李桂榮,沈忱悠,衛(wèi) 棟,陳靜瑜

急性肺損傷(ALI)是指心源性以外的因素導(dǎo)致急性的、進(jìn)行性的、缺氧性的急性呼吸衰竭,典型特征是出現(xiàn)彌漫性肺泡損傷,肺組織發(fā)生過度炎癥、水腫、肺透明膜,嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致急性呼吸窘迫綜合癥,致死率在29%～42%[1-3]。LPS作為TLR4激動(dòng)劑可誘導(dǎo)急性肺損傷,激活TLR4信號途徑,接著導(dǎo)致NF-κB信號途徑的激活,促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)[4]。急性肺損傷中,多種免疫細(xì)胞如巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞被激活和招募,尤其是肺泡巨噬細(xì)胞,占肺組織常駐細(xì)胞的80%,不同的微環(huán)境下呈現(xiàn)促炎和抗炎的表型,參與肺組織的炎癥反應(yīng)及組織修復(fù)[5-6]。

槲皮素是廣泛存在于自然界的黃酮醇化合物,具有抗炎和抗氧化應(yīng)激的作用[7]。越來越多的研究表明,槲皮素對不同因素導(dǎo)致的急性肺損傷有保護(hù)作用。在脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中,槲皮素可以抑制肺組織炎癥細(xì)胞的流入和cAMP-Epac信號途徑,減輕了肺組織炎癥損傷[8-9]。吸煙誘導(dǎo)的急性肺損傷,槲皮素可抑制肺組織的氧化應(yīng)激壓力和白細(xì)胞水平,減輕肺組織損傷[10]。在膿毒癥誘導(dǎo)的小鼠急性肺損傷中,槲皮素可以通過SIRT1/AMPK信號途徑降低氧化應(yīng)激的壓力,減輕肺組織損傷[11]。而槲皮素在脂多糖誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷中的作用和機(jī)制仍不清楚。本研究利用LPS誘導(dǎo)的大鼠急性肺損傷模型,研究槲皮素對急性肺損傷大鼠的保護(hù)作用及對巨噬細(xì)胞促炎表型的調(diào)節(jié)作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料:SPF級SD大鼠,購于常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(蘇)2021-0013],本研究符合一般動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理學(xué)原則;槲皮素購于Sigma公司;一抗抗體CD68、IRF5、Arg1、Notch1購于Abcam公司;內(nèi)參β-actin、辣根過氧化氫酶標(biāo)記的羊抗兔及羊抗鼠二抗、配制SDS-PAGE蛋白膠的相關(guān)試劑、動(dòng)物RNA抽提試劑盒購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司;生物素標(biāo)記的羊抗兔二抗、鏈霉親和素全長蛋白、DAB顯色試劑盒購于Abcam公司;反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒購于Takara公司;ECL底物發(fā)光液購于Thermo公司。

1.2 急性肺損傷動(dòng)物模型的建立:30只SPF級SD大鼠,重量(200±30)g,隨機(jī)分成3組,即對照組、脂多糖組、脂多糖+槲皮素組。在脂多糖組,用2%的戊巴比妥鈉腹腔注射,給藥40 mg/kg麻醉大鼠,剪開頸部皮膚,暴露氣管,用1 mL注射器吸取LPS 100 μL,給藥量5 mg/kg,經(jīng)氣管進(jìn)行滴注,為了讓LPS均勻分布到肺組織,滴注完LPS后,大鼠保持直立并旋轉(zhuǎn)1～2 min,縫合皮膚,正常喂養(yǎng),LPS刺激24 h 后取肺,部分肺組織-80 ℃凍存,部分肺組織置于10%中性福爾馬林中固定,用于后續(xù)的病理實(shí)驗(yàn)。對照組的大鼠暴露氣管后給予同等體積的PBS,取肺后部分組織-80 ℃凍存,部分組織置于10%中性福爾馬林中固定。脂多糖+槲皮素組,腹腔注射給予槲皮素,一次給藥量為50 mg/kg,同時(shí)氣管滴注給予LPS (5 mg/kg),24 h后取肺,部分肺組織于-80 ℃凍存,部分肺組織置于10%中性福爾馬林中固定,用于后續(xù)病理實(shí)驗(yàn)。

1.3 肺組織蘇木精-伊紅染色:蘇木精-伊紅染色(HE染色)的方法觀察肺組織的病理變化,灌流后的左肺組織在10%中性福爾馬林中固定24 h,進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟,然后包埋,切片,厚度為4 μm,對切片進(jìn)行HE染色,中性樹膠封片,光鏡下拍照,觀察肺組織病理變化。

1.4 肺組織濕干重比檢測:用肺組織濕干重比檢測肺組織的水腫變化程度。取新鮮的左肺組織,紗布吸取表面的液體,稱取肺組織的質(zhì)量為濕重,然后置于60 ℃烘箱中72 h,至肺組織質(zhì)量不再發(fā)生變化時(shí)稱取的質(zhì)量為干重。濕重與干重的比值反應(yīng)肺組織的水腫程度。

