楊 洋 艾 群 胡旭陽 石露露 胡 欣△

人類醫(yī)療水平及疾病防控認知盡管已有了極大提升,但惡性腫瘤依舊是世界范圍內(nèi)高發(fā)病率和高病死率的重要因素。長期以來,化療在惡性腫瘤西醫(yī)的治療中發(fā)揮著核心作用[1]。但化療在提高癌癥患者生存期的同時,帶來的不良反應對患者的生理、心理都存在著短暫或長久的影響。其中,由于骨髓對化療高度敏感,骨髓抑制也就成了化療中一個不可忽視的問題。化療后骨髓抑制以白細胞減少最為明顯和常見,可導致化療藥物減量、化療延遲甚至終止,最終影響化療效果和預后;也可能增加患者感染的風險,而并發(fā)感染會導致額外醫(yī)療,甚至造成患者死亡。

rhG-CSF類藥物的治療效果較好,但因其使用受限于醫(yī)保政策,并且藥價較昂貴,很大程度上限制了臨床應用[2]。該藥物維持時間短,并且在化療過程中,可能導致患者發(fā)生發(fā)熱或骨骼疼痛等不良反應,甚至使骨髓抑制程度加重[3]。面對這些問題,中醫(yī)藥作為中國的特色治療手段,在防治化療后白細胞減少方面被證實確臨床療效顯著且穩(wěn)定[4]。胡欣主任倡導零毒抗腫瘤,個體化治療的理念,在減少腫瘤治療的不良反應,充分發(fā)揮中醫(yī)藥抗腫瘤優(yōu)勢。從而以健脾益腎,補氣養(yǎng)血為理論基礎,自擬升白經(jīng)驗方:黃芪30 g,黨參15 g,茯苓15 g,知母15 g,骨碎補30 g,補骨脂30 g。具有旺生血之源、直補氣血的作用,能較好地升高人體白細胞。但該方的藥效機制尚不明確,因此借助網(wǎng)絡藥理學[5], 通過多分子藥物協(xié)同作用于人體的機制,系統(tǒng)綜合地觀察升白方防治化療后白細胞減少這一疾病網(wǎng)絡的作用靶點及通路,為臨床應用及日后的基礎研究奠定了一定的理論來源。

1 資料與方法

1.1 篩選活性成分和預測靶點選用TCMSP平臺[6],分別以黃芪、茯苓、黨參、知母、骨碎補、補骨脂為關鍵詞進行檢索以獲取相關化合物信息,篩選條件為OB≥30%、DL≥0.18[7]。并依據(jù)已報道的文獻,整理出各味中藥未檢索到的有效成分進行補充。通過Uniprot數(shù)據(jù)庫并利用VLOOKUP函數(shù),將篩選出的靶點轉(zhuǎn)換為對應的基因名。

1.2 構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡依據(jù)六味中藥及篩選出的相關活性成分和靶點,制作相應的“Network”及“Type”Excel文件,并依次錄入Cytoscape 3.7.0軟件[8]進行網(wǎng)絡的構(gòu)建,以便于研究活性成分與靶點及其之間的關系。

1.3 白細胞減少癥靶點檢索Genecards疾病基因數(shù)據(jù)庫[9]中以“Neutropenia”“Leukopenia”“Leucopenia”“Leukocytopenia”為檢索關鍵詞進行篩選,將各結(jié)果匯總后刪去重復靶點,并通過Uniprot對獲取的靶點進行標準化轉(zhuǎn)換。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(PPI)構(gòu)建及核心靶點獲取在Cytoscape 3.7.0的插件BisoGenet內(nèi),先后導入升白方活性成分靶點和白細胞減少癥靶點,共生成2個PPI網(wǎng)絡,通過提取生成1個交集網(wǎng)絡,對該網(wǎng)絡進行CytoNCA[10]分析,篩選計算所得到的結(jié)果后得到核心靶點。

1.5 通路富集分析將篩選得到的核心靶點輸入Metascape平臺[11],分別采取GO及KEGG分析,在保存對應結(jié)果后,通過Bioinformatics在線網(wǎng)站對結(jié)果進行可視化分析。

