付坤麗，華璞玥，李子超*，劉 峰

（1.青島大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院食品科學(xué)與工程系，山東青島 266000；2.寧波城市職業(yè)技術(shù)學(xué)院景觀生態(tài)學(xué)院，浙江寧波 315000）

明日葉（Angelica keiskei）是一種傘形科多年生食藥兼用的優(yōu)良珍貴草本植物，生長(zhǎng)速度快，前一天摘葉，次日便會(huì)生出新葉，因此得名“明日葉”，已于2019 年經(jīng)國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)委審核正式成為我國(guó)新食品原料成員之一[1-2]。明日葉原產(chǎn)于日本太平洋沿岸八丈、伊豆等島嶼，主要分布在中國(guó)、日本、韓國(guó)、印度等亞洲國(guó)家，目前在我國(guó)山東、江蘇、云南、廣西、臺(tái)灣等多地已有種植[3-4]。據(jù)報(bào)道，明日葉中不僅含有人體所必需的維生素、礦物質(zhì)、氨基酸等營(yíng)養(yǎng)素，并且富含類(lèi)黃酮、香豆素、多糖等活性物質(zhì)[5-6]，具有抗氧化、降血糖、降血壓、降血脂、保護(hù)肝臟、抗菌、抗炎、抗腫瘤等生物活性[7-9]，且無(wú)毒副作用[10-12]，日益受到人們的關(guān)注。明日葉的地上部分主要用作日常保健食品綠色蔬菜汁的來(lái)源，如嫩葉可用于煮沸或油炸，也可用于制作茶、面粉、酒和化妝品等產(chǎn)品[13-14]。然而，目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的明日葉產(chǎn)品多為茶、粉、饅頭、面條等初級(jí)加工產(chǎn)品，生物利用率低，亟待開(kāi)發(fā)高附加值的精細(xì)加工產(chǎn)品。

酵素是以動(dòng)物、植物、菌類(lèi)等為原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[15]。研究發(fā)現(xiàn)，酵素具有促進(jìn)人體新陳代謝、促進(jìn)血液循環(huán)、保護(hù)腸道、調(diào)節(jié)人體酸堿平衡、抗氧化及抗疲勞等作用[16]。植物原料經(jīng)過(guò)酵母菌、乳酸菌等益生菌發(fā)酵后，不僅能夠改變?cè)媳旧淼娘L(fēng)味，還能通過(guò)復(fù)雜多變的生化反應(yīng)，提高活性成分含量，增加酵素產(chǎn)品的功能性，并且可以延長(zhǎng)易腐原料的保質(zhì)期、改善蛋白質(zhì)和碳水化合物的消化性[17]。因此，植物酵素市場(chǎng)的發(fā)展?jié)摿薮?，開(kāi)發(fā)及應(yīng)用前景十分廣闊。

本研究以明日葉凍干粉為試驗(yàn)原料，酵母菌為發(fā)酵菌種，以總黃酮含量和γ-氨基丁酸含量為主要指標(biāo)，結(jié)合查爾酮含量、總酚含量、游離氨基酸含量、蛋白質(zhì)含量以及感官評(píng)分等其他指標(biāo)，明確了明日葉酵素的最佳發(fā)酵工藝，以制備出具有優(yōu)良品質(zhì)的明日葉酵素飲品，為明日葉的深度開(kāi)發(fā)、高值化利用提供新的思路和研究依據(jù)，提高明日葉的經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

