劉寶峰，盧甜甜

（孝感市婦幼保健院1.檢驗科2.兒童康復(fù)科，湖北 孝感 432100）

苯丙酮尿癥是一種最為常見的遺傳代謝性疾病，以血苯丙氨酸濃度升高為主要臨床特征，主要由苯丙氨酸代謝途徑中的酶缺陷引起，所缺陷的酶包括苯丙氨酸羥化酶或其輔酶四氫生物蝶呤[1]。苯丙酮尿癥常表現(xiàn)為常染色體單基因隱性遺傳，是臨床最為常見的一種氨基酸代謝病。苯丙酮尿癥患兒可出現(xiàn)頭發(fā)由黑變黃、皮膚顏色變淺、體液（尿液、汗液）有鼠臭味等表現(xiàn)。患兒年齡增大后會逐漸出現(xiàn)智力發(fā)育落后，且年齡與其程度成正比[2]。苯丙酮尿癥新生兒出生后，相較于健康新生兒不存在明顯差異，部分患兒僅會出現(xiàn)喂養(yǎng)困難、睡眠不安，難以將其病情與苯丙酮尿癥相聯(lián)系。加強對新生兒苯丙酮尿癥的篩查具有重要的臨床意義[3]。串聯(lián)質(zhì)譜法是一種靈敏度、特異度均較高的檢測方法。早在20 世紀(jì)90 年代，就有研究者將串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于新生兒遺傳疾病的篩查中。串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用期間，對于多種目標(biāo)化合物的檢測可同時進(jìn)行，可在提高多種遺傳代謝性疾病檢出率的同時，降低假陰性檢出率、假陽性檢出率，從而提高檢查結(jié)果的準(zhǔn)確性，保障患兒及時接受治療，避免其出現(xiàn)較為嚴(yán)重的后遺癥[4]?；诖耍狙芯恐饕治龃?lián)質(zhì)譜法檢測苯丙氨酸（Phe）和酪氨酸（Tyr）在新生兒苯丙酮尿癥診斷中的應(yīng)用效果。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本研究對象為2016 年至2021 年期間于孝感市婦幼保健院行苯丙酮尿癥篩查的新生兒218 420 例，其中有初篩陽性新生兒1352 例。另選取同期于該地區(qū)出生的500 例健康新生兒作為對照。500 例健康新生兒中有男性新生兒215 例，女性新生兒285例，占比分別為43.00%、57.00% ；日齡3 ～7 d，平均日齡（4.32±0.12）d。1352 例初篩陽性新生兒中有男性新生兒668 例，女性新生兒684 例，占比分別為49.41%、50.59% ；日齡4 ～7 d，平均日齡（5.21±0.08）d。兩組的以上資料相比，P＞0.05。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

采用干濾紙血片檢測500 例健康新生兒的Phe、Tyr 濃度后，確定檢測指標(biāo)線性范圍。陽性檢測值：Phe ＞120 mol/L，Phe/Tyr ≥3.5。若 新 生 兒 檢 測結(jié)果達(dá)到陽性標(biāo)準(zhǔn)，則給予復(fù)查，結(jié)果若仍表現(xiàn)為Phe ＞120 mol/L，Phe/Tyr ≥3.5，可診斷為新生兒苯丙酮尿癥陽性[5]。

1.3 研究方法

根據(jù)檢測后健康新生兒的Phe 和 Tyr 濃度確定Phe 和 Tyr 的線性范圍，方法：在健康新生兒足跟處采集血樣，收集血樣采用專用濾紙，將此濾紙放到常溫下自然風(fēng)干，置于收集袋中。將收集袋置于-20 攝氏度溫度下保存。在7 d 內(nèi)采用串聯(lián)質(zhì)譜法實施檢測，方法：取用采血濾紙制成的圓形濾紙（直徑3 mm），將其置于96 孔板中。取甲醇溶液，應(yīng)用Phe 和 Tyr同位素標(biāo)記后加入至孔板中。密封后室溫下離心處理，離心機轉(zhuǎn)速：700 r/min，離心處理時間45 min。靜置0.5 h 后，取80 μL 置于另一個96 孔板中檢測。檢測儀器應(yīng)用美國 WATERS 公司生產(chǎn)的串聯(lián)質(zhì)譜儀及相關(guān)試劑盒，Phe標(biāo)準(zhǔn)品、Tyr 標(biāo)準(zhǔn)品及相應(yīng)質(zhì)控品購于美國 PE 公司。檢測期間儀器參數(shù)設(shè)置：進(jìn)樣量每次20 μL，檢測模式：多反應(yīng)模式，每次檢測時間3 min[6]。

1.4 觀察指標(biāo)

（1）計算Phe、Tyr 線性范圍、濃度平均回收率、變異系數(shù)（CV）。（2）計算苯丙酮尿癥陽性新生兒的Phe、Tyr 水平和Phe/Tyr。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

本研究采用SPSS 25.0 版軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用ChemoView 1.0 軟件進(jìn)行定量分析，以±s表示計量資料。經(jīng)正態(tài)性檢驗與方差齊性檢驗后，正態(tài)分布且方差呈齊性的計量資料，兩組間比較行LSD-t檢驗，組內(nèi)比較行單樣本t檢驗，偏態(tài)分布的數(shù)據(jù)用秩和檢驗；以n(%) 表示計數(shù)資料，行χ2 或Fisher檢驗；P＜0.05 表示數(shù)據(jù)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Phe 和Tyr 線性范圍、回收率及CV

