李亞雄 馬學(xué)曉 常勝 魏嘉豪 劉勇

(青島大學(xué)附屬醫(yī)院脊柱外科,山東 青島 266035)

椎間盤退變(IDD)是引起腰痛的主要原因[1]。炎癥反應(yīng)是IDD發(fā)生的重要病理機制。IDD發(fā)生初期,髓核組織和纖維環(huán)發(fā)生局部炎癥,這種初級炎癥反應(yīng)有利于組織細胞的自我修復(fù),當炎癥的發(fā)展失去可控性,內(nèi)源性細胞持續(xù)上調(diào)多種促炎因子,如白細胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等[2],這些因子被認為是激活巨噬細胞炎性小體的上游信號,可阻止巨噬細胞抗炎表型的極化[3]。上述過程導(dǎo)致基質(zhì)金屬蛋白酶激活、生長因子表達下調(diào)以及膠原蛋白、多聚糖蛋白降解等一系列級聯(lián)反應(yīng),最終引起髓核細胞(NPCs)的炎癥和凋亡,加速椎間盤退變[4]。

IL-1受體1(IL1R1)在不同人類及小鼠細胞類型中表達豐度低,但具有較高親和性[5]。椎間盤退變期炎性微環(huán)境內(nèi)以IL-1β為主的炎癥因子升高,IL-1β與IL1R1結(jié)合使其構(gòu)象發(fā)生改變,產(chǎn)生強烈的促炎信號,加速NPCs的凋亡[6]。miRNA是長度約為20～25個核苷酸序列的內(nèi)源性非編碼RNA,通過與靶基因結(jié)合,從而抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄以及翻譯[7]。大多數(shù)miRNAs在各動物物種中作為關(guān)鍵生物通路和過程的調(diào)節(jié)器,在進化中起重要作用[8]。miR-663b在腫瘤及炎性相關(guān)疾病中研究比較多,有研究發(fā)現(xiàn)miR-663b主導(dǎo)的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與了脂多糖誘導(dǎo)的支氣管上皮炎癥改變的關(guān)鍵調(diào)控過程[9]。YU等[10]發(fā)現(xiàn)miR-663b在缺氧引起的心肌細胞初期炎癥調(diào)控中發(fā)揮著重要作用。本研究旨在探究miR-663b在減緩NPCs炎癥及凋亡中的作用,為IDD臨床治療策略提供新思路。

1 材料與方法

1.1 樣本收集

收集2021年9月—2022年5月于我院行椎間孔鏡下腰椎間盤切除術(shù)的24例IDD患者的椎間盤髓核組織標本?；颊吣?1例,女13例;年齡25～59歲。排除標準:①哺乳期、妊娠期婦女;②合并急、慢性感染疾病者;③合并腫瘤者;④同時患有全身免疫性疾病或其他全身疾病者。

1.2 材料與試劑

F12/DMEM培養(yǎng)基、青/鏈霉素(1∶1)混合液、Ⅱ型膠原酶購自北京索萊寶有限公司,IL-1β購自美國MCE公司,RNeasyTM試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量擴增試劑盒購自南京諾唯贊有限公司,miRNA-663b mimic、mimic NC購自廣州銳博生物科技有限公司,293T細胞購自武漢普諾賽科技有限公司,SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自上海雅酶有限公司,抗IL1R1一抗購自武漢Abclonal生物科技公司,HRP-山羊抗兔二抗購自上海愛必信有限公司,雙熒光素酶試劑盒、CCK-8細胞增殖檢測試劑盒購自上海翌圣有限公司,TUNEL凋亡檢測試劑盒購自武漢伊萊瑞特有限公司。

1.3 細胞分離與培養(yǎng)

