趙 嵩

（馬鞍山市食品藥品安全檢查中心，安徽馬鞍山 243000）

腺嘌呤核苷三磷酸（Adenosine Triphosphate，ATP）又稱三磷酸腺苷。ATP 是一切生命體能量的直接來源，普遍存在于動(dòng)植物、細(xì)菌、真菌細(xì)胞和食物殘?jiān)?，而無生命的碎屑物質(zhì)中不存在ATP[1]。生物活性物質(zhì)中的ATP含量是相對(duì)恒定的，借助“熒光素-熒光素酶”發(fā)光反應(yīng)可對(duì)ATP 進(jìn)行定量測(cè)試，從而反映出生物細(xì)胞量的殘留。ATP 與熒光素反應(yīng)發(fā)出的熒光強(qiáng)度（Relative Light Unit，RLU）與活細(xì)胞數(shù)量基本呈正比例關(guān)系[2]。熒光值越高，表明ATP 的量越多，也就意味著表面的殘留物越多，清潔狀態(tài)越差。因此，ATP 檢測(cè)法就被用來快速檢驗(yàn)物品表面是否潔凈。

RLU 值越高代表存在微生物污染風(fēng)險(xiǎn)的可能性越大，但ATP 不能替代微生物涂抹檢測(cè)，一般ATP的靈敏度可達(dá)到10-15mol ATP 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（有的品牌甚至更高），以細(xì)菌為例基本也要達(dá)到103才能達(dá)到ATP 的檢測(cè)靈敏度[3]。研究表明，只有純微生物培養(yǎng)物而沒有任何食物殘?jiān)那闆r下，熒光強(qiáng)度（RLU）和菌落數(shù)（Colony-Forming Units，CFU）呈很好的正相關(guān)關(guān)系[4]。

ATP 生物發(fā)光技術(shù)由于具有操作簡(jiǎn)單、快速、方便的特點(diǎn)，能夠簡(jiǎn)單快速驗(yàn)證清潔消毒效果而被廣泛應(yīng)用于食品、制藥、醫(yī)療和養(yǎng)殖等行業(yè)。隨著ATP 生物發(fā)光技術(shù)的普及，市場(chǎng)也涌現(xiàn)了大量的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)品牌，如3M、海凈納、龜甲萬、天隆、美正、巔峰、綠洲等品牌，其價(jià)格和性能差異較大，也造成了用戶選擇的困惑。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

兩個(gè)品牌ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)（包括ATP 熒光檢測(cè)儀和表面ATP 采樣拭子）；Pipet-lite 移液槍（美國RAININ 公司）；sx500 高壓滅菌鍋（日本TOMY 公司）；ATP 標(biāo)準(zhǔn)品（Merck，貨號(hào)：A1852-1VL）、金黃色葡萄球菌（ATCC 6538）、大腸桿菌（ATCC 25922）、啤酒酵母菌（ATCC 10231）。

1.2 使用方法

從2 ～8 ℃環(huán)境中取出ATP 表面采樣拭子，放置10 ～20 min 使其恢復(fù)至室溫狀態(tài)。撕開包裝袋，取出采樣拭子。拔出含有潤(rùn)濕棉簽的手柄，若涂抹表面，則按Z 字形涂抹待測(cè)表面10 cm×10 cm 的區(qū)域；若檢測(cè)ATP 液體標(biāo)準(zhǔn)品，則將20 μL 待測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品滴加至棉簽上。后將棉簽插回拭子內(nèi)并按下，使其與底液接觸，將檢測(cè)管左右搖晃5 ～10 s，充分混勻后，插入對(duì)應(yīng)品牌的ATP 熒光檢測(cè)儀，點(diǎn)擊快速檢測(cè)即可。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品驗(yàn)證方法

