丘梓桐，謝 靜，蔡子杰，方樂瑤，陶 洪

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208；3.國家中醫(yī)藥管理局全國名老中醫(yī)藥專家王孟清傳承工作室，湖南 長沙 410007）

國內(nèi)外許多學(xué)者通過研究提出，在引起抽動(dòng)障礙（tic disorder，TD）發(fā)病的諸多機(jī)制中，最主要的學(xué)說是基底節(jié)紋狀體-丘腦-皮質(zhì)環(huán)路（CSTC）的多巴胺代謝失常[1-3]。TD的發(fā)病與神經(jīng)遞質(zhì)失衡密切相關(guān)，基底節(jié)紋狀體多巴胺活動(dòng)過度或多巴胺受體超敏感被認(rèn)為是其發(fā)生的重要機(jī)制[4-8]。目前研究認(rèn)為[9]：多巴胺受體較多，依據(jù)受體的結(jié)構(gòu)及藥理特性，分為D1樣（D1、D5）及D2樣（D2、D3、D4）。D1、D2類受體都依賴環(huán)磷酸腺苷（cAMP）介導(dǎo)其下游信號通路。這些受體均屬G蛋白耦聯(lián)受體，其主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制是通過G蛋白受體耦聯(lián)第二信使調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。其中，D1樣受體功能的發(fā)揮主要通過G蛋白α亞基的兩個(gè)亞型Gαs、Gαolf來激活腺苷酸環(huán)化酶（AC），進(jìn)而引起細(xì)胞內(nèi)cAMP含有量上升，導(dǎo)致依賴性蛋白激酶A（PKA）的進(jìn)一步活化，從而發(fā)揮相應(yīng)功能。D2樣受體則與D1樣受體相反，D2受體型亞D2RS被突觸間隙的DA激活。它通過G蛋白α亞基的另一個(gè)亞型Gαi/αo反向調(diào)節(jié)AC及cAMP，通過AC/cAMP/PKA信號通路抑制DA的合成，故AC的活性及cAMP的表達(dá)水平由D1與D2樣受體共同維持。AC/cAMP/PKA信號通路是調(diào)控多巴胺代謝重要通路之一。

近年來，關(guān)于TD的治療，中醫(yī)眾醫(yī)家從本病的病因病機(jī)方面出發(fā)，通過辨證論治，采取個(gè)性化治療，均取得一定的成績[10-18]。舒蘭教授是國家中醫(yī)藥管理局第七批名老中醫(yī)學(xué)術(shù)經(jīng)驗(yàn)繼承人指導(dǎo)老師，在中醫(yī)藥防治小兒抽動(dòng)癥方面有豐富的經(jīng)驗(yàn)。舒蘭認(rèn)為TD在病因上多數(shù)與感受外邪密切相關(guān)，乃外邪引動(dòng)內(nèi)風(fēng)所致，通過疏風(fēng)止痙、清熱利咽，能盡早截?cái)嗖⌒叭肭值耐緩?，控制疾病傳變?；诖死碚?，舒蘭研制出“清解止抽口服液”治療小兒抽動(dòng)癥，可以明顯改善抽動(dòng)癥狀[19]。因此，本課題在前期研究的基礎(chǔ)上，以幼齡TD模型大鼠為研究對象，觀察清解止抽口服液對TD大鼠AC/cAMP/PKA信號通路的影響，以期為臨床治療兒童TD提供新的思路。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠40只，21日齡，體質(zhì)量（50±10）g，購自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（湘）2019-0004。實(shí)驗(yàn)單位使用許可證編號：SYXK（湘）2020-0010。本實(shí)驗(yàn)過程中的飼料購自湖南嘉泰實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，許可證號：SCXK（湘）2020-0006。將40只SD大鼠分籠飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院SPF級實(shí)驗(yàn)室，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理審批號：ZYFY20220525-04，常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲食進(jìn)水，動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～23 ℃，相對濕度50%，換氣量10~20次/h，日光燈采光，明暗交替。