線 性 范 圍：Phe 為（26.32 ～891.12）mol/L，Tyr 為（38.96 ～265.22）mol/L。濃度平均回收率：Phe 為98.0%，Tyr 為97.3%。批內(nèi) CV：Phe 為3.9%，Tyr 為4.1%。批 間 CV ：Phe 為4.6%，Tyr 為5.7%。見表1。

表1 Phe 和 Tyr 線性范圍、回收率及 CV

2.2 經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜法檢測結(jié)果

經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜法檢測發(fā)現(xiàn)，1352 例初篩陽性新生兒中有陽性患兒14 例，其Phe、Tyr 水平、Phe/Tyr 見表2。

表2 苯丙酮尿癥陽性新生兒的Phe、Tyr 水平及Phe/Tyr

3 討論

苯丙酮尿癥是遺傳代謝性疾病的常見類型。據(jù)調(diào)查，在全球范圍內(nèi)，苯丙酮尿癥的發(fā)病率約1/1.5 萬[7]。此病屬于常染色體隱性遺傳疾病[8]。此病患兒的肝臟中缺乏Phe 羥化酶，使其血液中Phe 及代謝產(chǎn)物的濃度明顯高于健康新生兒。這能夠引發(fā)腦神經(jīng)損傷，使患兒在智力發(fā)育方面與同齡兒童相比明顯落后[9]。加強新生兒苯丙酮尿癥的篩查具有重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，檢測新生兒血液中Phe 的含量對篩查苯丙酮尿癥具有重要臨床意義，可指導(dǎo)診斷及治療[10]。目前，臨床上常用的相關(guān)檢測方法包括比色法、熒光法、高效液相色譜法、串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中，以串聯(lián)質(zhì)譜法最為常用。相較于其他檢測方法，將串聯(lián)質(zhì)譜法應(yīng)用于新生兒苯丙酮尿癥診斷中，假陽性率、假陰性率均可明顯降低，檢測耗時短，無需重復(fù)、大量采血[11]。新生兒苯丙酮尿癥確診后，應(yīng)及時采取有效治療措施，目的在于降低患兒血液Phe 濃度，避免其神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育受到嚴(yán)重影響[12]。采取的治療措施主要包括營養(yǎng)治療、藥物治療、基因治療、肝細(xì)胞抑制治療。研究顯示，可通過調(diào)節(jié)飲食控制苯丙酮尿癥病情的發(fā)展[13]。過去，臨床上常采用營養(yǎng)療法對苯丙酮尿癥患兒進(jìn)行治療（主要采用限制飲食中Phe 攝入量的方法）。有研究指出，對苯丙酮尿癥患兒進(jìn)行飲食治療，會加重患兒家庭的負(fù)擔(dān)，且治療依從性無法保證，因此臨床上多改用藥物療法治療此病。在新生兒苯丙酮尿癥藥物治療中，使用的藥物主要為沙丙蝶呤[14]。沙丙蝶呤是Phe 輔酶四氫生物蝶呤的藥物形式。其藥理作用在于提高Phe 羥化酶缺乏患兒體內(nèi)Phe 羥化酶的活性。研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用沙丙蝶呤治療苯丙酮尿癥可降低患兒血液中Phe 的濃度[15]。據(jù)調(diào)查，有1/4 ～1/2 的苯丙酮尿癥患兒（缺乏Phe 羥化酶）經(jīng)沙丙蝶呤治療后效果理想[16]。另有部分患兒在服藥期間即使攝取正常食物，其血液Phe 濃度的控制效果仍較為理想。在進(jìn)行上述治療的同時，為了解決患兒營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的問題，應(yīng)及時給予營養(yǎng)素補充治療，其中包括糖巨肽、中性氨基酸。前者是一種乳酪乳清蛋白，Phe 含量低，補充可滿足身體所需。有研究指出，為苯丙酮尿癥患者補充糖巨肽，既可以減少腸道有害菌數(shù)量，還可以使短鏈脂肪酸含量增加，且不會對腎功能造成影響。研究發(fā)現(xiàn)，在苯丙酮尿癥的遠(yuǎn)期并發(fā)癥中，骨脆性增加較為常見。經(jīng)補充糖巨肽的苯丙酮尿癥患者骨脆性增加的發(fā)生風(fēng)險明顯降低[17]。中性氨基酸是一種復(fù)合物，包含多種人體所需氨基酸。為苯丙酮尿癥患者補充中性氨基酸可降低其血液中Phe 的含量，且不會增加其腦內(nèi)Phe 的含量，從而可避免其腦功能受損[18]。本研究的結(jié)果顯示，Phe 和 Tyr 的線性范圍、回收率及CV 如下：線性范圍：Phe 為（26.32 ～891.12）mol/L，Tyr 為（38.96 ～265.22）mol/L。濃度平均回收率：Phe 為98.0%，Tyr 為97.3%。批內(nèi) CV：Phe 為3.9%，Tyr 為4.1%。批間 CV：Phe 為4.6%，Tyr 為5.7%。經(jīng)串聯(lián)質(zhì)譜法檢測發(fā)現(xiàn)，1352 例初篩陽性新生兒中有陽性患兒14 例，其Phe 水平為431.28 ～621.05 mol/L，Tyr 水平為86.35 ～156.31 mol/L，Phe/Tyr 為3.9 ～5.9（均＞3.5）。這充分證實，新生兒苯丙酮尿癥診斷中應(yīng)用串聯(lián)質(zhì)譜法檢測Phe、Tyr 濃度，具有線性范圍寬、濃度回收率高的優(yōu)勢，臨床應(yīng)用價值較高。