李 霞,穆建梅,王志婕,閆小會(huì),馬瑞霞,陳曉平

鼻咽癌(NPC)是最常見(jiàn)的頭頸部腫瘤,在我國(guó)南方和東南亞地區(qū)尤為常見(jiàn)[1]。通常確診時(shí)已到晚期,其復(fù)發(fā)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有侵襲性,會(huì)危及鼻咽癌患者的生命。因此,明確引起鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展、復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子機(jī)制,包括疾病發(fā)生和轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物等至關(guān)重要。MicroRNAs(MiRNAs)是一類長(zhǎng)度在19-24nt的單鏈非編碼RNA,它們是轉(zhuǎn)錄后的mRNA負(fù)調(diào)控因子,通過(guò)與靶基因的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合而發(fā)揮作用,導(dǎo)致mRNA降解或翻譯抑制[2]。miRNAs調(diào)控超過(guò)三分之一的人類mRNAs,并且miRNA在某些癌癥中的表達(dá)失調(diào)[3]。miRNA的異常表達(dá)可導(dǎo)致靶基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的改變,并與多種癌癥的發(fā)生發(fā)展過(guò)程有關(guān),包括腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移[4]。miR-153-3p已在胃癌、乳腺癌、甲狀腺癌、卵巢癌等腫瘤中被深入報(bào)道[5-8],但鼻咽癌中miR-153-3p 與BCL2 基因的相互作用及其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞功能的影響尚未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道。本課題通過(guò)檢測(cè)miR-153-3p 對(duì)鼻咽癌6-10B細(xì)胞凋亡、增殖和周期的影響,探討其可能作用機(jī)制,以期為鼻咽癌發(fā)生和發(fā)展的分子機(jī)制提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料:收集2019年10月至2022年2月寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院鼻咽癌患者活檢癌組織標(biāo)本30例。

1.1.1 納入標(biāo)準(zhǔn):患者無(wú)癌癥疾病史;采樣前無(wú)化療或放療史。

1.1.2 排除標(biāo)準(zhǔn):患有其他鼻咽部疾病者;信息不全的患者;不同意被納入研究的患者。所有被采集的樣本均被告知并簽署知情同意書(shū),研究方案得到所在醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 試劑與儀器:人鼻咽癌細(xì)胞系6-10B、CNE1、CNE2、5-8F、C666-1、HNE-1和鼻咽上皮細(xì)胞NP69購(gòu)自ATCC細(xì)胞庫(kù)中國(guó)代理商-北納生物保藏庫(kù)。miRNA提取試劑盒購(gòu)自天根(生物)有限公司,總RNA提取TRIzol試劑購(gòu)自Ambion公司,cDNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和TB Green染料購(gòu)自TaKaRa公司,引物由生工生物工程(上海)股份有限公司設(shè)計(jì)并合成。miR-153-3p mimic(UUGCAGUCACAAAAGUGAUC)、inhibitor(GAUCACUUUUGUGACUAUGC AA)由上海吉瑪基因公司設(shè)計(jì)合成。CCK-8試劑盒購(gòu)自吉?jiǎng)P生物有限公司,細(xì)胞周期和凋亡(Muse Caspase-3/7)試劑盒均購(gòu)自密理博公司,熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Promega公司,蛋白抗體一抗和二抗均購(gòu)自Abcam公司。培養(yǎng)細(xì)胞所用血清購(gòu)自Gibco公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染:6-10B、CNE1、CNE2、5-8F、C666-1、HNE-1細(xì)胞在RPMI 1640 培養(yǎng)基中培養(yǎng),NP69在Keratinocyte-SFM培養(yǎng)基中培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為37℃,5% CO2的培養(yǎng)箱,用青鏈霉素雙抗加10% 胎牛血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)90%時(shí),用胰蛋白酶消化后離心(1 000 rpm,5 min),制成單細(xì)胞懸液,按照1∶4傳代培養(yǎng)。將對(duì)數(shù)期6-10B細(xì)胞接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,接種濃度為3×105個(gè)/孔,待細(xì)胞生長(zhǎng)至70%進(jìn)行轉(zhuǎn)染miR-153-3p mimic和inhibitor。轉(zhuǎn)染所用為lipofectamine 3000,轉(zhuǎn)染細(xì)胞分析miR-153-3p mimic組、對(duì)照組(mimic NC),inhibitor組及對(duì)照組(inhibitor NC),轉(zhuǎn)染量為4 μg,培養(yǎng)24～48 h后,收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 miR-153-3p及靶基因在鼻咽癌組織和細(xì)胞中表達(dá)量檢測(cè):通過(guò)miRNA提取試劑盒和總RNA提取試劑從鼻咽癌、鼻咽癌細(xì)胞株及轉(zhuǎn)染miR-153-3p的6-10B細(xì)胞中分別提取miRNA和總RNA,之后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行qPCR檢測(cè)(TB Green染料)。qPCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性10 s,59 ℃退火15 s,72 ℃延伸30 s,共循環(huán)40次。以U6或β-actin為內(nèi)參,采用2-ΔΔCT法分析目標(biāo)基因的表達(dá)情況。ΔΔCT=(實(shí)驗(yàn)組CT靶基因-實(shí)驗(yàn)組CT U6 或β-actin)-(對(duì)照組CT 靶基因-對(duì)照組CT U6 或β-actin)。設(shè)定2-ΔΔCT>2時(shí)表示為表達(dá)上調(diào),2-ΔΔCT<-2時(shí)表示為表達(dá)下調(diào)。引物詳細(xì)信息見(jiàn)表1。