將手術(shù)取出的髓核組織立即用裝有組織保存液的冰盒轉(zhuǎn)移至試驗臺,PBS沖洗后用組織剪充分剪碎,按照髓核組織體積的3倍加入0.2%Ⅱ型膠原酶溶液37 ℃下在恒溫搖床中200 r/min消化4～6 h;采用70 μm細胞濾篩過濾細胞,以800 r/min離心5 min。棄上清液,加入5 mL含0.10 mL胎牛血清和0.01 mL的青霉素/鏈霉素(1∶1)的DMEM,重懸細胞后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中,并于37 ℃、含體積分數(shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),每3 d換液1次,待NPCs傳至第2代,且細胞融合度約90%時用于后續(xù)實驗。

1.4 NPCs炎癥模型構(gòu)建

將二代NPCs按每孔約5×104個細胞接種至6孔板中,鋪板培養(yǎng)24 h,在顯微鏡下觀察細胞的密度為80%左右時,按照0、5、10、20 μg/L濃度梯度加入IL-1β,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,通過RT-qPCR檢測不同IL-1β濃度下NPCs miR-663b的表達情況,以此選擇最佳處理濃度。隨后按最佳濃度處理NPCs 0、12、24、48 h,再次RT-qPCR檢測NPCs中miR-663b表達情況,從而選擇最佳處理時間。后續(xù)實驗均采用該NPCs炎癥模型進行。

1.5 NPCs分組及處理

將二代NPCs分為A、B、C、D組,分別按每孔約5×104個細胞接種至6孔板中。其中A組無任何處理,B組僅IL-1β誘導(dǎo)處理,C組IL-1β誘導(dǎo)+miR-663b mimic轉(zhuǎn)染,D組IL-1β誘導(dǎo)+miR-663b mimic NC轉(zhuǎn)染。

1.6 RT-qPCR法檢測A～D組NPCs miR-663b轉(zhuǎn)染效率及TNF-α、IL-6、IL-1β、Ⅱ型膠原蛋白、多聚糖蛋白基因的表達水平

使用RNeasyTM試劑盒分別提取A～D組二代NPCs的RNA,加入miR-663b逆轉(zhuǎn)錄引物(表1),按照miRNA以及mRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書中要求合成第一鏈cDNA,隨后分別按照miRNA以及mRNA熒光定量擴增試劑盒說明書的要求進行定量擴增,每組分別設(shè)置2個復(fù)孔。反應(yīng)體系為:10 μL 的SYBR qPCR-Mix,0.4 μL的10 μmol/L前引物,0.4 μL的10 μmol/L后引物,1 μL模板,7.2 μL ddH2O。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;然后95 ℃ 3 s,60 ℃ 30 s,總共進行40次循環(huán)。miR-663b測定反應(yīng)條件為:95 ℃預(yù)變性5 min;然后95 ℃ 10 s,60 ℃ 30 s,共進行40次循環(huán)。以U6和GAPDH分別作為miRNA和mRNA的內(nèi)對照,以2-△△CT法計算基因的相對表達量,每組實驗重復(fù)3次,結(jié)果取均值。

表1 引物名稱及其序列

1.7 免疫印跡法檢測A～D組NPCs IL1R1的相對表達量

使用移液槍吸除A～D組二代NPCs的培養(yǎng)液,并用PBS輕柔沖洗3次。使用加有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液,在碎冰上提取各處理組中NPCs蛋白[11]。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度,每孔上樣20 μg蛋白,在含有150 g/L分離膠和50 g/L濃縮膠的SDS-PAGE凝膠中電泳分離,先恒壓80 V電泳30 min,后調(diào)整電壓至120 V,電泳1 h。隨后在冰上將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,轉(zhuǎn)膜電流300 mA,時間2 h。用TBST漂洗3次PVDF膜后浸泡在脫脂牛奶中封閉2 h。封閉結(jié)束后TBST漂洗3次,在4 ℃條件下與一抗孵育過夜。第2天回收一抗,加入辣根過氧化物酶標記過的二抗,室溫下孵育2 h。二抗孵育結(jié)束后,用TBST漂洗條帶3次,隨后滴加增強型特敏發(fā)光液進行顯影并拍照,以β-actin作為內(nèi)參照,使用Image J軟件對條帶灰度值進行分析,IL1R1蛋白的相對表達量以IL1R1蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值計算。