1.6 分子對接操作選擇升白方中活性成分排名的前3個與核心靶點進行分子對接實驗,驗證2者間的結(jié)合潛力。在RCSB[12]數(shù)據(jù)庫中保存靶點蛋白的三維晶體并在TCMSP中下載活性成分化學結(jié)構(gòu),運用Autodock[13]進行分子對接實驗操作。其中的對接分數(shù)<-4.25 kcal/mol被認為化合物與目標靶點間有結(jié)合活性;<-5.0 kcal/mol表明2者相互作用良好;<-7.0 kcal/mol表示結(jié)合活性強烈[14]。

2 結(jié)果

2.1 獲取升白方活性成分及靶點在TCMSP數(shù)據(jù)庫中,獲取升白方89個主要活性成分、207個相應靶點;根據(jù)查詢到的文獻對補骨脂進行補充,獲得18個有效成分,174個靶點。將方中六味中藥合并后,刪除重復以及未找到對應靶點的成分,共篩選得到有效成分70個。匯總靶點并剔除重復項,共獲得278個。

2.2 構(gòu)建活性成分-靶點網(wǎng)絡進行升白方活性成分及其對應靶點的關系網(wǎng)絡繪制,并對所得的網(wǎng)絡圖形加以說明,存在節(jié)點356個和關系1314條,Degree排名前3位有效成分分別是山奈酚、槲皮素和木犀草素。見圖1。

圖1 活性成分-靶點網(wǎng)絡圖

2.3 疾病靶點檢索檢索Genecards疾病數(shù)據(jù)庫,經(jīng)篩選、去除重復值后得到疾病相關靶點589個。分別將藥物與疾病靶點上傳至Excel表格,利用“開始”菜單中的“格式條件”選項獲取2列靶點的重復值,從而獲知藥物與疾病交集靶點為49個。

2.4 PPI構(gòu)建及核心靶點獲取采用Cytoscape軟件分別構(gòu)建藥物與疾病的PPI網(wǎng)絡,對其構(gòu)建的結(jié)果加以說明:7363個靶點可與升白方中潛在靶點產(chǎn)生間接或直接作用,可達175250種相互關系;有7830個靶點可與白細胞減少癥產(chǎn)生間接或者直接的作用,可達185467種相互聯(lián)系。隨后構(gòu)建二者PPI網(wǎng)絡的交集,并計算交集PPI網(wǎng)絡拓撲學屬性值,分別以“連接度中心性>66”“連接度中心性>136、介度中心性>555.328、緊密度中心性>0.501”為條件,進行2次篩選,共獲得209個核心靶點。

2.5 通路富集分析可視化將上述209個核心靶點錄入Metascape平臺,進行基因富集分析,選擇前20條結(jié)果進行可視化處理。使用Bioinformatics在線網(wǎng)站將生物過程(BP)、細胞組成(CC)、分子功能(MF)的結(jié)果以及KEGG通路的結(jié)果繪制成圖。見圖2、圖3。

2.6 分子對接將排名前3的潛在有效成分分別與5個核心靶點MCM2、TP53、CUL3、FN1、ESR1進行對接,得到15組配體與受體互作結(jié)果(見圖4)。研究顯示對接分數(shù)均小于4.25 kcal·mol,這表明升白方的化合物與目標靶點間均具有結(jié)合活性。其中FN1-木犀草素、TP53-木犀草素、TP53-山奈酚對接分值小于7.0 kcal·mol,提示其具有強烈結(jié)合能力。分子對接結(jié)果為升白方活性成分通過調(diào)節(jié)核心靶點以防治化療后白細胞減少提供了證據(jù),也為今后臨床用藥指導及進一步實驗驗證的設計提供了數(shù)據(jù)支持。

圖2 GO富集分析通路

圖3 KEGG富集分析通路

3 討論

化療藥物屬于大毒之品,其剛猛的藥性不僅會耗傷體內(nèi)氣血,還會擾亂陰陽平衡[15]造成五臟功能失調(diào)。依據(jù)化療后所表現(xiàn)的癥狀,屬中醫(yī)學“血虛、虛勞”等病證范疇?！捌榘俸≈?腎為性命之根”,在虛勞的治療中脾、腎尤為重要,因此防治化療后白細胞減少也當以調(diào)理脾、腎為先。升白方可補氣養(yǎng)血、健脾益腎,使受化療藥物所抑制的骨髓精血復生。借助網(wǎng)絡藥理學的方法,探討其發(fā)揮升白作用的潛在機制,并運用分子對接驗證核心靶點與活性成分的作用關系,發(fā)現(xiàn)具有良好的活性結(jié)合能力,也側(cè)面驗證了預測結(jié)果有一定可靠性。

