張雷雷，林韋康

（1.王叔和（鄭州）生物制藥工程有限公司，河南鄭州 450000；2.王叔和生物醫(yī)藥（武漢）有限公司，湖北武漢 430040）

腹瀉是全球范圍內(nèi)的公共衛(wèi)生問(wèn)題，人群患病范圍廣，發(fā)病率較高，同時(shí)在我國(guó)衛(wèi)生疾控方面被列為重點(diǎn)防治的疾病之一[1]。長(zhǎng)期研究表明，腸道微生態(tài)平衡環(huán)境對(duì)機(jī)體的健康有著重要的影響[2]，機(jī)體的腸道疾病也可能與其腸道微生態(tài)平衡紊亂有著密切聯(lián)系[3]?？股啬軌驓⑺烂舾胁≡?，但也會(huì)破壞機(jī)體腸道中菌群環(huán)境平衡，甚至影響正常的新陳代謝[4]，進(jìn)而引發(fā)腸道的正常消化功能紊亂和機(jī)體免疫力下降，并伴有腹瀉等癥狀[5]。

蜂蜜的使用范圍較廣。蜂蜜可以通過(guò)抗菌性能緩解炎癥，還可以修復(fù)腸道黏膜，改善腸道微生態(tài)，使其達(dá)到平衡狀態(tài)[6-7]。桉樹(shù)蜜呈深琥珀色，新鮮蜜桉醇味較濃，對(duì)跌打損傷、癰腫瘡瘍及抗感染等有較高的藥用價(jià)值[8]。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品及試劑

西澳菲斯特農(nóng)場(chǎng)赤桉蜂蜜（Fewster’s Farm Jarrah Honey，F(xiàn)FJH）；致病性大腸埃希菌；小鼠血管活性腸肽（VIP）ELISA 試劑盒；小鼠胃動(dòng)素（MTL）ELISA 試劑盒；諾氟沙星。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

XPR 電子分析天平；BX63-CellSens 型全電動(dòng)智能顯微鏡；BIO-RAD680 型酶標(biāo)儀；Wellwash Versa雙排全自動(dòng)洗板機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠，雄性，SPF級(jí)，個(gè)體質(zhì)量（20±2） g，6 ～8 周齡，動(dòng)物在（23±1）℃的環(huán)境中，在相對(duì)濕度55%±15%、12 h 的光/暗循環(huán)條件下，可以自由取食和飲水。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 FFJH 對(duì)小鼠體重、腹瀉率、腹瀉指數(shù)的影響

實(shí)驗(yàn)將C57BL/6 雄性小鼠隨機(jī)分為9 組，每組15 只，分別為正常組，造模組，諾氟沙星組，市售蜂蜜低劑量組、中劑量組、高劑量組，F(xiàn)FJH 低劑量組、中劑量組、高劑量組。除正常小鼠，其余各組均于腹腔注射0.4 mL 5×108CFU·mL-1的大腸埃希菌溶液，連續(xù)給藥3 d。造模小鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動(dòng)減少、肛周污穢、便溏，即可視為造模成功。

造模成功后開(kāi)始給藥，正常組市售蜂蜜和模型組市售蜂蜜小鼠給予相同體積的生理鹽水，其他各組小鼠可根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組設(shè)計(jì)給予不同藥物，每日給藥1 次，給藥體積0.4 mL，連續(xù)15 d。實(shí)驗(yàn)分組情況為諾氟沙星組（0.56 mg·kg-1）、市售蜂蜜低（20%）、中（40%）、高（80%）劑量組和FFJH低（20%）、中（40%）、高（80%）劑量組。給藥15 d 后，記錄小鼠體重。

依照《藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)》（第4 版）[9]，分別測(cè)定實(shí)驗(yàn)第0 d、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d 小鼠腹瀉率。觀察各組小鼠注射大腸埃希菌后4 h 內(nèi)的排便情況并記錄[10]，并根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組計(jì)算腹瀉指數(shù)，計(jì)算公式如下。

腹瀉率=腹瀉動(dòng)物數(shù)/該組動(dòng)物總數(shù)×100%；腹瀉指數(shù)=稀便率×平均稀便級(jí)。

1.4.2 FFJH 對(duì)小鼠小腸推進(jìn)率的影響

通過(guò)注射大腸埃希菌溶液，建立小鼠腹瀉模型，計(jì)算給定時(shí)間內(nèi)小腸內(nèi)部的碳末的推進(jìn)率，以此評(píng)判模型小鼠的胃腸蠕動(dòng)功能水平[11]。小鼠同1.4.1 方法處理，除正常組，在其他小鼠最后一次給藥0.5 h后，灌胃0.2 mL 5%碳末懸液。灌胃結(jié)束1 h 后，脫頸處死小鼠，打開(kāi)腹腔，取自幽門(mén)至回盲部的腸管部分，放置于托盤(pán)上，輕拉成一條直線，小腸總長(zhǎng)度通過(guò)測(cè)量腸管長(zhǎng)度得出，計(jì)算小腸碳末推進(jìn)率。