1.8 CCK-8法檢測A～D組NPCs的增殖情況

將A～D組二代NPCs重懸并接種于96孔板中,密度為每孔約2×103個細胞,培養(yǎng)3 d后在相應(yīng)孔中加入CCK-8試劑,繼續(xù)在37 ℃下孵育2.5 h,然后用酶標儀測定波長450 nm處的吸光度(A)值,細胞活性用A值表示。

1.9 TUNEL染色法檢測A～D組NPCs凋亡情況

在4 ℃條件下將A～D組二代NPCs爬片浸入40 g/L的多聚甲醛溶液中,固定20 min,隨后PBS漂洗3次,使用0.2%的TritonX-100通透液浸泡5 min,PBS漂洗后加入適量凋亡檢測液放入濕盒中,37 ℃下孵育60 min。加入DAPI,室溫避光孵育8 min,PBS沖洗,加抗淬滅劑封片。在熒光顯微鏡下觀察,所有細胞核呈藍色,TUNEL染色陽性細胞(發(fā)生凋亡細胞)呈紅色,細胞凋亡情況用凋亡率表示(凋亡率=陽性細胞數(shù)/總細胞數(shù))。

1.10 雙熒光素酶報告基因檢測及分析

在TargetScanHuman 7.1以及miRbase生物信息數(shù)據(jù)庫中篩選并且鑒定miR-663b的靶基因IL1R1[12],將IL1R1 3′端非翻譯區(qū)(UTR)基因片段插入pGL3 promoter載體,并參考IL1R1-野生型(wt)基因序列設(shè)計出IL1R1-突變型(mut)基因序列,同樣嵌入質(zhì)粒中進行擴增,載體的構(gòu)建由上海唯問生物科技有限公司完成。將購自普諾賽科技有限公司生長良好293T細胞按實驗需求分別轉(zhuǎn)染IL1R1-3′UTR-wt質(zhì)粒+miR-663b mimic(E組)、IL1R1-3′UTR-wt質(zhì)粒+miR-663b mimic NC(F組)、IL1R1-3′UTR-mut質(zhì)粒+miR-663b mimic(G組)、IL1R1-3′UTR-mut質(zhì)粒+miR-663b mi-mic NC(H組),轉(zhuǎn)染24 h后,收集細胞并裂解。使用雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)測定各組細胞熒光素酶活性,以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參照。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 NPCs炎癥模型構(gòu)建

以0、5、10、20 μg/L的IL-1β處理后,各濃度下NPCs miR-663b相對表達量分別為1.00±0.01、0.63±0.05、0.32±0.68、0.36±0.61,組間比較有顯著差異(F=108.20,P<0.01),但10、20 μg/L濃度間無顯著差異(t=0.66,P>0.05),故確定10 μg/L為IL-1β最佳處理濃度。以IL-1β分別處理0、12、24、48 h后,不同處理時長NPCs miR-663b相對表達量分別為1.00±0.01、0.60±0.14、0.51±0.09、0.45±0.06,組間相比較有顯著差異(F=24.33,P<0.01),但是24 h較48 h無顯著差異(P>0.05),因此后續(xù)實驗選擇濃度10 μg/L的IL-1處理24 h構(gòu)建NPCs炎癥模型。

2.2 miR-663b對A～D組NPCs中TNF-α、IL-6、IL-1β、Ⅱ型膠原蛋白和多聚糖蛋白基因表達影響

RT-qPCR結(jié)果顯示,miR-663b在4組中表達量比較差異有顯著性(F=141.30,P<0.01),C組與其他組比較miR-663b表達量均顯著性升高(t=9.41～22.93,P<0.01)。4組中炎癥因子基因表達比較均有顯著差異(F=20.27～125.70,P<0.01),與B、D組相比,C組TNF-α、IL-6、IL-1β基因相對表達量均明顯降低(t=3.17～32.51,P<0.01),A組亦降低(t=12.58～23.11,P<0.01);B、D組相比無顯著差異(P>0.05)。4組中Ⅱ型膠原蛋白及多聚糖蛋白基因表達差異有顯著性(F=14.96、30.02,P<0.01),與B、D組相比,C組Ⅱ型膠原蛋白、多聚糖蛋白基因相對表達量均顯著升高(t=4.09～6.47,P<0.01),A組亦升高(t=3.27～3.96,P<0.01);B、D組相比則無顯著差異(P>0.05)。見表2。

