李倩慧， 平仙娥

（上海市嘉定區(qū)安亭醫(yī)院，上海 201805）

胃癌在世界范圍內(nèi)被列為第5位最常見的癌癥和第3 位最致命的疾病[1]。盡管過去幾十年在胃癌治療方面取得了重大進(jìn)展，但胃癌患者的存活率仍然很低[2-5]。中藥在治療癌癥方面取得了很大進(jìn)展[6-9]。黃芪為豆科植物蒙古黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge. var.mongholicus（Bge.）Hsiao 或膜莢黃芪Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，味甘，性微溫，歸肺、脾經(jīng)，具有補(bǔ)氣升陽、固表止汗、利水消腫、生津養(yǎng)血、行滯通痹、托毒排膿、斂瘡生肌的功效，用于氣虛乏力、食少便溏、中氣下陷、久瀉脫肛、便血崩漏、表虛自汗、氣虛水腫、內(nèi)熱消渴、血虛萎黃、痹痛麻木、癰疽難潰、久潰不斂等病癥。黃芪已被證明在治療胃癌方面具有一定的療效[10]。毛蕊異黃酮（calycosin，Caly）是黃芪干燥根中的一種脂溶性成分，具有抗氧化、抗炎和抗癌特性[11-12]。既往研究報(bào)道，毛蕊異黃酮對結(jié)直腸癌[13]、胰腺癌[14]、肝癌[15]等具有抑制作用。有研究發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS凋亡[16]?；诖耍狙芯恐荚谔剿髅锂慄S酮對胃癌細(xì)胞AGS 增殖、遷移和侵襲的調(diào)控機(jī)制，以期為臨床上胃癌的治療提供新的思路，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞人胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS，購自美國ATCC中心。

1.2 藥物、試劑與儀器毛蕊異黃酮（分子量284.26，分子式為C16H12O5），美國MedChemExpress公司生產(chǎn)，批號為20575-57-9，使用DMSO 作為溶劑；MHY1485 哺乳動(dòng)物[雷帕霉素靶蛋白（mTOR）激活劑]，美國MedChemExpress 公司生產(chǎn)。DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；四甲基偶氮唑鹽（MTT）液（美國Sigma 公司）；JC-1 熒光探針（美國Abcam公司）；Beclin-1（1∶2 000，52 kDa），LC3Ⅰ、LC3Ⅱ（1∶2 000，16、14 kDa），p-mTOR（1∶2 000，289 kDa），GAPDH（1∶500，37 kDa）等抗體及辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（1∶5 000）（美國Abcam公司）。Transwell小室（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；TE-2000 熒光顯微鏡（日本Nikon公司）。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及處理AGS 細(xì)胞以含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素溶液的DMEM 培養(yǎng)基，于5%CO237 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，2 ～3 d 后更換1 次營養(yǎng)培養(yǎng)基，使用胰蛋白酶-EDTA 溶液進(jìn)行細(xì)胞傳代以獲得75%～80%的融合度。

1.4 細(xì)胞分組細(xì)胞分組如下：AGS 組（空白對照組），未進(jìn)行任何處理，正常培養(yǎng)的AGS 細(xì)胞；AGS+Caly組（實(shí)驗(yàn)治療組），將50 μmol/L毛蕊異黃酮[16]加入培養(yǎng)基，孵育24 h；AGS+DMSO 組（陰性對照組），使用相同劑量的DMSO 加入細(xì)胞培養(yǎng)基，孵育24 h；AGS+Caly+MHY1485組（MHY1485處理組），將50 μmol/L 毛蕊異黃酮及5 μmol/L MHY1485[17]加入細(xì)胞培養(yǎng)基，孵育24 h； AGS+Caly+DMSO組（MHY1485陰性對照組），將50 μmol/L毛蕊異黃酮及相同劑量的DMSO 加入細(xì)胞培養(yǎng)基，孵育24 h。

1.5 觀察指標(biāo)與方法

1.5.1 MTT分析 將人胃癌AGS細(xì)胞均勻接種于96 孔培養(yǎng)板中，每孔細(xì)胞數(shù)為3 000 ～4 000 個(gè)。將各組AGS 細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h 后，每孔加20 μL MTT 液繼續(xù)于37 ℃5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h，終止培養(yǎng)，棄去培養(yǎng)液。每孔再加入DMSO 150 μL，輕勻搖動(dòng)10 min，促進(jìn)結(jié)晶溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀上于495 nm 波長處測定各孔的吸光度（OD）值，分析細(xì)胞增殖能力。

