俞麗娜,歐陽志斌,張 琳,蔣錦杏,齊 暉,任莉莉,鄧春艷△

(深圳市人民醫(yī)院/暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院/南方科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院:1.生物治療室;2.婦科,廣東 深圳 518020)

子宮內(nèi)膜異位癥(內(nèi)異癥)是指子宮內(nèi)膜組織出現(xiàn)在子宮腔以外的部位,并不斷種植、生長引發(fā)的疾病,是引起育齡期婦女不孕及慢性盆腔疼痛的主要原因之一[1]。其雖是一種良性病變,但在生物學(xué)行為上卻具有增生、浸潤、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等惡性特征,現(xiàn)有的激素和手術(shù)治療等手段均難以解決復(fù)發(fā)率高的問題,嚴(yán)重影響廣大女性身心健康[2]。內(nèi)異癥的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確,隨著基礎(chǔ)研究的不斷深入,免疫和炎癥因素在其發(fā)病中的作用越來越受到重視[3-4]。近年來,有研究表明,由免疫細(xì)胞分泌細(xì)胞因子導(dǎo)致腹腔內(nèi)環(huán)境改變可能是內(nèi)異癥發(fā)病的關(guān)鍵。內(nèi)異癥患者血清、腹腔液、局部異位病灶中各種細(xì)胞免疫成分發(fā)生了功能性改變,導(dǎo)致免疫監(jiān)視、防御功能缺陷,機(jī)體無法清除異位的子宮內(nèi)膜,復(fù)雜的炎性反應(yīng)生成大量的炎性細(xì)胞因子,促進(jìn)異位內(nèi)膜的侵襲和增殖,以及局部增生、粘連[5-6]。既往關(guān)于內(nèi)異癥中細(xì)胞因子水平的文獻(xiàn)報道尚具有一些爭議,且局限于數(shù)量較少的某些特定細(xì)胞因子,較少對外周血和腹膜液細(xì)胞因子水平的相關(guān)性進(jìn)行分析。因此,本研究采用流式熒光微球高通量篩查技術(shù),同時檢查了包括γ干擾素(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、 IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-17F、IL-22、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、TNF-β等14種細(xì)胞因子水平在中重度內(nèi)異癥婦女外周血和腹腔液中的水平,觀察了內(nèi)異癥患者循環(huán)和局部細(xì)胞因子譜的改變及各因子之間的相關(guān)性,以有助于進(jìn)一步闡明內(nèi)異癥的免疫發(fā)病機(jī)制,旨在為疾病預(yù)防、早期診斷和治療提供新的靶點(diǎn)。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取2019年3月至2021年10月本院婦科收治的內(nèi)異癥患者28例作為內(nèi)異癥組,年齡24～48歲,月經(jīng)規(guī)律,月經(jīng)周期28～32 d,無其他內(nèi)外科合并疾病,術(shù)前3個月內(nèi)未服用激素類藥物;經(jīng)術(shù)中腹腔鏡檢查及病理檢測確診,按美國生育學(xué)會分期法[7]為Ⅲ～Ⅳ期盆腔內(nèi)異癥。選擇同期在本院進(jìn)行健康體檢女性30例作為對照組,年齡26～49歲。2組研究對象年齡、體重指數(shù)(BMI)等一般資料比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。見表1。本研究已獲本院倫理委員會審批,2組研究對象均簽署本研究知情同意書。

表1 2組研究對象一般資料比較

1.1.2儀器與試劑 IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-17F、IL-22、TNFα、TNFβ流式免疫熒光發(fā)光法檢測試劑均由天津曠博同生生物技術(shù)有限公司提供,流式細(xì)胞儀購自常州必達(dá)科生物科技有限公司(型號BeamCyte-1026)。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 2組研究對象均于末次月經(jīng)結(jié)束后7 d內(nèi)留取標(biāo)本。采集2組研究對象體檢時、術(shù)前1 d用乙二胺四乙酸抗凝的空腹靜脈血2 mL,3 000 r/min離心10 min分離血漿,-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。?nèi)異癥組患者于腹腔鏡手術(shù)開始時經(jīng)穿刺針或注射器吸取子宮膀胱陷凹和直腸子宮陷凹腹腔液,置于無菌管內(nèi),以3 000 r/min離心10 min取上清液-80 ℃保存?zhèn)溆?有血液污染者棄置不用。28例內(nèi)異癥患者中留取腹腔原液標(biāo)本18例。