1.4.3 FFJH 對(duì)小鼠血清胃腸激素的影響

給藥周期結(jié)束后，小鼠在禁食12 h，通過(guò)摘去眼球取血，靜置1.5 h，以3 000 r·min-1離心10 min，分離血清于-20 ℃冰箱留存。根據(jù)ELISA 試劑盒的相關(guān)說(shuō)明書(shū)測(cè)定胃動(dòng)素（Motilin，MTL）、血管活性腸肽（Vasoactine Intrestinal Peptide，VIP）含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 FFJH 對(duì)大腸埃希菌腹瀉小鼠模型小鼠體重的影響

FFJH 對(duì)大腸埃希菌腹瀉小鼠模型小鼠體重的影響如圖1 所示。模型組小鼠注射大腸埃希菌之后，進(jìn)食量、飲水量均減少，精神萎靡，被毛散亂無(wú)光澤，肛周毛發(fā)被稀便污染，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小鼠體重較正常組顯著降低（P＜0.01），出現(xiàn)了明顯的腹瀉現(xiàn)象。相比模型組，F(xiàn)FJH 低、中、高劑量組小鼠飲食及活動(dòng)顯著增加（P＜0.01），精神狀態(tài)好轉(zhuǎn)，肛周毛發(fā)較干凈，腹瀉癥狀減輕。這些結(jié)果表明FFJH 對(duì)大腸埃希菌腹瀉小鼠具有一定的修復(fù)作用。

圖1 不同試驗(yàn)組小鼠體重情況

2.2 FFJH 對(duì)小鼠腹瀉率和腹瀉指數(shù)的影響

2.2.1 FFJH 對(duì)小鼠腹瀉率的影響

造模小鼠3 d 后開(kāi)始出現(xiàn)活動(dòng)減少、精神萎靡、肛周污穢、便溏的現(xiàn)象。模型組，諾氟沙星組，市售蜂蜜中、高劑量組，F(xiàn)FJH 低、中、高劑量組腹瀉率均為100%，市售蜂蜜低劑量組腹瀉率為90%，認(rèn)為塑造大腸桿菌腹瀉小鼠模型成功。實(shí)驗(yàn)第5 d，模型組小鼠腹瀉率為80%，市售蜂蜜低、中、高劑量組小鼠腹瀉率為80%，F(xiàn)FJH 低劑量組小鼠腹瀉率均為80%，F(xiàn)FJH 中、高劑量組小鼠腹瀉率為70%。實(shí)驗(yàn)第9 d，各給藥組小鼠情況逐漸好轉(zhuǎn)，僅有市售蜂蜜低劑量組和模型組小鼠存在腹瀉現(xiàn)象，其精神仍舊萎靡，活動(dòng)較少。

2.2.2 FFJH 對(duì)小鼠腹瀉指數(shù)的影響

由圖2 可知，相對(duì)于正常組，模型組小鼠的腹瀉指數(shù)顯著增加（P＜0.01），說(shuō)明造模成功。相對(duì)于模型組，諾氟沙星組，市售蜂蜜高劑量組，F(xiàn)FJH低、中、高劑量組小鼠的腹瀉指數(shù)均有顯著減少（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠腹瀉指數(shù)圖

2.3 FFJH 對(duì)小鼠小腸推進(jìn)率的影響

由圖3 可知，與正常組相比，模型組碳末推進(jìn)率顯著增高（P＜0.01），說(shuō)明腹瀉模型制備成功。與模型組相比，諾氟沙星組，F(xiàn)FJH 低、中、高劑量可顯著降低模型小鼠的小腸推進(jìn)率（P＜0.01），說(shuō)明FFJH 在腹瀉條件下能顯著改善鼠腸道環(huán)境。

圖3 各組小鼠小腸推進(jìn)率

2.4 FFJH 對(duì)小鼠血清胃腸激素的影響

由圖4 可知，與正常組相比，模型組小鼠的血清MTL 含量出現(xiàn)顯著降低，VIP 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，F(xiàn)FJH 中劑量組MTL含量明顯升高（P＜0.05），F(xiàn)FJH 高劑量組MTL 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組相比，諾氟沙星組、FFJH 中劑量組和FFJH 高劑量組顯著降低了小鼠血清VIP 含量（P＜0.01），市售蜂蜜低、中、高劑量組和FFJH 低劑量組可明顯降低小鼠血清VIP 含量（P＜0.05），提示FFJH 具有一定改善消化道環(huán)境的作用。

圖4 各組小鼠胃動(dòng)素、血管活性腸肽含量

3 結(jié)論與討論

綜上所述，本試驗(yàn)采用注射大腸埃希菌溶液，采用大腸埃希菌注射塑造相關(guān)性腹瀉小鼠模型，通過(guò)測(cè)定各組小鼠體質(zhì)量、腹瀉率和腹瀉指數(shù)、小腸推進(jìn)率和血清胃腸激素含量，發(fā)現(xiàn)FFJH 可以改善大腸桿菌所致腹瀉小鼠的體重、腹瀉率及血清胃腸激素等相關(guān)指標(biāo)，對(duì)機(jī)體有一定的修復(fù)作用。本研究也存在一定不足之處，實(shí)驗(yàn)雖然證明了FFJH 可以通過(guò)其專用特性及改善腸道微生態(tài)能夠改善腹瀉，卻并未對(duì)腸道微生態(tài)調(diào)節(jié)相關(guān)的具體的發(fā)生機(jī)制進(jìn)一步探究。