龐文娟，張生杰，田志梅

（武威市藥品檢驗檢測中心，甘肅 武威 733000）

板藍(lán)根飲片是一種具有廣譜抗病毒活性的中藥[1]，在我國已有上千年的用藥歷史。其來源是十字花科植物菘藍(lán)（Isatis indigoticaFort.）的干燥根[2]，屬二年生草本植物，在甘肅張掖地區(qū)有大規(guī)模的人工種植。在中醫(yī)臨床上，板藍(lán)根主要用于治療溫?zé)岵〕跗?，長于利咽喉，解溫?zé)峄鸲?，在治療咽喉腫痛常配伍牛蒡子使用。現(xiàn)代藥理學(xué)實驗[3-4]證實，板藍(lán)根具有抗病毒、抗菌、免疫調(diào)節(jié)、抗炎和利膽作用，并能抑制多種病毒引起的疾病。臨床上板藍(lán)根主要用于治療咽喉疼痛、感冒、發(fā)熱、病毒性肝炎和流行性乙型腦炎[5]。LI Z T等[6]通過臨床試驗全面評估了板藍(lán)根治療甲型和乙型流感病毒抗流感感染的有效性和安全性。在近些年公共衛(wèi)生事件中，板藍(lán)根廣泛應(yīng)用于病毒引起的各種疾病的預(yù)防和治療，療效顯著。CHEN Q等[7]通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法研究發(fā)現(xiàn)板藍(lán)根對新型冠狀病毒感染具有潛在的藥理作用。板藍(lán)根抗病毒活性主要取決于水溶性成分，包括氨基酸、核苷、含硫生物堿等。藥理活性主要依賴于其多種成分的協(xié)同作用，通過直接殺滅病原病毒或調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)以增強抗病毒能力[1]。控制好藥材質(zhì)量是保證臨床療效的重要手段，目前板藍(lán)根主要來源是人工種植[8]，建立一種全面、客觀的藥材質(zhì)量評價方法對保證藥材質(zhì)量尤為重要。

灰色關(guān)聯(lián)度分析（grey relation analysis，GRA）是研究多重因素的現(xiàn)代統(tǒng)計分析方法，用關(guān)聯(lián)度或者相對關(guān)聯(lián)度來表示研究對象之間的相關(guān)性，廣泛應(yīng)用于經(jīng)濟、社會、科學(xué)研究等各領(lǐng)域[9]。在中藥的質(zhì)量控制、中藥生產(chǎn)中關(guān)鍵工藝參數(shù)篩選、譜效關(guān)系研究方面灰色關(guān)聯(lián)分析已有應(yīng)用[10-14]。為了客觀有效地評價板藍(lán)根飲片的質(zhì)量，本研究根據(jù)2020年版《中華人民共和國藥典》標(biāo)準(zhǔn)，測定板藍(lán)根飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、（R、S）-告依春（C5H7NOS）的含量，并用層次分析法（AHP）確定指標(biāo)的權(quán)重，旨在建立灰色關(guān)聯(lián)分析和聚類分析板藍(lán)根飲片質(zhì)量評價模型。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1260Ⅱ高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；UN110恒溫烘箱（美墨爾特）；MS205D十萬分之一電子天平（梅特勒-托利多公司）；F0410箱式電阻爐（重慶雅馬拓科技有限公司）。

1.2 藥品與試劑（R，S）-告依春（C5H7NOS）（批號：111753-202007，含量：100.0%）購于中國食品藥品檢定研究院；色譜純甲醇（批號：10951807816）購于德國Merck公司；色譜純磷酸（批號：J2111704）購于阿拉??；其他試劑均為分析純。

40批板藍(lán)根飲片來自市場抽檢，分別抽檢中藥飲片生產(chǎn)企業(yè)20批，藥品經(jīng)營企業(yè)10批，使用單位10批。（見表1）40批樣品均經(jīng)武威市藥品檢驗檢測中心副主任中藥師張生杰鑒定為板藍(lán)根飲片。

表1 40 批板藍(lán)根飲片樣品來源

2 方法與結(jié)果

2.1 板藍(lán)根飲片各指標(biāo)性成分測定 按照2020年版《中華人民共和國藥典》一部板藍(lán)根飲片標(biāo)準(zhǔn)[含量測定]項下色譜條件[1]，測定板藍(lán)根飲片中（R，S）-告依春（C5H7NOS）含量。色譜條件：色譜柱為Shim-pack GIST C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為甲醇-0.02%磷酸溶液（7∶93）；流速為1.0 mL/min；柱溫為30 ℃；檢測波長為245 nm；進(jìn)樣量為20 μL。按照2020年版《中華人民共和國藥典》四部（通則0832第二法）測定水分，照通則2302測定總灰分和酸不溶性灰分，按照通則2201項下醇溶性浸出物測定法的熱浸法測定浸出物[15]，結(jié)果見表2。

