崔夢琪，張桂欣，羅 璇，王曉飛，張貞理

（淄博市檢驗檢測計量研究總院，山東淄博 255000）

特殊膳食用食品是為滿足特殊的身體或生理狀況和（或）滿足疾病、紊亂等狀態(tài)下的特殊膳食需求，而專門加工或配方的食品，包括嬰幼兒配方食品、嬰幼兒輔食食品、特殊醫(yī)學用途配方食品以及其他特殊膳食食用食品（輔食營養(yǎng)補充品、孕婦、乳母營養(yǎng)補充食品等）[1]。膽堿是一種添加在特殊膳食用食品中的營養(yǎng)強化劑，具有重要的生理功能。研究表明，膽堿在腦發(fā)育和開發(fā)認知、記憶與學習能力，以及促進肝臟機能方面都發(fā)揮著重要作用[2]。目前，膽堿的充足攝入量為嬰兒125 mg·d-1，19 歲及以上的女性為425 mg·d-1，19 歲及以上的男性為550 mg·d-1[3]。人體可自身合成膽堿或者從食物中獲取，對于一些特殊人群如嬰幼兒、孕婦、乳母或某些疾病患者，除通過食物攝取外，還需通過特殊膳食用食品來補充。我國國家標準在嬰兒配方食品、特殊醫(yī)學用途配方食品、其他特殊膳食用食品中對膽堿都有明確規(guī)定[4-8]。目前，國內外已報道了許多關于膽堿的檢測方法，但都有局限性，本文對膽堿檢測方法進行詳盡概述，以期為檢測人員從事膽堿檢測提供理論指導。

1 樣品前處理方法

膽堿是一種強有機堿，通常情況下在動物有機體內主要以游離態(tài)膽堿、乙酰膽堿、卵磷脂或鞘磷脂等形式存在，一般用水作為提取試劑只能提取樣品中的游離態(tài)膽堿，因此很多研究者利用酸、堿或者酶將樣品中結合態(tài)的膽堿變成游離態(tài)，然后再進行測定，因此水解法是測定特殊膳食用食品中膽堿的常見前處理方法。目前，絕大多數(shù)采用的前處理方法為樣品在70 ℃下，用鹽酸水解3 h，然后用磷脂酶D 酶解[9-13]。文獻中報道過的其他前處理方法有酸微波消解[14-15]、堿水解[16-17]。

2 檢測方法

2.1 分光光度法

紫外可見分光光度法檢測樣品中的膽堿大多需要先發(fā)生化學反應，生成有色物質，可見區(qū)有吸收，然后才能測定，酶法和雷氏鹽分光光度法都是基于此原理。膽堿受到膽堿氧化酶的作用釋放過氧化氫，在過氧化物酶的作用下，與苯酚和4-氨基安替比林反應生成有色物質，在波長505 nm 處測定吸光度并進行定量分析。《食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中膽堿的測定》（GB 5413.20—2022）[9]第一法和AOAC 官方方法（999.14）[10]都是基于酶法原理進行膽堿測定。KHAN 等[11]將二氮熒光素代替苯酚和4-氨基安替比林，也可以生成有色物質，并在502 nm 處測定吸光度定量膽堿含量。RADER 等[12]優(yōu)化了AOAC 官方方法，通過加入活性炭消除高含量維生素C 對酶比色法影響，并將該方法應用于一系列含膽堿的膳食補充劑，包括膳食補充片、膠囊、液體產(chǎn)品等。結果發(fā)現(xiàn)，添加到嬰幼兒配方乳粉和代表性膳食補充劑中的膽堿回收率達85%～114%。雷氏鹽分光光度法則是利用膽堿雷納克銨鹽的丙酮溶液在可見區(qū)有吸收的原理進行測定[18]。劉旻雯[19]和梁喜玲[20]分別對比了上述兩種方法測定嬰幼兒乳粉、特殊醫(yī)學配方食品中的膽堿含量，結果顯示兩種方法測得的膽堿含量相近，均能滿足檢測要求。