明日葉凍干粉，山東明日葉生物科技有限公司；高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%，CAS 號(hào)：153-18-4），合肥博美生物科技有限公司；γ-氨基丁酸（GABA）標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%，CAS 號(hào):56-12-2），酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司；沒(méi)食子酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度95.4%，CAS 號(hào):149-91-7），壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；查爾酮標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%，CAS 號(hào)：487-52-5），壇墨質(zhì)檢-標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、四硼酸鈉、苯酚試劑、磷酸二氫鈉、苯駢戊三酮（茚三酮）、葡萄糖、苯酚、無(wú)水亞硫酸鈉、酒石酸鉀鈉均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；次氯酸鈉、3,5-二硝基水楊酸，化學(xué)純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；L-白氨酸、牛白蛋白、福林酚試劑均為生化試劑，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉，分析純，天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠(chǎng)；無(wú)水碳酸鈉，分析純，天津市北辰方正試劑廠(chǎng)；氫氧化鈉，分析純，天津市優(yōu)譜化學(xué)試劑有限公司；雙縮脲試劑（AB液），優(yōu)級(jí)純GR，飛凈生物科技有限公司；無(wú)水乙醇，分析純，天津市富宇精細(xì)化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PHS-3E 酸度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；食品糖度計(jì)BK-506，上海勃基儀器儀表有限公司；UV-8000 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；DHP-9052 電熱恒溫培養(yǎng)箱、LTN2-16K 臺(tái)式高速離心機(jī)、HH-6 數(shù)顯恒溫水浴鍋，青島藍(lán)特恩儀器設(shè)備有限公司；SW-CJ-2D 型雙人凈化工作臺(tái)，上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；Vortex-2 漩渦混勻儀，上海滬析實(shí)業(yè)有限公司；GL124-1SCN 分析天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；YXQ-LS-50SII 立式壓力蒸汽滅菌器，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 明日葉酵素的制備

將高活性干酵母與無(wú)菌水按照1∶10（g/mL）的比例混合溶解，置于恒溫磁力攪拌器中37 ℃活化30 min，備用[18]。準(zhǔn)確稱(chēng)取一定質(zhì)量的明日葉凍干粉，加入盛有200mL無(wú)菌水的燒杯中混勻，無(wú)菌條件下，接種活化后的酵母菌液于37 ℃恒溫條件下靜置發(fā)酵，發(fā)酵結(jié)束后取上清液，12000 r/min 離心4 min，所得液體即明日葉酵素。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

（1）酵母菌接種量的確定

明日葉凍干粉添加量15 g，發(fā)酵時(shí)間72 h，其他發(fā)酵條件同1.3.1，設(shè)置酵母菌接種量為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%，制備明日葉酵素。待發(fā)酵完成后測(cè)量發(fā)酵液中總黃酮與γ-氨基丁酸含量。本實(shí)驗(yàn)采用以總黃酮為主要指標(biāo)，γ-氨基丁酸為次要指標(biāo)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。重復(fù)3次試驗(yàn)，取平均值。

（2）明日葉凍干粉添加量的確定

酵母菌接種量1.5%，發(fā)酵時(shí)間72 h，設(shè)置明日葉凍干粉添加量為10、12.5、15、17.5、20 g，制備明日葉酵素。其他同1.3.2（1）。

（3）發(fā)酵時(shí)間的確定

酵母菌接種量1.5%，明日葉凍干粉添加量15 g，設(shè)置發(fā)酵時(shí)間為24、48、72、96、120 h，制備明日葉酵素。其他同1.3.2（1）。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，運(yùn)用Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以酵母菌接種量（A）、明日葉凍干粉添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量，運(yùn)用隸屬度的綜合評(píng)分法綜合得分為響應(yīng)值[19]，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行響應(yīng)面分析，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and levels of response surface experiment

運(yùn)用隸屬度的綜合評(píng)分法和加權(quán)計(jì)算，以發(fā)酵液中總黃酮含量（F）與γ-氨基丁酸含量（G）對(duì)明日葉酵素制備工藝進(jìn)行綜合評(píng)分。兩項(xiàng)指標(biāo)的隸屬度（I）按公式（1）計(jì)算，最終綜合得分（Y）按公式（2）計(jì)算。

式中，l為隸屬度；c為指標(biāo)值；cmax為指標(biāo)最大值；cmin為指標(biāo)最小值。

式中，lF為總黃酮含量隸屬度；lG為γ-氨基丁酸含量隸屬度；a、b 為指標(biāo)權(quán)重，本課題以總黃酮含量為主要指標(biāo)，γ-氨基丁酸含量為次要指標(biāo)，故取a=0.7，b=0.3。

1.3.4 理化指標(biāo)測(cè)定與感官評(píng)價(jià)

（1）總黃酮含量

采用NaNO2-Al(NO3)3-NaOH 顯色法[20]。

（2）γ-氨基丁酸含量

采用比色法[21-22]測(cè)定。

（3）其他特性

游離氨基酸含量采用茚三酮顯色法測(cè)定[23]；蛋白質(zhì)含量采用雙縮脲法測(cè)定[24]；總酚含量采用福林酚法測(cè)定[25-26]；查爾酮含量采用甲醇法測(cè)定[27-28]；還原糖含量采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定[29]；pH 值采用酸度計(jì)直接測(cè)定；可溶性固形物含量采用手持式食品糖度計(jì)直接測(cè)定。

