蘭甜甜,常 樂,侯莉微,王珍珍,李東初,陳桂生

帕金森病(PD)是一種常見的神經(jīng)退行性疾病,其發(fā)病率及死亡率正在逐年增加。如果能找到與帕金森病發(fā)生發(fā)展過程相關(guān)的潛在生物標志物,盡早明確診斷并采取干預(yù)措施,將在很大程度上改善帕金森病患者的預(yù)后[1]。以液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS)技術(shù)為核心的代謝組學分析技術(shù)是研究代謝物變化規(guī)律的有力手段[2]。本研究使用基于LC-MS的非靶向代謝組學研究方法,通過分析帕金森病患者的血清代謝物水平,試圖找出與帕金森病相關(guān)的差異代謝物變化并進行代謝通路分析,從而初步篩選出可能用于帕金森病臨床診斷的潛在生物標志物,為探索帕金森病可能的致病機制提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料:選取2020年3月至2021年12月就診于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科門診的30例原發(fā)性帕金森病患者為實驗組(PD組)。

1.1.1 納入標準:①患者年齡在18～80歲;②按照《中國帕金森病的診斷指南(2016版)》實施帕金森病診斷標準。

1.1.2 排除標準:①帕金森疊加綜合征、多種因素引起的帕金森綜合征及遺傳性帕金森病綜合征;②嚴重的全身性疾病。選取同時期就診于寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院體檢中心的15名受試者為健康對照組(HC組)。本研究已獲得寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院倫理委員會批準,符合《赫爾辛基宣言》要求,所有參與者在參與研究前均已簽署知情同意書。

1.2 血清樣本的處理:使用一次性真空負壓采血管抽取空腹狀態(tài)下45名受試者靜脈血液5 mL,將100 μL試樣放入試管,加入300 mL抽提液,攪拌30 s,超聲波10 min,-40 ℃放置1 h,離心15 min,取上清液并立即保存在-80 ℃低溫冰箱中等待后續(xù)的上機檢測[2]。

1.3 數(shù)據(jù)處理:采用 ProteoWizard軟件把原始數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為 mzXML,再用 XCMS實現(xiàn)峰識別、峰提取、峰對齊、整合等處理,再將該物質(zhì)與BiotreeDB(V2.1)自行建立的第二級質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫相匹配[2]。

2 結(jié)果

2.1 一般情況:本研究共收集了45份血清樣本,其中15份來自HC組,30份來自PD組。2組受試者年齡、性別、吸煙、飲酒、高血壓、糖尿病、高脂血癥、心血管疾病等一般情況比較差異無統(tǒng)計學意義,具有可比性。

2.2 代謝組學分析結(jié)果

2.2.1 質(zhì)量控制:用質(zhì)控(QC)樣本間的反應(yīng)峰高差來判定樣本檢測過程的穩(wěn)定性[3],QC樣本反應(yīng)強度的穩(wěn)定性良好。QC樣本具有良好的聚合性能。

2.2.2 正交偏最小二乘法-判別分析(OPLS-DA):我們應(yīng)用OPLS-DA對結(jié)果進行分析[2],2組樣本區(qū)分非常顯著,樣本基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)。

2.2.3 差異代謝物的篩選:使用P值以及OPLS-DA模型第一主成分的變量投影重要度(VIP值)來篩選差異代謝物[4],篩選出的差異代謝物必須同時滿足VIP值大于1和P值小于0.05。差異代謝物的篩選結(jié)果如表1所示,在PD組與HC組的對比中,一共篩選出30個差異代謝物。

表1 差異代謝物基本信息

2.2.4 差異代謝物分類統(tǒng)計:本研究篩選出的差異代謝物包括脂類及類脂分子、苯類、有機酸及衍生物、有機氮化合物、有機氧化合物、有機雜環(huán)化合物及聚酮類等,其中脂類及類脂分子(甘油磷脂類為主)占比最高。

2.2.5 差異代謝物KEGG富集分析:本研究利用 KEGG數(shù)據(jù)庫將30個差異代謝物所對應(yīng)的代謝通路進行分類[5]。差異代謝物主要富集在13條代謝通路上。