1.2.2細(xì)胞因子檢測 采用高通量細(xì)胞因子檢測實(shí)驗(yàn)試劑盒利用液相芯片與雙抗夾心相結(jié)合的原理。采用兩種不同尺寸(4、5μm)、14種不同熒光強(qiáng)度的微球群上分別包被IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12p70、IL-17A、IL-17F、IL-22、TNFα、TNFβ特異性抗體(捕獲微球),可與樣本中相應(yīng)的細(xì)胞因子特異性結(jié)合,加入生物素標(biāo)記的檢測抗體,形成抗體捕獲微球-細(xì)胞因子-檢測抗體的免疫復(fù)合物;之后加入藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標(biāo)記的鏈霉親和素,在流式細(xì)胞儀上檢測相應(yīng)熒光,通過免疫復(fù)合物的熒光強(qiáng)度得到待測樣本中相應(yīng)細(xì)胞因子含量,采用FCAP Array V3軟件(美國BD公司)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和分析。

2 結(jié) 果

2.12組研究對象血漿細(xì)胞因子水平比較 與對照組比較,內(nèi)異癥組患者血漿IL-1β、IL-2水平明顯降低,IL-4、IL-6、IL-8、IL-17A、TNF-α、TNF-β水平,以及IL-17A/IL-10、IL-17F/IL-10比值均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);2組研究對象血漿IFN-γ、IL-5、IL-10、IL-12p70、IL-17F、IL-22,以及IFN-γ/IL-4、IL-22/IL-10比值比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2、3。采用PCA方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行降維及可視化處理后可見2組研究對象血漿細(xì)胞因子譜清晰可分。見圖1。

圖1 2組研究對象血漿14種細(xì)胞因子PCA分?jǐn)?shù)圖

表2 2組研究對象血漿細(xì)胞因子水平比較(pg/mL)

表3 2組研究對象血漿部分細(xì)胞因子比值比較[M(P25,P75)]

2.2內(nèi)異癥患者血漿細(xì)胞因子相關(guān)性 內(nèi)異癥患者血漿IL-4與IL-17A、IL-22與IL-17F、TNF-β與IL-1β分別呈正相關(guān)(r=0.623、0.473、0.429,P<0.001、0.011、0.023);對照組研究對象血漿IFN-γ與IL-2、IL-4分別呈正、負(fù)相關(guān)(r=0.467、-0.416,P=0.009、0.022),IL-6與IL-22、TNF-α均呈正相關(guān)(r=0.555、0.417,P=0.001、0.022),IL-17F與IL-12p70、IL-22、TNF-α均呈正相關(guān)(r=0.488、0.600、0.438,P=0.006、<0.001、0.016),IL-22與IL-12p70、IL-17F、TNF-α均呈正相關(guān)(r=0.447、0.600、0.725,P=0.013、<0.001、<0.001)。

2.3內(nèi)異癥患者腹腔液細(xì)胞因子水平 腹腔液細(xì)胞因子水平見表4。內(nèi)異癥患者腹腔液IL-5與IL-1β、IL-22均呈正相關(guān)(r=0.478、0.502,P=0.045、0.034),IL-6與IFN-γ、IL-4、IL-8均呈正相關(guān)(r=0.553、0.559、0.523,P=0.017、0.016、0.026),IL-12p70與IL-10呈負(fù)相關(guān)(r=-0.507,P=0.032),IL-17A與IL-10呈正相關(guān)(r=0.548,P=0.019),IL-17F與IFN-γ呈正相關(guān)(r=0.591,P=0.010)。

表4 內(nèi)異癥患者腹腔液細(xì)胞因子水平(pg/mL,n=18)

2.4內(nèi)異癥患者腹腔液與血漿細(xì)胞因子的相關(guān)性 腹腔液IFN-γ與血漿IFN-γ、IL-17F均呈正相關(guān)(r=0.607、0.594,P=0.008、0.010),腹腔液IL-8與血漿IL-8、TNF-α均呈正相關(guān)(r=0.820,P<0.001),腹腔液IL-10與血漿TNF-α呈正相關(guān)(r=0.635,P=0.005),腹腔液IL-12p70與血漿IFN-γ呈正相關(guān)(r=0.517,P=0.028),腹腔液IL-17A與血漿TNF-α呈正相關(guān)(r=0.678,P=0.002),腹腔液IL-17F與血漿IFN-γ、TNF-β均呈正相關(guān)(r=0.490、0.525,P=0.039、0.025),腹腔液TNF-α與血漿TNF-α呈正相關(guān)(r=0.765,P<0.001),腹腔液TNF-β與血漿IL-Iβ、TNF-β均呈正相關(guān)(r=0.506、0.725,P=0.032、0.001),腹腔液IL-2與血漿IL-17A呈負(fù)相關(guān)(r=-0.498,P=0.035)。