表2 不同批次板藍(lán)根飲片水分、總灰分、酸不溶性灰分、浸出物、告依春的含量

2.2 指標(biāo)權(quán)重的確定 在利用多個評價指標(biāo)進(jìn)行綜合評判時，各指標(biāo)在整體中貢獻(xiàn)和重要程度不同，不考慮量化指標(biāo)權(quán)重的大小，簡單認(rèn)為所有的評價指標(biāo)的貢獻(xiàn)程度相同，這在實際評價中缺乏合理性，因此在利用多個綜合指標(biāo)評價時，確定指標(biāo)權(quán)重能更真實、客觀體現(xiàn)事物本質(zhì)特性[16]。計算權(quán)重常用的方法有7種，不同計算方法的區(qū)別主要是應(yīng)用原理不相同，在實際應(yīng)用過程中，要結(jié)合具體問題選擇適合的計算方法[17]。藥品質(zhì)量評價多采用層次分析法來計算指標(biāo)權(quán)重。本研究同樣采用層次分析法計算權(quán)重，根據(jù)指標(biāo)對板藍(lán)根質(zhì)量貢獻(xiàn)大小，對指標(biāo)進(jìn)行賦值（1.同等重要；3.A比B稍微重要；5.A比B明顯重要；7.A比B強烈重要；9.A比B極端重要）：（R，S）-告依春（7）、浸出物（5）、總灰分（3）、酸不溶性灰分（3）、水分（1），并計算指標(biāo)權(quán)重Wj。5個評價指標(biāo)的權(quán)重Wj分別為：（R，S）-告依春（0.368）、浸出物（0.263）、總灰分（0.158）、酸不溶性灰分（0.158）、水分（0.053）。

2.3 板藍(lán)根飲片質(zhì)量灰色關(guān)聯(lián)分析

2.3.1 參考序列的選擇 設(shè)有n個檢驗樣品，且每個樣品有m個評價指標(biāo)，組成一個評價序列{Xik}（i=1，2，3，...，n；k=1，2，3，...，m）（本研究中n=40，m=5）。取負(fù)向評價指標(biāo)水分、酸不溶性灰分、總灰分倒數(shù)作為評價指標(biāo)，與浸出物和（R，S）-告依春含量共同構(gòu)成指標(biāo)矩陣。

2.3.2 確定參考數(shù)據(jù)列 設(shè)各指標(biāo)的最大值構(gòu)成最優(yōu)參考數(shù)據(jù)列，記作{Xsk}，Xsk=x′0（1），x′0（2），...，x′0（m）；各指標(biāo)的最小值構(gòu)成最差參考數(shù)據(jù)列，記作{Xtk}，Xtk=x′0（1），x′0（2），...，x′0（m）。

2.3.3 對指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化 在實際分析中，分析數(shù)據(jù)很難完全表征事件本身特征，且表示物理意義也不同，如果不對數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理，就很難得到正確的分析結(jié)論。通常數(shù)據(jù)無量綱化處理，多使用標(biāo)準(zhǔn)化、均值化、標(biāo)準(zhǔn)方差法以消除彼此之間的影響。本研究用均值化對測量數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化處理，計算方法見公式[1]。

式中xi（k）為量綱化處理后的數(shù)據(jù)，x′i（k）表示原始數(shù)據(jù)。

2.3.4 計算關(guān)聯(lián)系數(shù) 根據(jù)公式[2]計算分析對象對應(yīng)最佳參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)，根據(jù)公式[3]計算分析對象對應(yīng)最差參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)。其中ρ為分辨系數(shù)，表示關(guān)聯(lián)系數(shù)之間的差異，ρ取值在0到1之間，當(dāng)ρ越小時，表示差異越顯著，分辨率越高。一般用ρ=0.5計算關(guān)聯(lián)系數(shù)，這樣可簡化計算過程，同時也能滿足分辨率[18]。

2.3.5 關(guān)聯(lián)度及相對關(guān)聯(lián)度 因指標(biāo)彼此間的物理意義、表征特征屬性不同，所以在分析時引入了樣品評價指標(biāo)權(quán)重Wj，來體現(xiàn)各指標(biāo)不同的貢獻(xiàn)。按公式[4]計算相對于最佳參考序列的關(guān)聯(lián)度，按公式[5]計算相對于最差參考序列的關(guān)聯(lián)度，按公式[6]計算板藍(lán)根飲片的相對關(guān)聯(lián)度rj，根據(jù)相對關(guān)聯(lián)度的大小，按大到小依次排序，結(jié)果見表3。

表3 評價單元序列相對于最優(yōu)參考序列的關(guān)聯(lián)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度、相對關(guān)聯(lián)度及排序

2.3.6 結(jié)果 通過對40批不同來源板藍(lán)根飲片質(zhì)量指標(biāo)進(jìn)行灰色關(guān)聯(lián)度分析，確定指標(biāo)權(quán)重（R，S）-告依春（0.368）、浸出物（0.263）、總灰分（0.158）、酸不溶性灰分（0.158）、水分（0.053），確定參考數(shù)據(jù)列，對指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行無量綱化，計算關(guān)聯(lián)系數(shù)，并對相關(guān)系數(shù)關(guān)聯(lián)度進(jìn)行排序，發(fā)現(xiàn)37批板藍(lán)根飲片相對關(guān)聯(lián)度介于0.387～0.499，表明板藍(lán)根飲片質(zhì)量總體穩(wěn)定，相對關(guān)聯(lián)度大于0.500的樣品有3批（S28、S29、S31），表明這3批板藍(lán)根飲片質(zhì)量明顯優(yōu)于其他。通過相對關(guān)聯(lián)度排序可知，S28板藍(lán)根飲片樣品質(zhì)量最好，S22質(zhì)量最差。