表2 各組miR-663b及炎癥因子、Ⅱ型膠原蛋白、多聚糖蛋白基因的相對表達量比較

2.3 miR-663b對A～D組NPCs增殖及凋亡影響

CCK-8實驗結(jié)果顯示,A～D組二代NPCs培養(yǎng)3 d以后細胞活性值分別為1.66±0.17、1.16±0.13、1.45±0.02、1.10±0.01,4組細胞活性值比較差異有顯著性(F=16.97,P<0.05);與B、D組相比,C組細胞活性值均顯著升高(t=3.14、3.96,P<0.01),A組細胞活性值亦升高(t=3.18、3.21,P<0.01);B、D組相比無顯著差異(P>0.05)。

TUNEL染色結(jié)果顯示,A～D組中二代NPCs凋亡率分別為0.96±0.05、4.20±0.03、1.10±0.01、4.06±0.05,4組NPCs凋亡率比較差異有顯著性(F=7 030.00,P<0.01)。與B、D組相比,C組細胞凋亡率均顯著降低(t=4.28、168.61,P<0.01),A組細胞凋亡率亦降低(t=3.68、100.04,P<0.01);B、D組相比無顯著差異(P>0.05)。

2.4 miR-663b對A～D組NPCs中IL1R1基因及蛋白相對表達量的影響

RT-qPCR結(jié)果顯示,A～D組中IL1R1基因相對表達量分別為0.71±0.06、1.39±0.17、0.27±0.08、1.20±0.08,4組NPCs的IL1R1相對表達量比較差異有顯著性(F=62.21,P<0.01);與B、D組相比,C組IL1R1相對表達量顯著降低(t=6.48、12.84,P<0.01),A組IL1R1相對表達量顯著降低(t=5.18、10.07,P<0.01);B、D組相比無顯著差異(P>0.05)。

免疫印跡法結(jié)果示,A～D組IL1R1蛋白相對表達量分別為0.26±0.01、0.45±0.02、0.30±0.03、0.51±0.02,4組比較差異有顯著性(F=82.11,P<0.01),與B、D組相比,C組IL1R1相對表達量顯著降低(t=6.39、9.69,P<0.01),A組IL1R1相對表達量亦顯著降低(t=12.34、19.51,P<0.01);B、D組相比無顯著差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 4組NPCs免疫印跡檢測結(jié)果

2.5 E～H組NPCs的雙熒光素酶活性分析結(jié)果

雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灲Y(jié)果顯示,E～H組的熒光酶活性值分別為28.90±1.25、45.66±2.43、41.54±1.23、45.54±1.26,4組比較差異具有顯著性(F=71.07,P<0.01)。E組與其他3組比較熒光酶活性值顯著降低(t=10.62～16.27,P<0.01),其余3組兩兩比較均無顯著差異(P>0.05)。

3 討 論

髓核組織位于脊柱纖維環(huán)中心,上下終板之間,是維持椎間盤平衡以及穩(wěn)態(tài)必不可少的組分[13]。NPCs表型發(fā)生改變、促炎遞質(zhì)表達上調(diào)、活性細胞數(shù)量減少及細胞外基質(zhì)含量下降被認為是IDD發(fā)生的主要病理特征,上述病理特征也導(dǎo)致了局部細胞微環(huán)境的改變,此類改變可以進展到IVD結(jié)構(gòu)和功能的損害[14]。炎癥因子的升高是推動這一級聯(lián)事件的關(guān)鍵因素[15],因此抑制NPCs炎癥反應(yīng)和凋亡是治療IDD的重要策略。