2.2.6 差異代謝物代謝通路分析:對差異代謝物所在代謝通路進行綜合分析[4]。圖中富集程度高、影響因子大的深色大氣泡代表了8條與差異代謝物相關(guān)性高的關(guān)鍵通路,它們分別是甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝,鞘脂代謝,嘌呤代謝,嘧啶代謝,精氨酸和脯氨酸代謝,原發(fā)性膽汁酸生物合成,葉酸生物合成和甘油磷脂代謝。

3 討論

本次研究中共發(fā)現(xiàn)了30個差異代謝物,其中甘油磷脂類(GP)占比最大。GP主要用于構(gòu)成生物膜及作為信號分子調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達[6],其可分為磷脂酸(PA)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰甘油(PG)、心磷脂(CL)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰膽堿 (PC)和磷脂酰肌醇(PI)[7]。

PE參與組成哺乳動物細胞膜,有研究資料指出帕金森病患者出現(xiàn)了PE含量顯著下降的情況[8],PE是α-突觸核蛋白和生物膜相互作用的關(guān)鍵橋梁,PE的缺乏可導致α-突觸核蛋白穩(wěn)定狀態(tài)受損,這提示我們 PE的缺乏可能會加快 PD的病情進展[7]。PS在多種信號通路中發(fā)揮作用,有研究發(fā)現(xiàn)利用抗PS抗體阻斷小膠質(zhì)細胞介導的吞噬作用可以發(fā)揮對神經(jīng)元的保護作用[9]。CL主要存在于線粒體內(nèi)膜,有資料指出導致帕金森病發(fā)展的主要風險因子是線粒體功能障礙和異常蛋白質(zhì)形成,PTEN誘導的激酶1(PINK1)基因表達突變會引起線粒體功能障礙,補充CL可修復線粒體功能[10]。

本研究還發(fā)現(xiàn)包括鞘脂代謝在內(nèi)的8條關(guān)鍵代謝通路的紊亂可能參與了帕金森病的發(fā)生和發(fā)展。有研究表明,鞘脂代謝穩(wěn)態(tài)的破壞與神經(jīng)退行性病變中進行性神經(jīng)元毒性變化有著很大關(guān)聯(lián)[7]。鞘脂代謝通路的紊亂影響了細胞增殖、分化和運動等多種細胞過程。鞘脂在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量豐富,其代謝產(chǎn)物(神經(jīng)酰胺、鞘氨醇、鞘氨醇1-磷酸酯)也起著調(diào)節(jié)信號分子的作用。有研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)酰胺可能通過調(diào)節(jié)線粒體自噬來促進帕金森病的發(fā)生[11]。鞘氨醇激酶(Sphk1/2)主要負責合成鞘氨醇-1-磷酸,有研究發(fā)現(xiàn)在帕金森病小鼠模型中,Sphk2在小鼠中腦黑質(zhì)區(qū)的含量顯著下降[12]。有研究表明,葡糖基神經(jīng)酰胺、鞘氨醇等與代謝病相關(guān)的鞘脂可在體外促進α-突觸核蛋白聚集,這表明鞘氨醇是人類神經(jīng)元內(nèi)源性α-突觸核蛋白聚集體形成的誘因[13]。

綜上所述,帕金森病患者與健康對照組的代謝譜存在顯著差異。初步確定可能與帕金森病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在生物標志物有30個,其中甘油磷脂類占比最大,這為進一步研究將甘油磷脂類代謝物作為帕金森病生物標志物和治療靶點的潛力提供了一定的依據(jù)。此外,本研究還進一步觀察到有8條代謝通路的紊亂可能是PD的潛在發(fā)病機理,其中鞘脂代謝障礙可能是帕金森病的關(guān)鍵代謝事件,上述發(fā)現(xiàn)在一定程度上提高了我們對帕金森病發(fā)病機理的認識,并有助于治療干預(yù)的靶向篩選。本研究的局限性在于樣本量少,未來還需要多中心多樣本的臨床研究來進一步驗證并與其他神經(jīng)退行性疾病的血清或血漿進行比較,以便篩選出帕金森病患者特異性的生物標志物。