2.4 聚類分析 以5個質(zhì)量指標(biāo)關(guān)聯(lián)系數(shù)為變量，研究40批板藍(lán)根飲片樣品的質(zhì)量，構(gòu)成40個樣本×5階關(guān)聯(lián)系數(shù)矩陣，采用統(tǒng)計軟件SPSS Statistics 20.0進(jìn)行聚類分析。樣本聚類分析采用組間連接法，以歐幾里得平方距離為區(qū)間，當(dāng)分類距離為5時，40批板藍(lán)根飲片樣品分成3類，S28為一類，即第1類，S13、S29、S31歸為第2類，其余36批歸為第3類。從聚類分析結(jié)果和表3灰色關(guān)聯(lián)分析方法結(jié)果來看，S28樣品質(zhì)量最優(yōu)，并遠(yuǎn)好于其他樣品單獨歸為一類，并在灰色關(guān)聯(lián)分析排序為第1位；S31、S29、S13樣品在灰色關(guān)聯(lián)分析排序分別為2、3、6位，表明此類樣品質(zhì)量相近，排序靠前質(zhì)量較好，其余36批樣品歸為第3類，表明市場上銷售的絕大數(shù)的板藍(lán)根飲片質(zhì)量相近、質(zhì)量穩(wěn)定。（見圖1）

圖1 40 批板藍(lán)根聚類分析樹狀圖

3 討論

中藥化學(xué)成分非常復(fù)雜，含有多種類型的已知或未知成分，很難具體確定那一種是發(fā)揮藥效作用的成分。中藥發(fā)揮藥效作用的特點就是各成分協(xié)同參與、多途徑、多靶點發(fā)揮藥理活性[19]。若從簡單的幾種化學(xué)成分含量多少來評價中藥質(zhì)量，這就違背傳統(tǒng)中醫(yī)理論體系[20]。因此，建立一種不同物理意義的多種指標(biāo)同時評價中藥質(zhì)量，對中藥的應(yīng)用和開發(fā)具有重要意義?；诨疑P(guān)聯(lián)度分析模型在模糊系統(tǒng)研究中的優(yōu)勢，根據(jù)傳統(tǒng)經(jīng)驗對評價指標(biāo)進(jìn)行打分，由層次分析法確定的指標(biāo)權(quán)重能客觀反映其內(nèi)在品質(zhì)。從分析結(jié)果來看，92.5%的板藍(lán)根飲片相對關(guān)聯(lián)度在0.387~0.499之間，只有S28、S29和S31板藍(lán)根飲片相對關(guān)聯(lián)度在0.500以上，表明這3批板藍(lán)根飲片的質(zhì)量明顯優(yōu)于其他批次。表明市場上銷售的板藍(lán)根飲片質(zhì)量相對穩(wěn)定，客觀上反映了市售板藍(lán)根飲片大部分來自人工種植。相對關(guān)聯(lián)度排序顯示，編號S28質(zhì)量最好，其（R，S）-告依春和浸出物的含量最高。這從質(zhì)量研究的角度證實了浸出物、活性成分含量越高，質(zhì)量越好的結(jié)論[21-22]。

為進(jìn)一步澄清相對關(guān)聯(lián)度在0.387~0.499之間的板藍(lán)根飲片質(zhì)量是否存在差異，本研究對40批板藍(lán)根飲片樣品的質(zhì)量進(jìn)行了聚類分析。聚類分析法是研究分類的統(tǒng)計學(xué)方法，具體方法是通過計算樣本之間的距離，將距離接近的歸為一類，不斷計算類與類之間的距離，直到歸一類為止[23]。當(dāng)類間距為5時，40批板藍(lán)根飲片分為3類，僅S28為第1類，S13、S29和S31為第2類，其余36批為第3類。結(jié)合灰色關(guān)聯(lián)度的分析結(jié)果，樣品S28相對關(guān)聯(lián)度排第1位，說明S28的質(zhì)量明顯優(yōu)于其他樣品。S13、S29和S31排序同樣位居前列并歸為一類，表明其質(zhì)量較好并接近。第3類相對關(guān)聯(lián)度在0.387~0.499之間，占樣品總量90%，說明板藍(lán)根飲片質(zhì)量相對穩(wěn)定。兩種不同的分析方法共同證明了一個結(jié)論，相互印證，證實了灰色關(guān)聯(lián)分析的準(zhǔn)確性。

本研究建立的灰色關(guān)聯(lián)分析綜合評價模型與聚類分析相結(jié)合，適用于多指標(biāo)的中藥質(zhì)量綜合評價，方法簡單直觀。同時，也為其他中藥的質(zhì)量評價提供了新的思路和方法。