1.5.2 Transwell 遷移及侵襲實(shí)驗(yàn) Transwell 小室放入24 孔板中，下室加入500 μL 含20%FBS 的培養(yǎng)基。胰酶消化處于對數(shù)生長期的細(xì)胞，PBS或無血清的培養(yǎng)基洗3次后，重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，并將細(xì)胞濃度調(diào)為2×105個(gè)/μL，吹打混勻后取500 μL 加入Transwell 小室的上室。注意小室上下室之間不要有氣泡。把24 孔板放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。20 h后，取出Transwell小室，吸干上室液PBS洗一遍，移到預(yù)先加入約800 μL 甲醇或多聚甲醛的孔中，室溫固定30 min。30 min后，用PBS清洗2 遍小室，加入800 μL 結(jié)晶紫染液室溫避光染色15 ～30 min。染完色后，用雙蒸水輕輕洗滌浸泡數(shù)次，直至把染色液的顏色洗去。吸棄上室液體，用濕棉棒小心擦干凈上室底部膜表面上的細(xì)胞。顯微鏡下拍照，在20倍鏡下隨機(jī)選擇10個(gè)視野拍照并計(jì)數(shù)每張照片中的細(xì)胞，取平均數(shù)來做統(tǒng)計(jì)分析。侵襲實(shí)驗(yàn)中需預(yù)先用基質(zhì)膠包被小室上室，其余步驟同遷移實(shí)驗(yàn)。

1.5.3 線粒體膜電位（MMP）測定 使用JC-1 熒光探針測量細(xì)胞的MMP。將細(xì)胞與5 μmol/L JC-1于37 ℃暗室中孵育30 min，PBS 洗滌后，應(yīng)用熒光顯微鏡檢測細(xì)胞圖像。

1.5.4 Western Blot法檢測細(xì)胞Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-mTOR 表達(dá) 待測細(xì)胞以預(yù)冷的PBS 緩沖液沖洗3 次后加入RIPA 裂解液中裂解，以12 000g離心10 min，吸取上清用BCA法測定蛋白濃度。電泳先用60 V，待進(jìn)入分離膠后改用120 V。電泳結(jié)束后，用電轉(zhuǎn)移法將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯（PVDF）膜上。取PVDF 膜，5%脫脂牛奶-TBST 封閉，室溫下孵育1 ～2 h。封閉結(jié)束后，將膜置于孵育盒中，分別加入一抗Beclin-1、LC3Ⅰ、LC3Ⅱ、p-mTOR和GAPDH，4 ℃孵育過夜，TBST洗3 次，每次10 min；加入HRP 標(biāo)記的山羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min。進(jìn)行化學(xué)發(fā)光，X 光片壓片、顯影、定影，數(shù)據(jù)分析。內(nèi)參為GAPDH。

1.6 統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 21.0（IBM，Armonk，NY，USA）軟件和GraphPad Prism 8.0.1（La Jolla，CA，USA）軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析及作圖。計(jì)量結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，2組之間的比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組之間的比較采用單因素方差（One-way analysis of variance）檢驗(yàn)，事后檢驗(yàn)采用Tukey’s多重比較檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 毛蕊異黃酮抑制AGS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲本研究中選取50 μmol/L 毛蕊異黃酮對AGS細(xì)胞進(jìn)行處理。MTT 法檢測細(xì)胞增殖，結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮具有顯著下調(diào)AGS 細(xì)胞增殖能力（P＜0.01）。見圖1-A。Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮顯著下調(diào)AGS 細(xì)胞遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)（P＜0.01 或P＜0.001）。見圖1-B。以上結(jié)果表明，毛蕊異黃酮可抑制AGS 細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

圖1 毛蕊異黃酮（Caly）抑制AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲Figure 1 Calycosin inhibited proliferation，migration and invasion of AGS cells

2.2 毛蕊異黃酮改善AGS細(xì)胞線粒體功能線粒體功能和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性直接影響腫瘤細(xì)胞的能量供應(yīng)[18]。采用JC-1 法檢測線粒體膜電位（MMP），結(jié)果可見，JC-1 紅色熒光強(qiáng)度在毛蕊異黃酮的處理后顯著上升，而綠色熒光強(qiáng)度顯著下降，同時(shí)顯示毛蕊異黃酮能顯著提升AGS 細(xì)胞線粒體膜電位（P＜0.001）。見圖2。表明毛蕊異黃酮可改善AGS細(xì)胞線粒體功能。

2.3 毛蕊異黃酮誘導(dǎo)AGS細(xì)胞自噬通過Western Blot 法檢測自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin-1的結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮能顯著提升AGS細(xì)胞LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1 表達(dá)水平（均P＜0.01）。見圖3。表明毛蕊異黃酮可誘導(dǎo)AGS 細(xì)胞自噬。