1.2 主要儀器 超低溫冰箱（海爾集團(tuán)電器有限公司，型號：DW-86L338A）；冰柜（海爾集團(tuán)電器有限公司，型號：BD-518HD）；冰柜（海爾集團(tuán)電器有限公司，型號：BCD-220L）；臺式高速冷凍離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，型號：H1650R）；全自動(dòng)酶標(biāo)洗板機(jī)（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號：PW-812）；多功能酶標(biāo)分析儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司，型號：MB-530）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司，型號：DHP-500）。

1.3 主要試劑 3，3’-亞胺基二丙腈（長沙市天心區(qū)聯(lián)康生物試劑經(jīng)營部，規(guī)格：1157652-25 mL）。

1.4 主要藥物 清解止抽口服液組成：金銀花10 g，連翹10 g，荊芥10 g，桔梗10 g，僵蠶6 g，蟬蛻5 g，山豆根5 g，淡竹葉10 g，龍骨20 g，生石決明10 g，牛蒡子10 g，射干10 g，鉤藤10 g，甘草2 g（處方為5~8歲兒童臨床用藥劑量），同一批次中藥飲片均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房；氟哌啶醇片（寧波大紅鷹藥業(yè)股份有限公司，2 mg/片，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字H33020585）。

2 方法

2.1 藥物配制

2.1.1 中藥制備 取石決明打碎置于提取罐中，煮沸2 h，后加入其他藥物，煮沸1 h后濾出藥液，藥渣加蒸餾水，煎煮1 h后濾出藥液。合并兩次藥液，60 ℃減壓濃縮至含生藥0.68 g/mL的清解止抽口服液，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.1.2 西藥制備 將氟哌啶醇片碾碎成藥粉，加入蒸餾水后配成懸混液，按照人與大鼠體表面積比值計(jì)算大鼠給藥劑量，配成藥物質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL。

2.2 動(dòng)物分組和藥物干預(yù)

2.2.1 動(dòng)物分組及造模 40只SD大鼠隨機(jī)抽取30只（n=30，模型實(shí)驗(yàn)組）腹腔注射亞氨基二丙腈（iminodipropionitrile，IDPN）150 mg/（kg·d）造模，7 d后出現(xiàn)鼻嗅、仰頭、擺頭、軀體旋轉(zhuǎn)等不同程度的刻板行為及運(yùn)動(dòng)行為，按DIAMOND B I等[20]評分方法評分≥2分可判定造模成功。將造模成功的30只模型實(shí)驗(yàn)組大鼠隨機(jī)分為B組（n=10）、C組（n=10）、D組（n=10），10只未造模處理的SD大鼠為A組（空白對照組）。

2.2.2 藥物干預(yù) 造模后第2天，模型實(shí)驗(yàn)組大鼠未見死亡、未見攝食量及體質(zhì)量明顯下降后，開始給藥。其中B組灌胃等量滅菌蒸餾水[0.5 mg/（kg·d）]；C組灌胃氟哌啶醇混懸液[0.5 mg/（kg·d）]，氟哌啶醇配成懸混液，質(zhì)量濃度為0.025 mg/mL；D組灌胃清解止抽口服液[16 g/（kg·d）]；A組灌胃等量滅菌蒸溜水[0.5 mg/（kg·d）]。4組灌胃時(shí)間均于08:30:00進(jìn)行，1次/d，持續(xù)2周。

2.3 觀察指標(biāo)