表1 引物信息

1.5 6-10B細(xì)胞表型檢測(cè)

1.5.1 克隆形成能力:收集各轉(zhuǎn)染組鼻咽癌細(xì)胞6-10B,并用牛鮑計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù),接著將細(xì)胞密度稀釋到1×103個(gè)/mL,然后均勻接種至6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,在37 ℃、5% CO2的條件下于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)一周后(中間視細(xì)胞生長(zhǎng)情況進(jìn)行換液),吸去培養(yǎng)基,然后用PBS洗滌2～3次,用4%多聚甲醛固定30 min后用0.1%結(jié)晶紫染色30 min,洗滌后在顯微鏡下觀察、拍照并計(jì)數(shù)。

1.5.2 細(xì)胞增殖能力:將轉(zhuǎn)染后各組細(xì)胞計(jì)數(shù)后制成3×104個(gè)/mL的細(xì)胞懸液,接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(100 μL/孔),分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h 后按照CCK-8試劑盒說(shuō)明,每孔中加入CCK-8試劑10 μL,繼續(xù)培養(yǎng)30 min,用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)在450 nm處的光密度(OD)值,并繪制各組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.5.3 細(xì)胞周期:采用密理博多功能細(xì)胞分析儀MUSETM,用細(xì)胞周期試劑盒檢測(cè)各轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組6-10B 細(xì)胞的周期。收集各組6-10B 細(xì)胞200 μL(約1×106個(gè)/mL),于1.5 mL EP管中離心5 min,PBS清洗1次,加入200 μL提前冷藏的70%乙醇混勻,-20 ℃放置至少3 h,離心5 min PBS清洗1次,添加200 μL 的MUSE細(xì)胞周期液,混勻后在室溫條件下放置30 min,之后用MUSE多功能細(xì)胞分析儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.5.4 細(xì)胞凋亡:采用密理博多功能細(xì)胞分析儀MUSETM,用MUSE Casepase3/7細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)各組6-10B細(xì)胞凋亡情況。收集各組6-10B 細(xì)胞200 μL(5×105～1×106個(gè)/mL),配制Casepase3/7工作液(1∶8 PBS),準(zhǔn)備Casepase7-ADD工作液(2 μL 7-ADD和148 μL BA溶液),將5 μL Casepase3/7工作液加入至50 μL細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng)5 min,之后加入150μL 工作液7-ADD充分混勻,上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.6 檢測(cè)各分組6-10B中蛋白表達(dá)情況:收集各組6-10B細(xì)胞置于RIPA 溶液中,在冰上充分溶解,4 ℃離心20 min,取上清液,通過(guò)BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度。取20 μL總蛋白溶于SDS 上樣緩沖液,煮沸5 min 后,進(jìn)行10% SDS-PAGE,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5% 脫脂牛奶室溫下封閉1 h,PBS 洗膜3次后分別加入各蛋白抗體(均按1∶1 000的比例稀釋)4 ℃下過(guò)夜孵育。洗膜3 次后加入山羊抗兔二抗(1∶5 000)室溫下放置1 h。PBS 洗膜3 次,應(yīng)用化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)顯色并用凝膠成像儀顯影,用ImageJ 軟件分析蛋白條帶的灰度值。