圖3 毛蕊異黃酮（Caly）誘導(dǎo)AGS細(xì)胞自噬Figure 3 Calycosin induced autophagy in AGS cells

2.4 毛蕊異黃酮通過抑制mTOR 通路抑制AGS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲采用Western Blot 分析表明，與對照條件相比，毛蕊異黃酮處理顯著降低AGS 細(xì)胞mTOR 的磷酸化表達(dá)水平（P＜0.001），而添加MHY1485（mTOR 激活劑）使毛蕊異黃酮處理的AGS 細(xì)胞p-mTOR 磷酸化表達(dá)水平顯著上升（P＜0.01）。見圖4-A。此外，通過Western Blot 發(fā)現(xiàn)，添加mTOR激活劑顯著下調(diào)了毛蕊異黃酮處理的AGS 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值及Beclin-1表達(dá)水平，顯著升高了毛蕊異黃酮處理的AGS 細(xì)胞增殖能力與遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖4-B ～D。以上結(jié)果提示，mTOR信號通路參與了毛蕊異黃酮誘導(dǎo)的自噬發(fā)生，毛蕊異黃酮通過抑制mTOR 通路抑制AGS細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

圖4 毛蕊異黃酮（Caly）通過抑制mTOR通路抑制AGS細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲Figure 4 Calycosin inhibited AGS cell proliferation，migration and invasion through inhibition of mTOR pathway

3 討論

細(xì)胞凋亡在癌癥治療中發(fā)揮著重要作用[19-20]。近年來，自噬作為一種與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)但又截然不同的2型程序性細(xì)胞死亡途徑，已成為腫瘤研究的熱點(diǎn)[14]。自噬在腫瘤發(fā)生和癌癥進(jìn)展中起雙重作用，可能會增強(qiáng)或抑制癌癥的治療效果[21-22]。自噬是一個(gè)嚴(yán)格調(diào)控的過程，它去除細(xì)胞溶質(zhì)成分或受損的細(xì)胞器，該過程始于自噬體的雙膜囊泡的形成[23]，隨后，自噬體融合并將其貨物運(yùn)送到溶酶體進(jìn)行降解和回收。自噬最初被認(rèn)為是一個(gè)隨機(jī)過程，現(xiàn)在則被認(rèn)為是一種由壓力或環(huán)境變化特別激活的適應(yīng)性反應(yīng)[24]。

自噬作為正常細(xì)胞中的腫瘤抑制機(jī)制，這一過程的失調(diào)（即Beclin-1及LC3蛋白的失調(diào)）可導(dǎo)致惡性轉(zhuǎn)化和癌變[25-26]。本研究采用Western Blot 分析發(fā)現(xiàn)，毛蕊異黃酮可顯著提升自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ及Beclin-1 的表達(dá)水平，促進(jìn)AGS 細(xì)胞中LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)AGS細(xì)胞自噬。

線粒體被認(rèn)為是自噬的重要調(diào)節(jié)劑，有助于自噬的促生存功能，例如興奮、對毒素和其他壓力源的適應(yīng)性反應(yīng)[27]。本研究對線粒體膜電位（MMP）進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮能顯著提升線粒體膜電位，表明毛蕊異黃酮可改善AGS細(xì)胞線粒體功能，進(jìn)而促進(jìn)AGS細(xì)胞自噬。

自噬受2個(gè)主要營養(yǎng)感應(yīng)途徑控制：mTOR 和AMPK 信號傳導(dǎo)[28]。mTOR 通常在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)以抑制自噬[29]。一旦被激活，mTOR 通過下游效應(yīng)子的磷酸化調(diào)節(jié)線粒體功能。本研究結(jié)果顯示，毛蕊異黃酮可以促進(jìn)AGS 細(xì)胞自噬，抑制pmTOR 的表達(dá)，進(jìn)而降低胃癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲程度，而添加mTOR激活劑逆轉(zhuǎn)了這些作用效果提示毛蕊異黃酮可通過抑制mTOR通路發(fā)揮抗胃癌作用磷酸化進(jìn)而抑制自噬。

綜上所述，本研究在細(xì)胞層面探究了毛蕊異黃酮的抗胃癌機(jī)制，發(fā)現(xiàn)毛蕊異黃酮可通過抑制mTOR 活化并促進(jìn)自噬發(fā)生，進(jìn)而抑制胃癌細(xì)胞AGS的增殖、遷移和侵襲。