排名第一的有效成分是山奈酚,存在于骨碎補、知母和黃芪中。該成分具有多種藥理活性,包括抗腫瘤、抗癌活性、抗炎、抗氧化等,目前正被應用于癌癥化療中[16]。該成分既可以誘導細胞凋亡,使細胞周期停滯在G2/M期,從而阻止細胞遷移和侵襲,又可以激活宿主的免疫功能,抑制腫瘤血管生長,增加其他抗癌藥物的敏感性[16,17]。槲皮素可以通過調(diào)節(jié)PI3K/AKT途徑來調(diào)控依賴EPO的紅細胞發(fā)育早期階段。故推測槲皮素在造血過程中發(fā)揮了作用,如白細胞的形成[18]。木犀草素在雌激素受體拮抗劑ICI182,780和ER陰性的人乳腺癌細胞株MDA-MB-453存在的情況下,可以減輕阿霉素誘導的細胞毒性[19]。間接對白細胞減少起到了防治的作用。

經(jīng)篩選獲得209個潛在核心靶點,其中較為重要的有MCM2、TP53、CUL3、FN1、ESR1。MCM2具有促凋亡作用。MDS骨髓中MCM2比例較高,且與白細胞減少程度相關[20]。TP53是細胞應激反應和造血干細胞穩(wěn)態(tài)的中樞調(diào)節(jié)因子[21]。而50%的癌癥病例攜帶P53突變,另一半通常存在P53途徑缺陷[22],因此通過激活P53阻斷IL-1途徑,可成功地緩解化療導致的中性粒細胞減少癥[23]。FN是細胞外基質(zhì)中重要的黏附分子,參與造血細胞的分化和增殖[24]。ESR1是雌激素的受體之一,參與了造血、骨骼以及免疫系統(tǒng)的表達[25]。研究表示,ESR1可調(diào)節(jié)先天免疫信號通路和免疫細胞的發(fā)育[26]。綜上所述,升白方通過多靶點對化療后白細胞減少起到防治作用。

升白方防治化療后白細胞減少涉及調(diào)節(jié)細胞對應激的反應、細胞周期過程的調(diào)節(jié)、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)分解代謝過程等多個生物進程。例如 mTORC1整合了細胞內(nèi)和細胞外主要的信號通路,其中包括細胞應激反應。這種信號整合可以很好地調(diào)控合成代謝、分解代謝過程,調(diào)節(jié)細胞生長和體內(nèi)平衡[27]。但在癌癥中mTORC1介導的信號傳導常常發(fā)生失調(diào)[28]。由此可推測,升白方通過對細胞應激反應的調(diào)節(jié)有可能通過糾正信號傳導,從而促進化療后白細胞的修復和生成。

從KEGG的結(jié)果得知,升白方可能通過干預病毒致癌、癌癥中的微核糖核酸、細胞周期、剪接體、HIF-1信號通路等。升白方可能通過干預病毒致癌通路受益于癌細胞的衰老,輔助抗癌,對化療起到減毒增效的作用。剪接體對前體mRNA成熟和基因表達至關重要[29]。在造血干細胞形成過程中,精心控制的RNA剪接決定了細胞的命運[30]。剪接體的成分耗盡與DNA損傷和細胞周期缺陷的增加有關,而核心剪接體成分的部分消耗導致細胞周期后期階段的缺陷(G2和有絲分裂),完全耗盡則會導致G1的早期細胞周期停滯[31]。因此,細胞周期停滯可由于剪接體和細胞周期通路的破壞所致。細胞周期涉及許多生命過程,與真核細胞的生長和增殖以及疾病的發(fā)生密切相關[32]。故推斷可能通過干預上述2條通路,升白方對白細胞中的前體mRNA起到了調(diào)控作用。成骨細胞是骨骼造血微環(huán)境的重要組成部分,HIF信號通路對造血干細胞(HSC)的維持至關重要,有研究證明了成骨細胞中HIF信號通路傳導的分子作用可以靶向地升高局部造血微環(huán)境中的HSC[33]。因此,升白方能通過干預HIF信號通路恢復HSC的功能增加白細胞數(shù)量。

綜上所述,升白方主要通過70個活性成分作用于209個核心靶點,涉及147條關鍵通路來發(fā)揮作用,印證了升白方根據(jù)多靶點、多通路防治化療后白細胞減少的特征。后續(xù)將著力設計完善的實驗,進一步驗證其具體作用機制及靶點。