2.3.1 行為評分 在造模后及每周灌胃后1 h，對每組每只大鼠進(jìn)行稱重，并進(jìn)行運(yùn)動(dòng)行為及刻板行為觀察并評分。（1）運(yùn)動(dòng)行為評分：參照DIAMOND B I等[20]報(bào)道的抽動(dòng)障礙動(dòng)物模型行為學(xué)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，用攝像裝備記錄任意1 h內(nèi)的大鼠活動(dòng)情況，每隔5 min記錄1次，每次記錄5 min。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，安靜或正?；顒?dòng)；1分，過度興奮；2分，探究行為增加；3分，跑；4分，跑和跳。（2）刻板行為評分：參照DIAMOND B I等報(bào)道的抽動(dòng)障礙動(dòng)物模型行為學(xué)的評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，用攝像裝備記錄任意1 h內(nèi)的大鼠活動(dòng)情況，每隔5min記錄1次，每次記錄5min。評分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無刻板行為；1分，旋轉(zhuǎn)行為；2分，頭、頸部的上下運(yùn)動(dòng)過多；3分，頭、頸部的上下運(yùn)動(dòng)過多加旋轉(zhuǎn)行為；4分，頭向側(cè)擺合并頭、頸部的上下運(yùn)動(dòng)過多。

2.3.2 體質(zhì)量 于造模7 d和灌胃7 d、14 d時(shí)測量大鼠的體質(zhì)量，并記錄。

2.3.3 紋狀體中DRD1、DRD2檢測 大鼠取血后用10%水合氯醛過量麻醉處死，快速斷頭取出腦組織，參考《大鼠腦立體定位圖譜》確定大鼠紋狀體位置，在冷凍臺上快速剝離出雙側(cè)紋狀體，液氮速凍后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中凍存以備用。在維世爾生物科技有限公司進(jìn)行紋狀體中DRD1、DRD2檢測。通過實(shí)時(shí)定量多聚酶聯(lián)反應(yīng)技術(shù)檢測大鼠紋狀體多巴胺受體DRD1、DRD2水平。

第一步：RNA提取。（1）實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備：121 ℃，20 min濕熱滅菌三蒸水1 L中加入1 mL的DEPC，搖勻過夜，即為0.1%DEPC水；將所有提取RNA所需器械及耗材（如：無酶tip頭，離心管等），浸泡于0.1%DEPC水中過夜。第2天將所有浸泡于0.1%DEPC中的器械撈起，用報(bào)紙包裝好，121 ℃，60 min濕熱滅菌，烘干后即可用。（2）Trizol提取組織總RNA：取保存在Trizol中的組織約0.02 g，加入1 mL Trizol于勻漿器中充分研磨勻漿，混勻后室溫裂解5 min；加入200 μL三氯甲烷，劇烈振蕩15 s，室溫靜置3 min；轉(zhuǎn)速12 000 r/min，4 ℃，離心15 min。取上清液，轉(zhuǎn)移到新的RNase-Free離心管中；加入等體積的異丙醇，混勻，室溫靜置10 min；轉(zhuǎn)速12 000 r/min，4 ℃，離心10 min，去上清，加入1 mL75%乙醇（無菌DEPC處理水配制）洗滌沉淀；12 000 r/min，4 ℃，離心3 min，去上清；空氣干燥5~10 min。加入20~30 μL無菌無酶水溶解沉淀；紫外分光光度計(jì)測定濃度，在260 nm與280 nm處測其吸光度值，并計(jì)算其濃度和純度。

第二步：RNA反轉(zhuǎn)錄。以組織總mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄cDNA；渦旋振蕩混勻，短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底；50 ℃孵育50 min，85 ℃孵育5 min。反應(yīng)結(jié)束后，短暫離心，置于冰上冷卻；逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可直接用于PCR反應(yīng)和熒光定量PCR反應(yīng)，或置于-20 ℃長期保存。

第三步：RT-qPCR實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法：SYBR法。（1）引物設(shè)計(jì)：在NCBI上搜索目的基因的序列，運(yùn)用Primer5軟件設(shè)計(jì)引物，由北京擎科合成引物。（2）體系組成：實(shí)時(shí)定量PCR（每個(gè)樣本每個(gè)指標(biāo)3個(gè)孔，共30 μL體系，每孔10 μL）。（3）定量PCR擴(kuò)增程序。