既往研究發(fā)現(xiàn),退變椎間盤組織中IL-1β水平顯著升高參與了IDD的多個病理過程[16-17]。IL-1β引起基質(zhì)生物學(xué)改變是IDD的特征[18-19]。IL1R1作為一種重要的免疫調(diào)節(jié)因子,在參與自身炎癥反應(yīng)和調(diào)節(jié)免疫平衡方面發(fā)揮著重要作用,而IL1R1對于所有IL-1β介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)事件都是必不可少的[20]。IL-1β與IL1R1結(jié)合在蛋白輔酶協(xié)助下誘導(dǎo)活性蛋白磷酸化,最終導(dǎo)致NF-κB激活,加劇細胞炎癥和凋亡。隨著分子芯片技術(shù)和微陣點分析技術(shù)的發(fā)展,越來越多證據(jù)表明miRNA在細胞分化、增殖和生存中發(fā)揮核心作用。近年來,miRNA被發(fā)現(xiàn)在介導(dǎo)細胞增殖和凋亡、炎癥反應(yīng)以及細胞外基質(zhì)降解等方面具有廣泛作用,眾多研究者將miRNA如何有效阻斷NPCs凋亡作為緩解IDD的研究重點[21]。JI等[22]從臨床數(shù)據(jù)集的miRNA芯片分析及體內(nèi)外實驗中證實,miR-141通過與SIRT1/NF-κB通路相互作用,一定程度上促進IDD進展。DU等[23]研究發(fā)現(xiàn)抑制miR-133a-5p表達或增加FBXO6表達可能是治療IDD的有效策略。

本研究顯示,miR-663b在IL-1β構(gòu)建的NPCs炎癥模型中表達下調(diào),且呈劑量和時間依賴性。在證明了miR-663b在IL-1誘導(dǎo)的NPCs炎癥模型中表達下調(diào)后,本研究進一步探究了過表達miR-663b是否可以緩解NPCs炎癥和改善細胞基質(zhì)成分的表達。實驗表明,過表達miR-663b的C組相比較于其他組,TNF-α、IL-6、IL-1β的表達被明顯抑制,而Ⅱ型膠原蛋白以及多聚糖蛋白基因的相對表達量明顯增高,這些結(jié)果均表明miR-663b在IL-1β刺激NPCs細胞的炎癥反應(yīng)中起保護作用。本研究CCK8法及TUNEL染色結(jié)果顯示,C組相比較于其他組NPCs活性顯著上升,NPCs凋亡率顯著下降,上述結(jié)果表明miR-663b可以有效減緩NPCs炎癥反應(yīng),改善細胞基質(zhì)分子的降解及NPCs的凋亡。另外,生物信息庫分析及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實miR-663b的下游靶點基因是IL1R1,說明了miR-663b通過抑制IL1R1表達,起到了減緩NPCs炎癥反應(yīng)的作用。以上均表明miR-663b在IDD的進展中發(fā)揮重要作用,為探索IDD的病理機制提供了新的研究方向。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)miR-663b可以通過與IL1R1靶向結(jié)合下調(diào)IL1R1表達,從而減緩NPCs炎癥反應(yīng)和凋亡進程,miR-663b及其抗炎機制或可為IDD研究提供更多理論基礎(chǔ)。

倫理批準和知情同意：本研究涉及的所有試驗均已通過青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審核批準(文件號QYFYWELL27201)。所有試驗過程均遵照《涉及人的生物醫(yī)學(xué)研究倫理審查辦法》的條例進行。受試對象或其親屬已經(jīng)簽署知情同意書。

作者聲明：李亞雄、馬學(xué)曉、劉勇參與了研究設(shè)計;李亞雄、常勝、魏嘉豪參與了論文的寫作和修改。所有作者均閱讀并同意發(fā)表該論文。所有作者均聲明不存在利益沖突。