（4）感官評(píng)價(jià)

感官評(píng)價(jià)參考文獻(xiàn)[30-31]。感官評(píng)價(jià)小組由10 人組成，對(duì)明日葉酵素的氣味、組織狀態(tài)、色澤、口感、滋味五個(gè)方面進(jìn)行觀察、嗅聞和品嘗后，根據(jù)表2 的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行綜合打分，結(jié)果取平均值。

表2 明日葉酵素的感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 2 Sensory evaluation standards of A.keiskei Jiaosu

1.4 數(shù)據(jù)處理

每次試驗(yàn)均進(jìn)行三次重復(fù)操作，采用SPSS 26、Design-Expert 8.0.6 和Origin Pro 2019 等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.1.1 酵母菌接種量對(duì)發(fā)酵的影響

總黃酮含量和γ-氨基丁酸含量是衡量發(fā)酵體系優(yōu)劣的重要指標(biāo)[32]。由圖1 可知，發(fā)酵液中總黃酮與γ-氨基丁酸含量隨著酵母菌接種量的增加呈先增加而后緩慢減少的趨勢(shì)。當(dāng)接種量為1.5%時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最大值，為1.28 g/L；在接種量為2.0%時(shí)，γ-氨基丁酸含量達(dá)到最大值，為8.10 g/L。在達(dá)到最高點(diǎn)后，二者含量均隨酵母菌接種量的增加而減少，可能是由于接種量過(guò)大導(dǎo)致酵母數(shù)量增長(zhǎng)過(guò)快，發(fā)生自溶，同時(shí)微生物的代謝過(guò)程消耗營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)過(guò)多，從而不利于發(fā)酵產(chǎn)物的積累。故選用1.0%～2.0%的酵母菌接種量作為后續(xù)優(yōu)化條件。

圖1 酵母菌接種量對(duì)發(fā)酵的影響Fig.1 Effects of inoculation quantity on fermentation

2.1.2 明日葉凍干粉添加量對(duì)發(fā)酵的影響

由圖2 可知，隨著明日葉凍干粉添加量的增加，發(fā)酵液中總黃酮含量呈先快速增加后緩慢增加的趨勢(shì)，γ-氨基丁酸含量的變化呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)明日葉凍干粉添加量超過(guò)15.0 g 后，因發(fā)酵體系中酵母菌不能充分利用發(fā)酵液中豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，從而使發(fā)酵速度減緩，但明日葉凍干粉本身含有較多黃酮類(lèi)物質(zhì)，故在添加量超過(guò)15.0 g 后總黃酮含量并未明顯降低而表現(xiàn)為緩慢增長(zhǎng)，當(dāng)添加量為20.0 g 時(shí)總黃酮含量達(dá)到最大值，為1.33 g/L；γ-氨基丁酸含量隨著明日葉凍干粉添加量的變化先增后減，當(dāng)添加量為17.5 g 時(shí)，γ-氨基丁酸含量達(dá)到最大值，為7.49 g/L，過(guò)量的明日葉凍干粉可能會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵液濃度過(guò)高，從而不利于酵母菌的生長(zhǎng)與代謝，導(dǎo)致添加量超過(guò)17.5 g 之后γ-氨基丁酸含量開(kāi)始下降。因此后續(xù)試驗(yàn)中明日葉凍干粉添加量選擇在15.0～20.0g之間為宜。

圖2 明日葉凍干粉添加量對(duì)發(fā)酵的影響Fig.2 Effect of A.keiskei freeze-dried powder addition on fermentation

2.1.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響

由圖3 可知，發(fā)酵液中總黃酮與γ-氨基丁酸含量隨著發(fā)酵時(shí)間的變化均呈先增加后減少的趨勢(shì)。當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為96 h 時(shí)，總黃酮與γ-氨基丁酸含量均達(dá)到最大值，分別為1.46、7.59 g/L。在發(fā)酵的初始階段，酵母菌通過(guò)破壞植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)、水解有機(jī)物以及釋放酶類(lèi)物質(zhì)等途徑將原料中的黃酮類(lèi)物質(zhì)釋放出來(lái)，同時(shí)通過(guò)代謝不斷產(chǎn)生γ-氨基丁酸并進(jìn)行累積。在發(fā)酵時(shí)間達(dá)到96 h 后，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，發(fā)酵體系內(nèi)微生物數(shù)量過(guò)多，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)通過(guò)微生物的呼吸作用被利用，消耗大于生成，加之氧化作用[33]等因素，導(dǎo)致黃酮類(lèi)物質(zhì)和γ-氨基丁酸含量下降。故選用72～120h 的發(fā)酵時(shí)間作為后續(xù)優(yōu)化條件。