3 討 論

越來越多的證據(jù)表明,在內(nèi)異癥的發(fā)生、發(fā)展過程中多種免疫細(xì)胞功能發(fā)生紊亂,循環(huán)或局部相關(guān)細(xì)胞因子水平也出現(xiàn)異常[8]。本研究選取健康體檢女性作為對照,采用流式高通量檢測技術(shù)同時檢測中重度內(nèi)異癥患者血漿和腹腔液樣本中14種細(xì)胞因子水平,以評價細(xì)胞因子譜改變在內(nèi)異癥發(fā)病中的重要性。2組研究對象年齡比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),排除了年齡因素對體內(nèi)細(xì)胞因子水平的可能影響;2組研究對象BMI比較,差異接近統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.054),內(nèi)異癥組患者BMI顯示出與既往研究[9]一致的降低趨勢。

從免疫學(xué)的觀點(diǎn)來看,內(nèi)異癥不僅是一種炎癥性疾病,而是一種促炎和抗炎狀態(tài)相結(jié)合的疾病[10]。既往研究提示,內(nèi)異癥患者血清、腹膜液和異位病變中存在異常的免疫和炎性反應(yīng),促炎性細(xì)胞因子(IFN-γ、TNF-α、IL-1β、IL-6、IL- 17A等)和抗炎性細(xì)胞因子(IL-10、IL-4等)水平均可升高[5,11],但也有一些研究提示,某些因子水平出現(xiàn)降低或無變化[12-13]。本研究結(jié)果顯示了細(xì)胞因子水平變化的復(fù)雜性,患者血漿促炎性細(xì)胞因子——TNF-α、IL-6、TNF-β和抗炎性細(xì)胞因子——IL-4均明顯升高,巨噬細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子——IL-8和輔助性T淋巴細(xì)胞17(Th17)分泌的細(xì)胞因子——IL-17A也增加,但I(xiàn)L-1β、IFN-γ、IL-10卻沒有增加。研究結(jié)果的不一致性和復(fù)雜性可能與疾病分期、樣本量、檢測方法、采樣時間點(diǎn)等因素有一定的關(guān)系,但更可能與細(xì)胞因子之間相互調(diào)節(jié)的反饋機(jī)制有關(guān)。細(xì)胞因子通過自分泌、旁分泌和內(nèi)分泌進(jìn)行近距離和遠(yuǎn)距離的通訊,形成一個復(fù)雜的對免疫細(xì)胞的作用網(wǎng)絡(luò)。這種相互作用網(wǎng)絡(luò)模式提示,對內(nèi)異癥患者體內(nèi)循環(huán)或局部細(xì)胞因子水平進(jìn)行分析時將單個細(xì)胞因子水平變化孤立分析的方法具有一定的局限性,全面的細(xì)胞因子譜及相關(guān)性分析可能更有意義。本研究運(yùn)用了PCA分析方法對來源于2組研究對象血漿的14種細(xì)胞因子數(shù)據(jù)進(jìn)行了降維及可視化處理,從PCA分?jǐn)?shù)圖可見,2組研究對象數(shù)據(jù)清晰可分,顯示了不一樣的細(xì)胞因子譜。今后在擴(kuò)大樣本量和對照數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上有望通過結(jié)合PCA、聚類分析等統(tǒng)計學(xué)方法建立較好的細(xì)胞因子譜診斷模型。

本研究分別對2組研究對象血漿14種因子之間的兩兩相關(guān)性進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示,對照組研究對象血漿多對細(xì)胞因子間出現(xiàn)不同程度的相關(guān)性,內(nèi)異癥組患者只有TNF β與IL-1β、IL-4與IL-17A、IL-22與IL-17F之間存在一定的相關(guān)性,提示健康者細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)調(diào)控能通過相互調(diào)節(jié)更好地維持平衡,而內(nèi)異癥患者體內(nèi)免疫平衡被打破,更進(jìn)一步證實(shí)了免疫紊亂在疾病進(jìn)程中的作用。