CARTER 等[16]結合毛細管電泳法與分光光度法，實現(xiàn)了對嬰幼兒配方食品中膽堿的檢測，以1-甲基咪唑為探針，采用0.1 mmol·L-1鹽酸調節(jié)背景電解質pH 值，內標法定量。丁曉靜等[21]以4-甲基咪唑為探針，以10 mmol·L-1磷酸二氫鈉+20 mmol·L-1磷酸+7 mmol·L-1為背景電解質，外標法測定膽堿含量，發(fā)現(xiàn)該方法線性關系、精密度和回收率良好，方法簡單，能滿足對嬰幼兒奶粉中膽堿分析的要求。

酶促反應結合分光光度法是目前實驗室測定膽堿最常用的方法，但該法檢出限高，不適合大批量樣品檢測；雷氏鹽分光光度法前處理復雜、耗時長；毛細管電泳采用紫外法在實際應用中存在一定制約，普通實驗室使用率低，推廣較困難。

2.2 色譜/質譜法

色譜法具備靈敏度高，檢測結果準確度好等優(yōu)勢；質譜法被認為是一種同時具備高特異性和高靈敏度的方法，有大量報道顯示，色譜法和質譜法已經(jīng)用于膽堿的檢測。盧越圻等[22]建立了柱前衍生-高效液相色譜法測定嬰幼兒食品和乳品中膽堿含量的方法，樣品經(jīng)水解后，F(xiàn)moc-Cl 衍生，C18柱分離后，F(xiàn)LD 檢測，該方法標準曲線線性良好，回收率為85.0%～110.4%，RSD 為1.27%～3.78%。

LAIKHTMAN 等[23]采用離子色譜法和抑制電導率法測定嬰幼兒配方奶粉中的膽堿，樣品用酸水解后，注入色譜系統(tǒng)，分離后經(jīng)抑制型電導檢測器測定。同時，筆者將此方法與AOAC 官方方法（999.14）進行比較，發(fā)現(xiàn)測定結果（平均值）低于酶比色法，將此結果歸因于省略了磷脂酶D 處理，盡管存在這種偏差，該方法仍然可以用來準確測定粉狀、濃縮和即食嬰兒配方奶粉中的膽堿。

ANDRIEUX 等[13]建立了液相色譜-質譜聯(lián)用法（Liquid Chromatograph Mass Spectrometer，LCMS）同時測定嬰幼兒配制乳粉和保健品中游離左旋肉堿和總膽堿的方法，樣品經(jīng)水解和酶解后，色譜分離，單四極桿檢測。結果發(fā)現(xiàn)，該方法膽堿回收率為94%～103%，RSD 為2%左右。ZHENG 等[14]建立了采用親水性色譜柱串聯(lián)質譜法測定嬰幼兒配方乳粉中的游離態(tài)和總的膽堿和左旋肉堿的方法。該方法膽堿回收率為85.0%～104%，RSD ＜5%。潘拾朝等[24]建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法測定特殊醫(yī)學配方食品中膽堿含量得方法，樣品經(jīng)酸水解，C18柱分離，采用UPLC-MS/MS 外標法測定。該方法線性關系良好，R為0.999 3，回收率為96.1%～103.4%。

薛靜[25]采用離子色譜法（Ion Chromatography，IC）、高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法（High Performance Liquid Chromatography-Evaporative Light Scattering Detection，HPLC-ELSD）及高效液相色譜-質 譜 法（High Performance Liquid Chromatography-Mass Spectrometry，HPLC-MS）3 種方法測定奶粉中的膽堿，并進行比較分析。檢測限為HPLC-ELSD＞IC ＞HPLC-MS；精密度為IC ＞HPLC-ELSD ＞HPLC-MS；回收率為IC ＞HPLC-ELSD ＞HPLCMS，綜合考慮發(fā)現(xiàn)IC 法更適合奶粉中膽堿的測定。此外，SAUCERMAN 等[17]利用GC 檢測三甲胺間接測定膽堿，膽堿發(fā)生霍夫曼分解反應，產(chǎn)生揮發(fā)性三甲胺，并通過頂空進樣，F(xiàn)ID 檢測。