1.3.1 靈敏度

靈敏度是驗(yàn)證一個(gè)系統(tǒng)/方法的重要性能指標(biāo)。先進(jìn)行陰性值檢測(cè)，來確定ATP 的本底值。兩種品牌分別取6 支拭子，無需取出棉簽，直接按下手柄使棉簽與反應(yīng)液接觸，按照1.2 進(jìn)行操作。靈敏度驗(yàn)證方法為取ATP 標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋多個(gè)濃度梯度，取1×10-13mol和1×10-15mol 兩個(gè)濃度，按照1.2 進(jìn)行分別檢測(cè)，重復(fù)8 次。對(duì)比不同ATP 標(biāo)準(zhǔn)品濃度檢測(cè)值與陰性值，與陰性有顯著差異的最低檢測(cè)濃度為其靈敏度。

1.3.2 衰減率

ATP 反應(yīng)激發(fā)后，其熒光信號(hào)會(huì)隨時(shí)間的延長(zhǎng)逐步衰減，考慮到檢測(cè)人員在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的過程中易受外界因素的影響，衰減過快可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。衰減率的驗(yàn)證方法為測(cè)定拭子在5 min 內(nèi)的熒光檢測(cè)值衰減率，吸取20 μL 不同濃度梯度ATP 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，測(cè)定兩個(gè)品牌的ATP 在反應(yīng)開始后5 min 內(nèi)的熒光衰減率，分別在反應(yīng)1 min、2 min、3 min、4 min 和5 min 時(shí)進(jìn)行讀值。

1.3.3 重復(fù)性

精密度是保證獲得良好準(zhǔn)確度的先決條件，一般情況下，測(cè)量精密度不好，就不可能有良好的準(zhǔn)確度，而重復(fù)性是精密度的一個(gè)重要度量方式。取一份高濃度（1×10-13mol）ATP 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，分別檢測(cè)兩個(gè)品牌ATP 在同一濃度下的重復(fù)性，檢測(cè)方法參考1.2。同一濃度ATP 標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)測(cè)試10 次，計(jì)算10 次結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative Standard Deviation，RSD），重復(fù)性用RSD 表示。

1.4 實(shí)際檢測(cè)效果驗(yàn)證方法

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株檢測(cè)

選取較為常見的革蘭氏陽性細(xì)菌（大腸埃希氏菌，ATCC 25922）、革蘭氏陰性細(xì)菌（金黃色葡萄球菌，ATCC 6538）和真菌（酵母菌，ATCC 10231），分別檢測(cè)兩個(gè)品牌ATP 對(duì)不同菌體的檢測(cè)靈敏度。

取新鮮菌液，稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4和10-5梯度，從兩個(gè)品牌的ATP 表面采樣拭子中取出棉簽，用移液槍準(zhǔn)確移取20 μL 菌液滴于棉簽頭上，等待30 s，然后將棉簽插回檢測(cè)管內(nèi)并按下，使其與底液接觸，將檢測(cè)管左右搖晃5 ～10 s，插入對(duì)應(yīng)的ATP 熒光檢測(cè)儀，等待30 s，開始檢測(cè)。將得到的熒光值與菌落數(shù)一一對(duì)應(yīng)。把不同濃度菌液的檢測(cè)熒光值與ATP 拭子自身陰性值進(jìn)行對(duì)比，有顯著差異的最低濃度即為菌液的檢測(cè)靈敏度。

1.4.2 實(shí)際表面檢測(cè)

對(duì)桌面進(jìn)行清潔消毒后，將桌面劃分為相鄰的20 塊10 cm×10 cm 的面積，分別用2 個(gè)品牌的ATP進(jìn)行檢測(cè)，操作方法參照1.2。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

由表1 可知，在標(biāo)準(zhǔn)品濃度為1×10-15mol 的 ATP水平上，兩個(gè)品牌ATP 仍能檢出RLU 值，且結(jié)果與陰性有顯著差異；10-15mol ATP 濃度下，品牌一檢測(cè)值約是品牌二的1.8 倍，陰性值約為1.5 倍，倍數(shù)關(guān)系基本一致，由于在10-15mol ATP 濃度的熒光值與陰性熒光值有較大差異，故二者的檢測(cè)靈敏度一致，均為10-16mol ATP。