圖3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵的影響Fig.3 Effects of fermentation time on fermentation

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析

2.2.1 回歸模型的建立與分析

通過(guò)單因素試驗(yàn)確定試驗(yàn)條件的范圍，以總黃酮與γ-氨基丁酸含量的綜合評(píng)分作為響應(yīng)值（Y），酵母菌接種量（A）、明日葉凍干粉添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）為自變量?jī)?yōu)化發(fā)酵工藝，結(jié)果見(jiàn)表3。通過(guò)Design Expert 8.0.6 軟件分析，建立模型，并得到二次回歸方程：Y=0.95+0.014A-0.00505B+0.019C+0.061AB-0.022AC-0.016 BC-0.098A2-0.074B2-0.088C2。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 3 Response surface experiment design and results

2.2.2 方差分析

對(duì)得到的回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4 所示。由表4 可知，該回歸模型P＜0.0001，達(dá)到了極顯著水平，失擬項(xiàng)（P=0.0519＞0.05）不顯著，且R2=0.9912 表明該模型可接受，具有較高的擬合度，可利用該模型評(píng)價(jià)上述變量參數(shù)對(duì)于明日葉酵素總黃酮與γ-氨基丁酸含量綜合得分的影響。由表中P值可知，模型中因子C、AB、A2、B2、C2對(duì)明日葉酵素綜合得分影響極顯著（P＜0.01），因子A、AC、BC 對(duì)明日葉酵素綜合得分影響顯著（P＜0.05）。表明各因素對(duì)綜合得分的影響為非線(xiàn)性關(guān)系。根據(jù)F值大小，可以判斷出各試驗(yàn)因素對(duì)酵母菌制備明日葉酵素的工藝影響由大到小依次為發(fā)酵時(shí)間（C）、酵母菌接種量（A）、明日葉凍干粉添加量（B）。

表4 回歸模型方差分析Table 4 Analysis of variance of regression model

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析與優(yōu)化

圖4 是酵母菌接種量（A）、明日葉凍干粉添加量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）三變量之間對(duì)綜合評(píng)分的響應(yīng)面分析圖。由圖4A 可知，在發(fā)酵時(shí)間取零水平時(shí)，當(dāng)明日葉凍干粉添加量固定，綜合得分隨著酵母菌接種量的增加先升高而后降低；當(dāng)酵母菌接種量固定，綜合得分隨著明日葉凍干粉添加量的增加先升高后快速下降，且坡度較陡、等高線(xiàn)為橢圓形，表明酵母菌接種量與明日葉凍干粉添加量的交互作用極顯著。同理，由圖4B、4C 可知，酵母菌接種量與發(fā)酵時(shí)間、明日葉凍干粉添加量與發(fā)酵時(shí)間的交互作用對(duì)明日葉酵素的綜合得分影響顯著。

圖4 各因素間的交互作用Fig.4 Interaction between the setting factors

2.2.4 最優(yōu)發(fā)酵工藝條件確定及驗(yàn)證性試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面分析得到酵母菌發(fā)酵制備明日葉酵素的最佳工藝條件為酵母菌接種量為1.528%、明日葉凍干粉添加量為17.4400 g、發(fā)酵時(shí)間為98.5000 h，此條件下明日葉酵素綜合得分預(yù)測(cè)值為0.9480。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)的可行性，將工藝條件修正為酵母菌接種量1.5%、明日葉凍干粉添加量17 g、發(fā)酵時(shí)間98 h。利用此條件，進(jìn)行3次平行發(fā)酵試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證，得到綜合得分的平均值為（0.9470±0.0097）分，與預(yù)測(cè)值誤差1.0260%，在允許范圍內(nèi)，說(shuō)明該模型擬合度較高，能夠有效預(yù)測(cè)明日葉酵素的發(fā)酵工藝。