2.3.4 紋狀體中AC、cAMP、PKA檢測 采用ELISA法檢測（雙抗體夾心法）。組織：取20 mg組織，用1×PBS洗去血污。剪成小塊放入組織研磨器（勻漿管）中，加入200 μL 1×PBS，制成勻漿，然后置于-20 ℃過夜。經(jīng)過反復(fù)凍融2次處理破壞細(xì)胞膜后，將組織勻漿于2~8 ℃、轉(zhuǎn)速7 000 r/min離心5 min取上清。取適量上清液立即進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，或?qū)⑸锨宸盅b保存于-20 ℃或-80 ℃。解凍后的樣本應(yīng)再次離心，然后檢測。避免反復(fù)凍融。BCA蛋白定量：（1）稀釋BSA標(biāo)準(zhǔn)品：用與待測蛋白樣品相一致的稀釋液將BSA標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為2.000 0、1.000 0、0.500 0、0.250 0、0.125 0、0.062 5、0.000 0 μg/μL（0為稀釋液）。（2）配置BCA工作液：計(jì)算BCA工作液總量，BCA工作液總量=（BSA標(biāo)準(zhǔn)品樣本個(gè)數(shù)+未知樣本個(gè)數(shù)）×復(fù)孔數(shù)×每個(gè)樣本BCA工作液體積（注：每個(gè)樣本BCA工作液體積為200 μL）。根據(jù)計(jì)算出的BCA工作液需要總量，將BCA-A和BCA-B按照50∶1的體積比，配制BCA工作液，充分混勻；（3）定量檢測：將稀釋好的BSA標(biāo)準(zhǔn)品和待測蛋白樣品各25 μL分別加到作好標(biāo)記的96孔板微孔中；每孔加入200 μL BCA工作液，充分混勻，蓋上96孔板蓋，37 ℃孵育30 min，冷卻至室溫，須在3~5 min內(nèi)完成檢測；用酶標(biāo)儀在540~590 nm范圍內(nèi)，測定每個(gè)樣品及BSA標(biāo)準(zhǔn)品的吸光值，同時(shí)做好記錄；繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品中的蛋白濃度。

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料若符合正態(tài)分布以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)行為評分比較 造模7 d，B、C、D組大鼠運(yùn)動(dòng)行為評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。灌胃14 d，C、D組大鼠運(yùn)動(dòng)行為評分均低于B組（P<0.05）；C、D組大鼠運(yùn)動(dòng)評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見表1）

表1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)行為評分比較 （±s，分）

表1 各組大鼠運(yùn)動(dòng)行為評分比較 （±s，分）

注：與B組比較，aP<0.05。

?

3.2 各組大鼠刻板行為評分比較 造模7 d，B、C、D組大鼠刻板評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。灌胃14 d，C、D組大鼠刻板行為評分均低于B組（P<0.05）；C、D組大鼠刻板行為評分比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見表2）

表2 各組大鼠刻板行為評分比較 （±s，分）

表2 各組大鼠刻板行為評分比較 （±s，分）

注：與B組比較，aP<0.05。

?

3.3 各組大鼠體質(zhì)量比較 造模0 d，A、B、C、D組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。造模7d、灌胃7d、灌胃14 d，B、C、D組大鼠體質(zhì)量均低于A組（P<0.05）；B、C、D組大鼠體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見表3）

表3 各組大鼠體質(zhì)量比較 （±s，g）

表3 各組大鼠體質(zhì)量比較 （±s，g）

注：與A組比較，aP<0.05。

?

3.4 各組大鼠紋狀體中DRD1、DRD2含量比較 藥物治療14 d后，B、C、D組DRD1、DRD2含量均低于A組（P<0.05）。C、D組DRD1、DRD2含量均高于B組（P<0.05）。C、D組DRD1、DRD2含量比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見表4）

表4 各組大鼠治療后紋狀體中DRD1、DRD2 含量比較（±s，ng/μL）

表4 各組大鼠治療后紋狀體中DRD1、DRD2 含量比較（±s，ng/μL）

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

?

