程兢業(yè)，吳鴻億，趙 力，王 婧

（重慶三峽學(xué)院，重慶 404100）

在我國(guó)，誤食毒蘑菇而引發(fā)的中毒事件時(shí)有發(fā)生，毒蘑菇在進(jìn)入食用和消化環(huán)節(jié)后難以用傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)方法辨認(rèn)，近年來DNA 分子標(biāo)記技術(shù)在真菌物種鑒別中發(fā)展迅速，而高質(zhì)量基因組DNA 提取為其奠定了基礎(chǔ)。目前國(guó)內(nèi)外已有一些關(guān)于蘑菇基因組DNA 提取方法的報(bào)道，但由于蘑菇組織中含有大量的多糖、蛋白質(zhì)和色素等物質(zhì)，以及加工和消化過程中DNA 有所降解，導(dǎo)致后續(xù)相關(guān)分子實(shí)驗(yàn)受到影響[1-4]。因此，筆者在前人的研究基礎(chǔ)上，采用試劑盒法和CTAB 法提取加工和消化后的蘑菇DNA，且對(duì)經(jīng)典的CTAB 法進(jìn)行改良，利用瓊脂糖凝膠電泳、紫外分光光度和PCR 擴(kuò)增檢測(cè)DNA 質(zhì)量，對(duì)提取方法、加工方式及消化對(duì)DNA 的影響進(jìn)行初步的研究，同時(shí)也為毒蘑菇DNA 的提取提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

食用菌杏鮑菇、香菇購(gòu)于當(dāng)?shù)爻小?/p>

CTAB 緩沖液（2% CTAB、100 mmol·L-1Tris-HCl、25 mmol·L-1EDTA、1.5 mol·L-1NaCl）；2-巰基乙醇；蛋白酶K（20 mg·mL-1）；RNase A；酚∶氯仿∶異戊醇（25 ∶24 ∶1）；氯仿∶異戊醇（24 ∶1）；胃蛋白酶；甲醇∶氯仿∶水（1.0 ∶2.0 ∶0.8）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 加工方式

加工方式采用炒、水煮、烘干和凍干的方法。①炒：平底鍋燒熱后倒入食用油將蘑菇炒至熟透。②水煮：水沸騰后放入蘑菇，分別在水中煮至5 min、10 min、15 min、30 min、45 min 和60 min。③烘干：將蘑菇切成薄片，60 ℃烘箱烘干6 ～7 h 備用。④凍干：將蘑菇切成薄片于-80 ℃冰箱放置一晚后真空冷凍干燥48 h，取出密封備用。以上樣品均分為兩份，一份消化實(shí)驗(yàn)備用，一份作為對(duì)照。

1.2.2 消化試驗(yàn)

人工胃液配制及消化處理參考GAUSTERER 等的試驗(yàn)[5]。

1.2.3 DNA 提取

本研究參照原有CTAB 法[6-7]，對(duì)其進(jìn)行改良，提高DNA 質(zhì)量和提取成功率。改良后CTAB 法操作步驟如下。稱取1 g 蘑菇組織研磨后放入10 mL 滅菌離心管中，加入5 mL CTAB 緩沖液，500 μL 2-巰基乙醇，80 μL 蛋白酶K，置于65 ℃的恒溫水浴鍋中消化1 h。取上清液至新的離心管中，加入等體積的酚∶氯仿∶異戊醇（25 ∶24 ∶1）溶液，振蕩至乳白色，12 000 r·min-1離心10 min。加入1% RNase A 溶液，37 ℃水浴30 min。加入等體積的氯仿/異戊醇（24 ∶1），振蕩至乳白色，12 000 r·min-1離心10 min。取上清液至新的離心管中，加入等體積預(yù)冷異丙醇，-20 ℃放置30 min 后12 000 r·min-1離心10 min。棄上清液，加入800 μL 70%乙醇洗滌兩次，無水乙醇洗滌一次，棄去乙醇，室溫晾干或超凈工作臺(tái)吹干，加入100 μL 滅菌雙蒸水，-20 ℃下保存。

真菌基因組DNA 提取試劑盒購(gòu)自索萊寶生物技術(shù)有限公司，具體操作方法參照試劑盒說明書。

1.2.4 DNA 質(zhì)量分析

（1）紫外檢測(cè)。取5 μL DNA 樣品，加入雙蒸水或TE 緩沖液稀釋10 倍，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)量DNA 濃度及OD260/OD280。

（2）PCR 擴(kuò)增。采用引物ITS4/ITS5 和LROR/LR5，PCR 反應(yīng)體系總體積為20 μL，其中包含2 μL 10×PCR buffer，1.6 μL dNTP（2.5 mmol·L-1），1.2 μL Mg2+（25 mmol·L-1），0.4 μL Taq 酶（2.5 U），上下引物各1 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 補(bǔ)足至20 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，27 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