2.3 酵母菌制備明日葉酵素的理化特性及感官評(píng)分

根據(jù)得到的最佳工藝條件，測(cè)定對(duì)照組（未接菌）和最佳發(fā)酵工藝條件下所得的明日葉酵素的理化特性和感官評(píng)分，對(duì)進(jìn)一步驗(yàn)證最佳發(fā)酵工藝的優(yōu)劣極其必要。由表5 可知，與對(duì)照組（未接菌）相比，經(jīng)過(guò)最佳發(fā)酵工藝后得到的明日葉酵素的總黃酮含量、γ-氨基丁酸含量、查爾酮含量、總酚含量、游離氨基酸含量、蛋白質(zhì)含量和感官評(píng)分都顯著高于對(duì)照組（未接菌）（P＜0.05），這說(shuō)明結(jié)合微生物的發(fā)酵作用對(duì)制備明日葉酵素具有積極作用，可能是因?yàn)榻湍妇诎l(fā)酵期間不斷分泌蛋白酶、纖維素酶、果膠酶等功能酶，通過(guò)酶的協(xié)同作用將植物細(xì)胞中不易被消化的大分子多糖、蛋白質(zhì)以及脂類(lèi)等物質(zhì)分解成易被吸收的小分子物質(zhì)[34]。發(fā)酵液中微生物活動(dòng)還可以破壞植物細(xì)胞，加速細(xì)胞中酚類(lèi)、黃酮類(lèi)等物質(zhì)溶出，增加產(chǎn)量。游離氨基酸代謝產(chǎn)生酸、醇、醛、酯等氣味化合物，其含量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的風(fēng)味品質(zhì)具有重要影響[35]。本發(fā)酵體系中，通過(guò)最優(yōu)工藝發(fā)酵，游離氨基酸含量提高了約20 倍，感官評(píng)分從76.8 提高到81.4，發(fā)酵產(chǎn)物酸甜適宜，口感柔順，具有明日葉特有的清香，風(fēng)味良好。其pH 值有所升高，可能是發(fā)酵過(guò)程中消耗了酸類(lèi)物質(zhì)所致。上述結(jié)果表明本試驗(yàn)制備的明日葉酵素不僅具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，還含有豐富的活性物質(zhì)，有望開(kāi)發(fā)成為功能性食品類(lèi)產(chǎn)品。

表5 對(duì)照組與最佳發(fā)酵工藝所得明日葉酵素的理化特性和感官評(píng)分Table 5 Physicochemical properties and sensory scores of A. keiskei Jiaosu obtained from the control group and the optimal fermentation process

3 結(jié)論

本研究以明日葉凍干粉為原料，通過(guò)單因素及響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，得到酵母菌制備明日葉酵素的最優(yōu)發(fā)酵工藝條件：酵母菌接種量為1.528%、明日葉凍干粉添加量為17.44 g、發(fā)酵時(shí)間為98.5 h。其中在響應(yīng)面設(shè)計(jì)及分析中，得到各試驗(yàn)因素對(duì)酵母菌制備明日葉酵素的工藝影響程度由高到低依次為發(fā)酵時(shí)間、酵母菌接種量、明日葉凍干粉添加量。根據(jù)實(shí)際生產(chǎn)需要，將工藝條件修正為酵母菌接種量1.5%、明日葉凍干粉添加量17 g、發(fā)酵時(shí)間98h。本試驗(yàn)選出的最佳發(fā)酵條件與已有報(bào)道相符[36]。在此條件下得到的明日葉酵素的綜合評(píng)分為0.9470 分（滿(mǎn)分為1），與模型預(yù)測(cè)值相近。然后進(jìn)一步通過(guò)比較對(duì)照組與最佳工藝條件制備的明日葉酵素，得到了總黃酮含量為1.40 g/L、γ-氨基丁酸含量為8.46 g/L、查爾酮含量為0.05 g/L、總酚含量為0.07 g/L、游離氨基酸含量為10.96 g/L、蛋白質(zhì)含量為4.11 g/L、pH 5.44、可溶性固形物3.63%、感官評(píng)分81.4 分的明日葉酵素，驗(yàn)證了此最優(yōu)發(fā)酵條件能得到品質(zhì)優(yōu)良的明日葉酵素產(chǎn)品，符合國(guó)家行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及市場(chǎng)要求，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)，具有廣闊的發(fā)展前景。