按供試品溶液方法制備,按“1.2.5”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,計(jì)算回收率及RSD,結(jié)果見(jiàn)表 2。白鮮堿、黃柏酮、梣酮3個(gè)成分的平均加樣回收率及RSD均符合相關(guān)規(guī)定。

2.2 白鮮皮相惡藥對(duì)含量測(cè)定分析

白鮮皮單煎與合煎各組分成分溶出度測(cè)定結(jié)果比較:白鮮皮與萆薢或桑螵蛸合煎液中白鮮堿、黃柏酮、梣酮成分比單煎液中的含量明顯降低,但萆薢合煎液成分含量較后者更低;白鮮皮與茯苓或桔梗合煎液中,此3個(gè)成分含量較單煎液高?？芍柞r皮-萆薢或桑螵蛸配伍時(shí)降低了這3種成分總量的溶出;而與茯苓或桔梗配伍后較有利于成分的溶出。

在不同配伍配比的白鮮皮相惡藥對(duì)中,隨著白鮮皮-茯苓配伍比例的增加,白鮮堿、黃柏酮的含量隨之增多,梣酮的含量隨著茯苓比例的增加而減少;隨著白鮮堿-桔?；蜉伤Z配伍比例的增加,3種成分含量趨向于被抑制,但白鮮皮-桔梗不同配比對(duì)梣酮含量的影響并未表現(xiàn)出明顯的規(guī)律性;白鮮皮-桑螵蛸的不同配伍比例對(duì)白鮮堿、黃柏酮、梣酮含量影響較小。另外,白鮮皮-桑螵蛸藥對(duì)配伍比例為1∶1時(shí),3種成分含量最高。結(jié)果見(jiàn)表3和圖3。

注:a.白鮮堿;b.黃柏酮;c.梣酮。

表3 樣品的含量測(cè)定結(jié)果

2.3 討論

經(jīng)典的煎煮工藝多為水煎劑,提取的藥用成分也多為水溶性成分?；诖?采用水煎煮的方法來(lái)制備供試溶液,使其能最大程度地反映藥對(duì)的物質(zhì)基礎(chǔ)[8]。在多組分含量測(cè)定中,還考察了不同溶劑(50%甲醇、無(wú)水甲醇、水等)對(duì)白鮮皮相惡藥對(duì)含量的影響。結(jié)果表明,以水作為溶劑時(shí),藥物中白鮮堿的峰面積明顯減小,黃柏酮與梣酮幾乎沒(méi)有峰;當(dāng)50%甲醇作為溶媒時(shí),黃柏酮、梣酮在藥對(duì)中的峰面積增加。因?yàn)榘柞r皮的化學(xué)成分大多不溶于水,是含有揮發(fā)油、檸檬苦素、黃酮類等易溶于有機(jī)溶劑的成分;隨著化學(xué)成分在白鮮皮中的溶出度降低,也間接影響其他藥物化學(xué)成分的溶出度。因此,無(wú)水甲醇最終被用作本研究的溶媒。為了更好地分離出白鮮皮相惡藥對(duì)中三種主要成分含量,建立了同時(shí)測(cè)定白鮮皮相惡藥對(duì)中三種成分含量的分析方法。該方法操作簡(jiǎn)便、特異性好、結(jié)果準(zhǔn)確可靠,為白鮮皮相惡藥對(duì)的多指標(biāo)成分綜合評(píng)價(jià)提供了一種分析方法。結(jié)合配伍前后各組分含量的變化,可為白鮮皮藥對(duì)的臨床配伍和研究提供科學(xué)依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)顯示不同配伍比例的白鮮皮相惡藥對(duì)對(duì)白鮮皮中化學(xué)成分含量會(huì)產(chǎn)生影響。據(jù)文獻(xiàn)研究表明,茯苓作為多孔菌科真菌茯苓Poriacocos(Schw.)Wolf 的干燥菌核,主要含有三萜類、多糖類、二萜類、甾醇類等成分[9]。桔梗有止咳平喘、抗炎抑菌、抗腫瘤、降血糖、抗氧化、保肝等作用;在桔梗中發(fā)現(xiàn)的化學(xué)成分有三萜皂苷類、黃酮類、無(wú)機(jī)元素等成分[10]。據(jù)報(bào)道,黃柏酮、梣酮作為檸檬苦素類化合物在植物體內(nèi)主要通過(guò)三萜類化合物合成的,其前體化合物一般認(rèn)為是大戟烷型或甘遂烷型[11]。作為蕓香科植物的主要特征化學(xué)成分,根據(jù)其合成途徑推測(cè),隨著茯苓或桔梗的加入,白鮮皮與其三萜類成分經(jīng)過(guò)A 環(huán)開(kāi)裂、D環(huán)再氧化開(kāi)裂形成黃柏酮,通過(guò)成醚或成酯反應(yīng),A環(huán)和B環(huán)降解,D環(huán)開(kāi)裂形成內(nèi)酯生成降解型檸檬苦素類化合物梣酮;從而使其含量在各自組別中有所增加。萆薢作為一種常用中藥,含有甾體、二芳基庚烷、木脂素類、有機(jī)酸等多種化學(xué)成分,具有抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、抗真菌、抗心肌缺血、降尿酸、調(diào)血脂等作用[12]。白鮮皮與萆薢配伍后,可使白鮮堿含量降低,這可能與萆薢中有機(jī)酸與白鮮皮中的生物堿成分發(fā)生反應(yīng)有關(guān)。而桑螵蛸除主要含有蛋白質(zhì)、脂肪和糖類化合物外,還有其他一些有效成分[13],至于是何者產(chǎn)生相惡作用,相關(guān)報(bào)道太少,還需進(jìn)一步探究。

3 結(jié)語(yǔ)

本研究建立HPLC法同時(shí)測(cè)定白鮮堿、黃柏酮和梣酮的含量,僅從成分含量的角度考察了不同配伍比例白鮮皮四組相惡藥對(duì)(桑螵蛸;茯苓;桔梗;萆薢)對(duì)白鮮皮中3種主要成分含量的影響,對(duì)其藥對(duì)化學(xué)成分變化并未考察,后續(xù)還需從藥效學(xué)等多個(gè)方面進(jìn)一步研究,旨在為白鮮皮相惡藥對(duì)的研究提供更詳實(shí)的數(shù)據(jù)支持。