（3）瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。取DNA 樣品5 μL，6×Loading buffer 1 μL 混勻，在1%的瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中上樣，置于0.5×TAE 緩沖液中，120 V 電泳35 min，采用Gel-Pro analyzer 軟件拍照并保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫外分析結(jié)果

2.1.1 不同提取方法紫外分析結(jié)果

3 種方法提取新鮮食用菌基因組DNA 紫外分析結(jié)果見表1，試劑盒法、CTAB 法、改良CTAB 法均能提取杏鮑菇和香菇子實(shí)體中的DNA，3 種提取方法存在顯著性差異（P＜0.05）。改良CTAB 法的OD260/OD280值在1.8 ～2.0，說明蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)已去除干凈，無RNA 污染，得到的DNA 純度最好。CTAB 法提取的杏鮑菇OD260/OD280值小于1.8，存在蛋白質(zhì)和酚類物質(zhì)，香菇OD260/OD280值大于2.0，存在RNA 污染，且CTAB 法在提取DNA 過程中，出現(xiàn)較多黏稠膠狀物質(zhì)，上清液為黃褐色，抽提后DNA 沉淀仍有色素殘留。試劑盒法提取香菇DNA的OD260/OD280值小于1.8，說明受到蛋白質(zhì)及酚類物質(zhì)污染較嚴(yán)重。3 種方法相比，改良CTAB 法得到的DNA 濃度較高，其次是CTAB 法，試劑盒法得到的DNA 濃度最低。

表1 3 種方法提取新鮮食用菌基因組DNA 紫外分析結(jié)果

2.1.2 加工和胃消化樣品紫外分析結(jié)果

試劑盒和改良CTAB 兩種方法DNA 紫外分析結(jié)果見表2 和3，兩種方法所提取的除油和未除油樣品DNA 濃度均存在顯著差異性（P＜0.05），未除油樣品DNA 的OD260/OD280值小于1.8，說明蛋白質(zhì)、酚類污染嚴(yán)重，DNA 溶液中雜質(zhì)較多。除油后樣品DNA 質(zhì)量有所提高，OD260/OD280值均在1.8 ～2.0，且DNA 濃度高于除油前，濃度達(dá)1 339.33 μg·mL-1。因此，可在DNA 提取前對(duì)炒制樣品對(duì)進(jìn)行預(yù)處理以消除樣品中油脂對(duì)DNA 的影響。改良CTAB 法提取杏鮑菇水煮5 min、10 min 和15 min 之間，45 min 和60 min 之間DNA 濃度變化無顯著性差異，消化組樣品在水煮5 ～30 min 時(shí)DNA 濃度變化無顯著性差異。試劑盒法提取的水煮樣品中，杏鮑菇水煮15 ～45 min時(shí)DNA 濃度無明顯變化，其余水煮組內(nèi)樣品濃度均存在差異，濃度由51.67 ～177.67 μg·mL-1逐漸降低至19.67 ～83.33 μg·mL-1。隨著水煮時(shí)間的延長(zhǎng)，水煮樣品DNA 濃度整體呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。改良CTAB 法提取的干制樣品DNA 存在顯著性差異（P＜0.05），烘干樣品濃度均大于凍干樣品濃度，兩種提取方法均表明消化后干制樣品DNA 濃度明顯低于消化前。

表2 試劑盒法提取樣品DNA 紫外分析結(jié)果

表3 改良CTAB 法提取樣品DNA 紫外分析結(jié)果

試劑盒法和改良CTAB 法提取效果比較見圖1，兩種DNA 提取方法之間存在顯著性差異（P＜0.05），改良CTAB 法所提取DNA 濃度均高于試劑盒法，平均濃度達(dá)到1 291.05 μg·mL-1，DNA 質(zhì)量較高，OD值均在1.8 ～2.0。因此所建立的DNA 提取方法用于消化和加工等復(fù)雜樣品DNA 提取，且可應(yīng)用于毒蘑菇中毒案例中，提取蘑菇加工樣品及胃消化殘留物等，對(duì)毒蘑菇的中毒與防治具有重大意義。

圖1 不同提取方式對(duì)加工和消化樣品DNA 濃度的影響

2.2 電泳分析結(jié)果

采用試劑盒法提取加工和消化樣品DNA 電泳結(jié)果見圖2，新鮮樣品DNA 作為對(duì)照。DNA 易溶于水，隨著高溫與水煮時(shí)間的延長(zhǎng)，很難從水煮樣品中提取完整DNA 片段。所有加工樣品成功擴(kuò)增出ITS 片段，消化后水煮杏鮑菇45 min、60 min 和炒制杏鮑菇未能擴(kuò)增出ITS 片段，消化后杏鮑菇水煮60 min 和未除油未能擴(kuò)增出LSU 片段。水煮杏鮑菇45 min、水煮香菇30 ～60 min 和消化后炒制香菇LSU 條帶較暗，香菇未除油ITS 條帶較暗，說明DNA 提取成功但含量較低。對(duì)炒制樣品進(jìn)行除油處理后，存在彌散片段，干制樣品基因組DNA 片段完整主帶清晰，烘干香菇和消化后凍干香菇未能擴(kuò)增出LSU 片段。所有消化樣品條帶均變暗，說明與新鮮和加工樣品相比，消化樣品DNA 有所降解，DNA 得率較低。引物ITS 擴(kuò)增成功率為86.5%，引物L(fēng)SU 擴(kuò)增成功率為84.6%，兩種引物結(jié)合使用可將擴(kuò)增成功率提高至88.5%。