2 結(jié)果

2.1 miR-153-3p在鼻咽癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào):qPCR法檢測(cè)結(jié)果顯示,與癌旁組織相比,miR-153-3p在鼻咽癌組織中表達(dá)水平顯著下調(diào)(P<0.05)。與正常鼻咽上皮細(xì)胞NP69相比,在鼻咽癌各細(xì)胞系中miR-153-3p的表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05),且在6-10B細(xì)胞中下調(diào)最明顯,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 上調(diào)miR-153-3p抑制鼻咽癌細(xì)胞6-10B增殖:轉(zhuǎn)染miR-153-3p mimic 和inhibitor后,qPCR 法檢測(cè)miR-153-3p表達(dá),與NC 組比較,轉(zhuǎn)染mimic組6-10B細(xì)胞中miR-153-3p 表達(dá)水平顯著上調(diào)(FC=6.88,P<0.05);inhibitor組miR-153-3p 表達(dá)水平顯著下調(diào)(FC=0.21,P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-153-3p mimic和inhibitor后檢測(cè)細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn),結(jié)果mimic組抑制克隆形成,inhibitor促進(jìn)克隆形成,與對(duì)照組NC比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖1(封二)。轉(zhuǎn)染miR-153-3p mimic和inhibitor后CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況,結(jié)果表明,miR-153-3p mimic抑制細(xì)胞增殖,inhibitor促進(jìn)細(xì)胞增殖,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),見(jiàn)圖2(封二)。

2.3 miR-153-3p高表達(dá)促進(jìn)鼻咽癌細(xì)胞6-10B凋亡:過(guò)表達(dá)miR-153-3p(mimic)用密理博的多功能細(xì)胞儀(MUSETM)檢測(cè)6-10B細(xì)胞凋亡(caspase3/7)情況,結(jié)果顯示mimic促進(jìn)凋亡,而抑制miR-153-3p后,抑制6-10B細(xì)胞凋亡,見(jiàn)圖3(封二)。之后用蛋白印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因BCL2、Bax、Caspase3和Casepase7,結(jié)果顯示BCL2在mimic組中表達(dá)下調(diào),在inhibitor組中表達(dá)上調(diào),而B(niǎo)ax、Caspase3、Casepase7在mimic組中表達(dá)上調(diào),在inhibitor組中表達(dá)下調(diào),見(jiàn)圖4(封二)。

2.4 miR-153-3p對(duì)鼻咽癌細(xì)胞6-10B周期的影響:轉(zhuǎn)染miR-153-3p mimic和inhibitor后用密理博的多功能細(xì)胞儀(MUSETM)做細(xì)胞周期實(shí)驗(yàn),mimic組促進(jìn)細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期。inhibitor細(xì)胞處于S期比例增多,見(jiàn)圖5(封二)。用Western Blotting檢測(cè)周期相關(guān)蛋白CDK1、CDK4和CDK6,CDK1在mimic組中表達(dá)下調(diào),在inhibitor組中表達(dá)上調(diào)。CDK4和CDK6在mimic組中表達(dá)上調(diào),在inhibitor組中表達(dá)下調(diào),見(jiàn)圖6(封二),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討論

越來(lái)越多的研究顯示,miR-153-3p參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。如miR-153-3p靶向IDO1調(diào)控肺癌細(xì)胞免疫抑制相關(guān)因子表達(dá)[9]。Jiang等[10]的研究顯示,在急性淋巴細(xì)胞白血病中,miR-153-3p表達(dá)水平下調(diào),通過(guò)抑制生長(zhǎng)蛋白2 的表達(dá)而起到抑癌的作用。也有研究顯示,miR-153-3p 通過(guò)靶向FZD3 調(diào)控胃癌SGC7901 細(xì)胞的增殖、侵襲與遷移[11]。因此,本研究探討了miR-153-3p通過(guò)靶向調(diào)控BCL2影響鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡和周期相關(guān)過(guò)程。