1.5 肺組織炎癥因子的檢測:qRT-PCR方法檢測肺組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)變化。設(shè)計(jì)合成引物1OD,TNF-α(上游序列5′-CTGGCGTGTTCATCCGTTCT-3′,下游序列5 ′-GCCACTACTTCAGCGTCTCG-3′),IL-1β(上游序列5 ′-AGGCTGACAGACCCCAAAAG-3′,下游序列5 ′-GCTCCACGGGCAAGACATA-3′),內(nèi)參GAPDH(上游序列5 ′-CGCTAACATCAAATGGGGTG-3′,下游序列5 ′-TTGCTGACAATCTTGAGGGAG-3′),用RNA抽提試劑盒抽提右上肺組織RNA,用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行擴(kuò)增。GAPDH作為內(nèi)參,用2-ΔΔCt方法計(jì)算目標(biāo)基因TNF-α和IL-1β的相對表達(dá)量。

1.6 肺組織免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測:經(jīng)多聚甲醛灌流后的肺組織置于10%中性福爾馬林溶液中固定24 h,進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋。取左肺切片厚度4 μm,進(jìn)行脫蠟復(fù)水,然后置于0.3%甲醇-H2O2溶液中浸泡20 min,滅活內(nèi)源性過氧化物酶,切片置于枸櫞酸緩沖液中用高壓鍋煮沸10 min,進(jìn)行抗原修復(fù)。用5%的BSA室溫封閉40 min后,一抗CD68,4 ℃孵育過夜。切片洗滌后,滴加生物素標(biāo)記的二抗,室溫孵育1.5 h,洗滌,用鏈霉親和素-過氧化物酶封閉后,用DAB顯色液顯色,蘇木精襯染、脫水、透明、封片,拍照觀察。Image J軟件計(jì)算各組圖片的陽性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比,在分析過程中,各組取五張片子,每張片子取五個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)分析CD68的表達(dá)差異。

1.7 Western blot 實(shí)驗(yàn):取各組大鼠的右下肺組織,液氮下研磨成粉,RIPA裂解液提取蛋白,加入5×上樣緩沖液混勻,100 ℃煮沸5 min,上樣,進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),然后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,轉(zhuǎn)膜2 h,5%牛奶封閉1 h,加入一抗IRF5、Arg1、Notch1及β-actin抗體,4 ℃孵育過夜。TBST洗膜3次,辣根過氧化氫酶標(biāo)記的羊抗兔和羊抗鼠二抗室溫孵育1.5 h,TBST洗膜3次,ECL發(fā)光液顯色,G:Box凝膠成像系統(tǒng)拍照。

2 結(jié)果

2.1 槲皮素抑制LPS誘導(dǎo)的大鼠肺組織炎癥損傷:HE染色結(jié)果顯示,在SD大鼠中,LPS刺激肺組織24 h后,造成肺組織急性的炎癥損傷,肺泡壁增厚,肺泡腔發(fā)生炎癥浸潤,給予槲皮素后,肺泡腔的炎癥浸潤降低,肺泡壁厚度降低,見圖1(目錄后)。LPS刺激大鼠肺組織24 h后,肺組織濕干比值、炎癥因子腫瘤壞死因子(TNF-α)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)的mRNA表達(dá)增加,與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),給予槲皮素后,肺組織濕干比值及炎癥因子TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)降低,與脂多糖組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 槲皮素對LPS刺激大鼠肺組織濕干比和TNF-α、IL-1β的mRNA水平的影響

2.2 免疫組化染色觀察槲皮素對LPS刺激大鼠肺組織中CD68的表達(dá)影響:免疫組織化學(xué)方法染色肺泡巨噬細(xì)胞的標(biāo)志蛋白CD68,結(jié)果顯示,LPS刺激大鼠肺組織24 h后,肺組織中肺泡巨噬細(xì)胞浸潤,與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);給予槲皮素后,肺組織的巨噬細(xì)胞浸潤程度顯著降低,與脂多糖組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見圖2(目錄后)與表2。

表2 免疫組化染色中各組大鼠肺組織CD68陽性細(xì)胞的百分比分析

2.3 Western blot分析槲皮素對LPS刺激大鼠肺組織中IRF5、Arg1和Notch1蛋白表達(dá)的影響:IRF5對肺泡巨噬細(xì)胞的促炎表型有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用,Western blot結(jié)果顯示,LPS刺激大鼠肺組織24 h后,IRF5的表達(dá)增加,給予槲皮素后,IRF5的表達(dá)降低。巨噬細(xì)胞抗炎表型的標(biāo)志蛋白Arg1在LPS刺激24 h后表達(dá)降低,給予槲皮素后,Arg1蛋白表達(dá)上調(diào)。說明槲皮素可抑制肺組織巨噬細(xì)胞的促炎表型。此外,LPS刺激肺組織后,Notch1蛋白表達(dá)增加,腹腔注射給予槲皮素后,Notch1蛋白表達(dá)下降,結(jié)果表明槲皮素抑制了Notch1蛋白的表達(dá),見圖3(目錄后)和表3。