圖2 兩種方法提取加工和消化樣品電泳圖

新鮮食用菌DNA 作為對(duì)照，改良CTAB 法提取加工和消化樣品DNA 電泳結(jié)果見圖2，水煮5 ～10 min樣品基因組DNA 條帶清晰，消化后水煮樣品無完整條帶，所有加工樣品成功擴(kuò)增出ITS 和LSU 片段，水煮香菇30 min 的LSU 條帶和水煮香菇15 min 的ITS 條帶較暗，消化后的水煮香菇5 ～10 min 擴(kuò)增出ITS 非特異性片段，片段大小在250 bp 左右，消化后水煮杏鮑菇15 min 樣品LSU 條帶較暗，其余消化后樣品均成功擴(kuò)增出ITS 片段。炒制樣品未進(jìn)行除油處理時(shí)基因組DNA 無明顯條帶，進(jìn)行除油處理后可見其主帶清晰完整，且無拖尾現(xiàn)象。干制樣品基因組DNA 主帶不完整，存在大量彌散DNA 片段條帶。改良CTAB 法提取樣品DNA 引物ITS 擴(kuò)增成功率為86.5%，LSU 擴(kuò)增成功率為82.7%，兩種引物結(jié)合使用可將擴(kuò)增成功率提高至100%，因此可將ITS和LUS 兩種引物聯(lián)合使用以保證PCR 擴(kuò)增成功率。

3 結(jié)論與討論

由于進(jìn)入加工和消化階段的蘑菇很難通過形態(tài)學(xué)鑒定其物種，對(duì)于誤食毒蘑菇中毒案例，針對(duì)性治療便難以進(jìn)行，因此本試驗(yàn)通過研究加工條件和DNA 提取方法，提高DNA 提取成功率，為后續(xù)DNA 分子鑒別實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。食用菌中含有較多酚類、多糖及色素等物質(zhì)，這些物質(zhì)會(huì)形成膠黏狀物并裹挾著DNA[8]。1995 年Borroso.G.提出了CTAB法，但CTAB 法最早應(yīng)用于植物基因組DNA 的提取，隨后此方法開始應(yīng)用于蘑菇DNA 的提取。韓利剛等[9]在這種方法的基礎(chǔ)上進(jìn)行改良來提取絲狀真菌的DNA 且取得了很好的效果。同年王春暉等[10]將CTAB 法加以改進(jìn)，使此法更簡(jiǎn)單、易操作。江玉姬等[11]將CTAB 法與其他方法加以比較，發(fā)現(xiàn)CTAB法是一種優(yōu)良的蘑菇DNA 提取方法，DNA 產(chǎn)量高，多糖和蛋白質(zhì)含量低，符合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求。

本試驗(yàn)在對(duì)CTAB 法進(jìn)行改良時(shí)，采用加入蛋白酶K 以去除蘑菇組織中的蛋白質(zhì)，加入2-巰基乙醇以去除多酚類物質(zhì)，加入RNase A 以去除RNA。由于RNA 酶會(huì)影響DNA 質(zhì)量，于是選擇將RNase A 溶液在使用酚/氯仿/異戊醇抽提液抽提一次后加入，在進(jìn)行第二次抽提時(shí)可將RNA 酶一起去除。油脂的存在對(duì)DNA 質(zhì)量存在一定的影響，于是在進(jìn)行DNA 提取前對(duì)炒制樣品進(jìn)行除油處理，所得DNA 質(zhì)量與除油前相比具有明顯的提升。DNA 為水溶性極強(qiáng)的物質(zhì)，利用水煮的加工方式較難提取完整DNA 片段。本試驗(yàn)設(shè)計(jì)水煮時(shí)間梯度探究水煮時(shí)間對(duì)DNA 提取的影響，結(jié)果顯示隨著加工時(shí)間延長(zhǎng)，所得樣品DNA 濃度逐漸減少，試劑盒法未能成功提取所有樣品DNA，而改良CTAB 法則成功提取所有樣品DNA。引物ITS 結(jié)合引物L(fēng)SU 便能將擴(kuò)增成功率提高至100%，改良CTAB 法能提取水煮5 ～10 min 樣品較為完整的DNA 片段。綜上所述，改良CTAB 法適用于加工和消化樣品高質(zhì)量DNA 的提取。