3.5 各組大鼠紋狀體中AC、cAMP、PKA含量比較 藥物治療14 d后，B、C、D組大鼠AC、cAMP、PKA含量均低于A組（P<0.05）。C、D組大鼠AC、cAMP、PKA含量均高于B組（P<0.05）。C、D組大鼠AC、cAMP、PKA含量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠治療后紋狀體中AC、cAMP、PKA 含量比較（±s，ng/μL）

表5 各組大鼠治療后紋狀體中AC、cAMP、PKA 含量比較（±s，ng/μL）

注：與A組比較，aP<0.05；與B組比較，bP<0.05。

?

4 討論

兒童抽動(dòng)障礙暫無統(tǒng)一中醫(yī)病名，根據(jù)其臨床表現(xiàn)可歸于“慢驚風(fēng)”“抽搐”“肝風(fēng)”等范疇，目前多從“心、肝、脾、腎”等論治[21]。多數(shù)醫(yī)家從“風(fēng)邪”論治抽動(dòng)障礙的療效顯著[22-26]。本病常因感受外邪后發(fā)，風(fēng)為百病之長，風(fēng)邪犯肺，走經(jīng)竄絡(luò)，內(nèi)外相招從而引動(dòng)內(nèi)風(fēng)。而小兒為“純陽之體”，易于化熱，該病多發(fā)展為風(fēng)熱之證，疏外風(fēng)、平肝風(fēng)是臨床共識。中醫(yī)治療本病強(qiáng)調(diào)“從肺論治”，通過治肺以盡早切斷病邪入侵的途徑，防止疾病傳變，以安未受邪之地。清解止抽口服液由金銀花、連翹、荊芥、桔梗、僵蠶、蟬蛻、山豆根、淡竹葉、龍骨、生石決明、牛蒡子、射干、鉤藤、甘草組成。方中銀翹為君藥，可疏風(fēng)散熱；石決明、鉤藤為臣藥，起疏風(fēng)清熱、平肝止痙之功；蟬蛻、僵蠶祛風(fēng)止痙；射干、牛蒡子、山豆根利咽解毒；桔梗宣肺；淡竹葉清上焦之熱；荊芥辛溫，透邪外出；龍骨為佐藥，可鎮(zhèn)靜安神；甘草為使藥，可調(diào)和諸藥[19]。

本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，清解止抽口服液能夠明顯改善TD模型大鼠的運(yùn)動(dòng)行為和刻板行為。氟哌啶醇和清解止抽口服液無論在運(yùn)動(dòng)行為評分還是刻板行為評分上，分值均較接近，表明清解止抽口服液與氟哌啶醇治療TD大鼠療效相當(dāng)。

造模7 d時(shí)，B、C、D組大鼠體質(zhì)量均低于A組（P＜0.05），說明亞氨基二丙腈可抑制大鼠的體質(zhì)量增長。雖然在大鼠總體質(zhì)量上，灌胃7 d和14 dA組大鼠體質(zhì)量高于B、C、D組（P＜0.05），但B、C、D組各組間體質(zhì)量比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），且D和C組的大鼠終體質(zhì)量仍然高于B組。

藥物治療14 d后，B、C、D組大鼠紋狀體中DRD1、DRD2、AC、cAMP、PKA含量均低于A組（P<0.05）。C、D組均高于B組（P<0.05）。提示D組和C組均通過調(diào)節(jié)CSTC中的DRD1、DRD2及AC/cAMP/PKA信號通路代謝來起到治療作用，而且D組DRD2高于C組，提示清解止抽口服液能較好地刺激DRD2受體的產(chǎn)生，發(fā)揮止抽的效果，為后期的研究提供了一些實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本次研究表明，清解止抽口服液能夠明顯改善TD模型大鼠的運(yùn)動(dòng)行為和刻板行為，調(diào)節(jié)DRD1、DRD2及AC/cAMP/PKA信號通路代謝。