據(jù)文獻(xiàn)報道,在內(nèi)異癥中包括Th1、Th2、Th17和調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞(Treg)等在內(nèi)的多種T淋巴細(xì)胞亞群均發(fā)生了數(shù)量或功能改變[14-15]。但既往的研究數(shù)據(jù)也出現(xiàn)了不一致的情況。如GOGACZ等[16]研究表明,內(nèi)異癥患者腹腔液和血液Th17水平均升高,并與嚴(yán)重程度相關(guān);KHAN等[17]卻發(fā)現(xiàn),腹腔液Treg增多,腹腔液和外周血Th17比例相對降低;ANDREOLI等[18]和TAROKH等[5]則認(rèn)為,IL-17水平高低與內(nèi)異癥無關(guān),但內(nèi)異癥患者腹腔液和血清IL-17/IL-10、IL-17/IL-23比值均升高。相互沖突的結(jié)果提示,在尋找疾病的臨床免疫學(xué)機(jī)制時單一研究某一種T淋巴細(xì)胞可能很難解釋復(fù)雜的免疫現(xiàn)象,探討T淋巴細(xì)胞亞群相互之間的影響和調(diào)控也許更為重要。

已有研究表明,當(dāng)Th1 和Th2 之間的平衡被打破并出現(xiàn)Th2 偏移時機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài),可加速內(nèi)異癥患者病情進(jìn)展[4,19]。本研究結(jié)果顯示,內(nèi)異癥患者血漿IFN-γ/IL-4比值與對照組比較,雖然沒有統(tǒng)計學(xué)意義,但有降低的趨勢,符合內(nèi)異癥Th1/Th2失衡的炎癥基礎(chǔ)。據(jù)文獻(xiàn)報道,內(nèi)異癥患者腹腔液Th17比例增加,導(dǎo)致IL-17表達(dá)增加,促進(jìn)慢性炎癥[20]。正常情況下機(jī)體Th17和Treg也存在平衡,當(dāng)這一平衡被打破時可引起一系列免疫反應(yīng),引發(fā)相應(yīng)疾病。目前,已有研究證實(shí),腫瘤、自身免疫疾病、炎癥、感染等均與Th17/Treg失衡有關(guān)[21],對內(nèi)異癥的發(fā)生、發(fā)展也具有重要影響[5,17,19]。本研究結(jié)果顯示,內(nèi)異癥組患者血清IL-17A水平增加,且IL-17A/IL-10、IL-17F/IL-10比值均較對照組升高,是Th17與Treg比例失衡的必然結(jié)果。TAROKH等[5]指出,在內(nèi)異癥患者的每個月經(jīng)周期中T淋巴細(xì)胞亞群(Th17、Th1、Th2、Treg等)均在增加和抑制炎癥的免疫平衡調(diào)控中發(fā)揮作用。早期由于缺乏足夠的防御機(jī)制,Th17在先天免疫信號的作用下引發(fā)局部炎性反應(yīng),繼而產(chǎn)生Th1反應(yīng);隨后在激素發(fā)生變化后Th2可能成為主導(dǎo)細(xì)胞,并改變平衡,向激活Treg和組織修復(fù)方向發(fā)展。這種情況在每個月經(jīng)周期中重復(fù)出現(xiàn),數(shù)年后出現(xiàn)局部組織纖維化、嚴(yán)重的器官附著和內(nèi)異癥[5]。

另一方面,在本研究選取的Ⅲ、Ⅳ期病例中多個腹腔液細(xì)胞因子水平之間,以及腹腔液與血漿中某些細(xì)胞因子之間均存在一定的相關(guān)性,尤其是IFN-γ、IL-8、TNF-α、TNF-β在腹腔液與血液中的水平具有各自對應(yīng)的正相關(guān)性,更進(jìn)一步證實(shí)了細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)在循環(huán)和局部微環(huán)境中作用的復(fù)雜特點(diǎn)及這些細(xì)胞因子在疾病背景下的合作。

綜上所述,通過應(yīng)用流式熒光微球高通量篩查技術(shù)證實(shí)了中重度內(nèi)異癥患者循環(huán)和局部細(xì)胞因子譜的改變及各因子之間的相關(guān)性,將有助于從免疫應(yīng)答整體的相互作用及整個細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)水平探討內(nèi)異癥的免疫發(fā)病機(jī)制,為疾病預(yù)防、早期診斷和治療提供新的依據(jù)。