表1 品牌一ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)靈敏度驗(yàn)證結(jié)果

2.2 衰減率驗(yàn)證結(jié)果

采用兩個(gè)品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)檢測(cè)不同濃度ATP 標(biāo)準(zhǔn)溶液，由表2 可知，品牌一在濃度1×10-13mol 反應(yīng)第5 min 時(shí)熒光值是最高熒光值的95%；在濃度1×10-15mol 反應(yīng)第5 min 時(shí)，熒光值是最高熒光值的97%。品牌二在濃度1×10-13mol 反應(yīng)第5 min 時(shí)熒光值是最高熒光值的94%；在濃度1×10-15mol 反應(yīng)第5 min 時(shí)，熒光值是最高熒光值的89%。從數(shù)據(jù)上看，兩個(gè)品牌的衰退率都滿足實(shí)驗(yàn)要求（25%以內(nèi)）[5]，但品牌一的衰減率表現(xiàn)更佳。

表2 ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)衰退率驗(yàn)證結(jié)果

2.3 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

在同濃度ATP 水平下，兩個(gè)品牌ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)10 次檢測(cè)結(jié)果的RSD 均為9%，偏差值小于15%，均能滿足實(shí)驗(yàn)要求，詳見表3。

表3 ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果

2.4 標(biāo)準(zhǔn)菌株驗(yàn)證結(jié)果

采用金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、大腸桿菌（ATCC25922）、白色念珠菌（ATCC10231）3 種常見菌株，在不同菌株濃度下進(jìn)行ATP 的驗(yàn)證。結(jié)果顯示，兩個(gè)品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)的檢測(cè)值顯示出穩(wěn)定的倍數(shù)關(guān)系，具體驗(yàn)證結(jié)果見表4、表5、表6，且隨著菌株濃度的降低，檢測(cè)值均呈現(xiàn)較好的梯度關(guān)系。菌株在高濃度下，檢測(cè)值或存在偏低情況，與低濃度不完全呈線性關(guān)系，但影響較小。

表4 金黃色葡萄球菌（ATCC6538）測(cè)試結(jié)果

表5 大腸桿菌（ATCC25922）測(cè)試結(jié)果

表6 白色念珠菌（ATCC10231）測(cè)試結(jié)果

2.5 實(shí)際表面檢測(cè)結(jié)果

選取同一桌面的相鄰區(qū)域，分別用兩個(gè)品牌的ATP 表面采樣拭子進(jìn)行涂抹取樣和檢測(cè)，并計(jì)算其RSD。從表7 結(jié)果可以看出，兩個(gè)品牌的檢測(cè)值及其趨勢(shì)表現(xiàn)基本一致。

表7 兩個(gè)品牌實(shí)際表面檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

通過上述驗(yàn)證，兩個(gè)品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)靈敏度一致，均為1×10-16mol，在衰減率、重復(fù)性測(cè)試上表現(xiàn)基本一致，兩個(gè)品牌在菌株檢測(cè)和實(shí)際表面樣品檢測(cè)中，檢測(cè)結(jié)果與線性趨勢(shì)基本一致，說明兩個(gè)品牌的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系在菌株裂解效力和檢測(cè)靈敏度上有很好的一致性。在實(shí)際驗(yàn)證中，用戶可根據(jù)以上驗(yàn)證方案，選擇重復(fù)性和衰減率更佳的品牌，至于靈敏度，可根據(jù)用戶對(duì)潔凈度要求情況來選擇，此外還需要結(jié)合性能和價(jià)格綜合考慮，最終篩選出最合適的ATP 衛(wèi)生監(jiān)測(cè)系統(tǒng)。