液相色譜法部分需要衍生化，增加了前處理步驟。而離子色譜法和質譜法已成為國標方法，其中離子色譜作為實驗室較為常見的儀器，可進行膽堿測定；上文介紹的液相色譜-串聯(lián)質譜法僅需27 min 就可完成檢測，但質譜設備較其他設備昂貴，在普通實驗室中難以普及。

2.3 電化學方法

大部分電化學方法測定膽堿是利用膽堿氧化酶氧化膽堿，過氧化氫的產(chǎn)生和氧的消耗可以轉化為電化學信號進行檢測。LIMA 等[26]建立了利用流動注射和電位檢測膽堿的方法，樣品經(jīng)過酸水解后，被固定化膽堿氧化酶氧化生成過氧化氫，過氧化氫引起碘化物的氧化，電位檢測碘化物濃度變化，從而測定膽堿含量。PATI 等[27]在70 ℃條件下，用鹽酸水解牛奶、奶粉和大豆卵磷脂水解物3 h，游離態(tài)膽堿通過流動注射分析和固定化膽堿氧化酶安培生物傳感器檢測。PANFILI 等[15]在110 ℃條件下，使用微波水解5 min，采用膽堿氧化酶電化學生物傳感器的方法快速測定食品中的膽堿。PATI 等[27]描述的生物傳感器測定膽堿是基于H2O2的產(chǎn)生，而PANFILI等[15]是基于O2的消耗。此外，PATI 等[28]還建立了雙生物傳感器的方法來測定游離態(tài)膽堿和結合態(tài)膽堿，使用磷脂酶D 生物傳感器與膽堿氧化酶安培生物傳感器，結合酸水解步驟，可定量測定牛奶和膳食補充劑中總膽堿、游離態(tài)膽堿和磷脂酰膽堿。電化學法專一性好、干擾少，但目前還未得到廣泛應用，不適合批量樣品檢測。

3 國內外特殊膳食用食品中膽堿的檢測方法對比

目前，能夠檢測特殊膳食用食品中膽堿的方法有很多，從樣品處理、儀器、試劑等方面進行比較，結果見表1。特殊膳食用食品中膽堿的檢測方法均有其特點及局限性，膽堿測定中樣品制備耗時最多，通常采用的水浴時間需要3 h，利用微波消解技術可以縮短時間。目前酶促反應與分光光度法聯(lián)合使用是檢測膽堿最常用的方法，但酶價格較高，不適合大批量樣品的檢測；雷氏鹽法分光光度法前處理復雜；毛細管電泳、生物傳感器法研究較少，還未成熟；離子色譜法的電導檢測器為通用型檢測器，專一性差；液相色譜和質譜聯(lián)用方法適合測定大批量樣品。

表1 國內外特殊膳食用食品中膽堿的檢測方法

4 展望

膽堿因其功能越來越多被應用到食品、醫(yī)藥領域。快速、準確的膽堿檢測分析方法一直都是檢測人員研究的熱點，分光光度法是檢測膽堿中最常用的方法，但有一定的局限性。隨著儀器設備的發(fā)展，利用色譜法、質譜法、電化學法檢測膽堿受到越來越多檢測人員的關注，但這些方法采用傳統(tǒng)的70 ℃酸水解3 h，耗時長，已經(jīng)有作者研究利用微波爐改進水解方法，減少樣品前處理時間。因此優(yōu)化前處理方法，結合色譜、質譜及電化學的儀器設備，將是未來膽堿檢測分析的發(fā)展方向。