表3 槲皮素對LPS刺激的大鼠肺組織IRF5、Arg1、Notch1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

槲皮素是自然界廣泛存在的黃酮類化合物,具有抗炎、抗氧化應(yīng)激及抗纖維化的作用,很多研究表明針對不同的疾病動(dòng)物模型,槲皮素的保護(hù)作用機(jī)制不同。在四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化中,槲皮素可以抑制肝組織的炎癥和纖維化,其機(jī)制與抑制肝組織M1型巨噬細(xì)胞的激活有關(guān)[12]。在盲腸結(jié)扎穿孔引起的休克中,槲皮素可降低氧化應(yīng)激和炎癥對肺組織的損傷[13]。在小鼠腎損傷中,槲皮素可通過調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞M1/M2極化衰減腎損傷和纖維化[14]。本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,槲皮素可抑制肺組織炎癥浸潤、肺水腫及肺組織炎癥因子的表達(dá),抑制肺組織中肺泡巨噬細(xì)胞的浸潤和促炎表型可能與Notch1蛋白有關(guān)。

急性肺損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理過程,肺泡巨噬細(xì)胞在急性肺損傷的病理生理過程中發(fā)揮關(guān)鍵的免疫調(diào)節(jié)作用[15]。在急性肺損傷的炎癥反應(yīng)階段,肺泡巨噬細(xì)胞啟動(dòng)促炎的級聯(lián)反應(yīng)清理氣道和肺泡的病原菌,傳導(dǎo)固有免疫應(yīng)答,早期分泌的促炎因子如TNF-α、IL-1β可招募中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等。炎癥階段的肺泡巨噬細(xì)胞呈M1型,過度釋放NO和MMP會直接導(dǎo)致組織的損害,也可以通過過度招募中性粒細(xì)胞和TH17細(xì)胞間接擴(kuò)大組織損傷。在急性肺損傷的后期,肺損傷的修復(fù)機(jī)制被激活,伴隨著病原菌的清除,促炎信號的降低及促炎中性粒和巨噬細(xì)胞的清除,巨噬細(xì)胞由促炎的M1表型轉(zhuǎn)變?yōu)榭寡椎腗2表型,釋放TGF-β、IL-10等產(chǎn)物,促進(jìn)組織的修復(fù)[3,16]。本研究中,在LPS刺激大鼠肺組織后,CD68蛋白和IRF5蛋白表達(dá)上調(diào),Arg1蛋白表達(dá)下調(diào),肺組織的巨噬細(xì)胞發(fā)生浸潤及呈現(xiàn)促炎的表型,應(yīng)答肺組織的炎癥反應(yīng)。槲皮素抑制了CD68蛋白和IRF5蛋白表達(dá),促進(jìn)Arg1蛋白表達(dá),抑制了肺泡巨噬細(xì)胞的浸潤和促炎表型,進(jìn)一步抑制肺組織的炎癥損傷。

Notch信號通路廣泛存在于脊椎動(dòng)物和無脊椎動(dòng)物體內(nèi),研究表明,Notch信號途徑在免疫性疾病及炎癥性疾病中,對巨噬細(xì)胞的活化能夠發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[17]。在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎疾病中,抑制Notch通路的激活,可降低關(guān)節(jié)炎的M1型巨噬細(xì)胞,增加M2型巨噬細(xì)胞,減輕關(guān)節(jié)組織的損傷[18]。Notch信號在糖尿病的損傷修復(fù)的早期有關(guān)鍵作用,可調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞依賴的炎癥介質(zhì)產(chǎn)物[19]。在骨髓源的巨噬細(xì)胞(BMDM)中,Notch通路直接抑制信號調(diào)節(jié)蛋白α(SIRPα)的表達(dá),調(diào)控巨噬細(xì)胞的極化和吞噬作用[20]。本研究中,LPS刺激大鼠肺組織后,Notch1蛋白表達(dá)上調(diào),加劇了肺組織炎癥損傷,槲皮素抑制了Notch1蛋白的表達(dá),因此,槲皮素對大鼠急性肺損傷的保護(hù)作用可能與Notch1蛋白相關(guān),但具體機(jī)制需要進(jìn)一步研究。

綜上所述,LPS可誘導(dǎo)大鼠肺組織的急性肺損傷,肺組織發(fā)生水腫時(shí)炎癥因子TNF-α和IL-1β表達(dá)上調(diào),CD68蛋白上調(diào),肺組織巨噬細(xì)胞發(fā)生浸潤,促炎巨噬細(xì)胞標(biāo)志蛋白IRF5表達(dá)上調(diào),抑炎標(biāo)志蛋白Arg1表達(dá)下調(diào),肺部巨噬細(xì)胞呈現(xiàn)M1表型。給予槲皮素后,抑制了肺組織巨噬細(xì)胞的浸潤,促炎表型和肺組織炎癥損傷,因此槲皮素對大鼠急性肺損傷有保護(hù)作用。