本研究發(fā)現(xiàn),miR-153-3p在鼻咽癌的組織和細(xì)胞系中的表達(dá)相比于正常組織和鼻咽上皮細(xì)胞均下調(diào),這與其他腫瘤研究結(jié)果一致,即miR-153-3p是抑制腫瘤增殖的,如在胃癌、肺癌、乳腺癌、白血病及食管鱗癌等中均有抑制作用[5,6,9-10,12]。miRNA在鼻咽癌的調(diào)控作用也有諸多報(bào)道,如miR-429及miR-200C相對(duì)表達(dá)量與鼻咽癌不同臨床病理分期有關(guān)[13];miR-106A-5p調(diào)控影響鼻咽癌惡性表型及調(diào)控機(jī)制[14]。但是miR-153-3p在鼻咽中的研究鮮有報(bào)道,本研究發(fā)現(xiàn),miR-153-3p能夠特異性結(jié)合BCL2基因,且負(fù)向調(diào)控該基因的表達(dá),故設(shè)計(jì)miR-153-3p過(guò)表達(dá)和抑制實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其對(duì)BCL2基因的調(diào)控作用,從而進(jìn)一步明確其對(duì)鼻咽癌細(xì)胞功能的影響。

本研究發(fā)現(xiàn),上調(diào)miR-153-3p能夠抑制BCL2基因的表達(dá),眾所周知BCL2基因在細(xì)胞凋亡過(guò)程中起負(fù)向調(diào)控作用[15],如果該基因表達(dá)水平受到抑制,細(xì)胞凋亡作用可能就會(huì)增強(qiáng)。故本研究檢測(cè)了細(xì)胞凋亡情況及凋亡相關(guān)的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示,上調(diào)miR-153-3p能夠促進(jìn)6-10B細(xì)胞凋亡,凋亡相關(guān)基因Bax、Caspase3和Casepase7表達(dá)呈下降趨勢(shì)與凋亡細(xì)胞結(jié)果一致。而B(niǎo)CL2蛋白表達(dá)隨著miR-153-3p上調(diào)受到抑制,說(shuō)明細(xì)胞凋亡受到miR-153-3p結(jié)合并負(fù)向調(diào)控BCL2影響。細(xì)胞增殖和遷移實(shí)驗(yàn)表明,上調(diào)miR-153-3p細(xì)胞增殖能力表現(xiàn)出被抑制,反之當(dāng)miR-153-3p表達(dá)受到抑制后細(xì)胞增殖能力會(huì)增強(qiáng)。以上結(jié)果表明,miR-153-3p能夠?qū)Ρ茄拾┘?xì)胞的增殖、凋亡和周期水平有明確的調(diào)控作用,說(shuō)明miR-153-3p在鼻咽癌發(fā)生、發(fā)展和復(fù)發(fā)過(guò)程中具有關(guān)鍵性作用。對(duì)其深入研究有望在鼻咽癌的診斷、治療和預(yù)后方面起到一定的積極作用。

本研究顯示上調(diào)miR-153-3p,促進(jìn)細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期,當(dāng)miR-153-3p受到抑制后細(xì)胞處于S期較多,說(shuō)明細(xì)胞增殖活躍,這與上述細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果表現(xiàn)一致,凋亡期細(xì)胞增殖活性降低,細(xì)胞由G2期進(jìn)入M期。CDK1也是調(diào)控細(xì)胞周期的重要分子,miR-153-3p上調(diào),可促進(jìn)CDK1的表達(dá)。miRNA一般通過(guò)結(jié)合靶基因3′UTR 區(qū)并負(fù)向調(diào)控其表達(dá)的方式影響其在機(jī)體內(nèi)的表達(dá)水平,從而影響細(xì)胞的各種生理過(guò)程[16]。研究結(jié)果表明,miR-153-3p 能夠通過(guò)結(jié)合BCL2基因3′UTR 區(qū)域而抑制BCL2 mRNA 和蛋白的表達(dá),從而影響鼻咽癌細(xì)胞凋亡。

綜上所述,本研究初步探討了miR-153-3p在調(diào)控鼻咽癌細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞周期過(guò)程中的作用,明確了miR-153- 3p通過(guò)調(diào)控BCL2基因來(lái)影響細(xì)胞相關(guān)功能。本研究為闡明鼻咽癌的發(fā)病機(jī)制和臨床預(yù)后提供了參考,為進(jìn)一步探究鼻咽癌的防治提供了新的思路。