李 慧,張 浩,陳 朋,魏 翔,方 瑩,王 靜,陳雪祎,孫 麗,王海華

(皖南醫(yī)學院 1.生理學教研室;2.臨床醫(yī)學院;3.藥學院,安徽 蕪湖 241002)

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是直腸和結腸黏膜的一種慢性、特發(fā)性和炎癥性疾病[1],其特征在于反復腹痛、腹瀉、黏液性膿性血便和體質(zhì)量減輕以及結腸縮短等[2],其發(fā)病率正在世界范圍內(nèi)增加,由于該病多復發(fā),易延緩,并發(fā)生癌變,嚴重影響患者的生活質(zhì)量,并且增加患者和社會的經(jīng)濟負擔,世界衛(wèi)生組織將其列為現(xiàn)代難治性疾病之一[3-4]。目前,臨床對于UC的治療尚缺乏根治手段。因此,尋找更為有效的治療藥物意義重大。

水溶性蜂膠(water soluble propolis,WSP)的生物活性在對抗氧化、炎癥、腫瘤、病菌等方面發(fā)揮重要作用[5]。前期實驗發(fā)現(xiàn)WSP能夠改善高血壓大鼠的血管內(nèi)皮損傷[6]。文獻報道,WSP能保護UC大鼠腸道黏膜屏障功能緩解結腸炎癥[7],但其機制尚不明確。本研究建立UC大鼠模型,觀察不同濃度WSP對UC大鼠腸系膜動脈內(nèi)皮功能的作用及機制,為臨床UC患者的防治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 24只雄性SD大鼠[SPF級,(200±20)g],許可證號SYXK(皖)2018-004,河南朋悅實驗動物繁育有限公司,實驗前在室溫下適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 試劑與器材 DSS(MP 0216011080,Sigma公司)、WSP(批號:20210325-B,廣州市杰禾蜂業(yè)有限公司);微血管張力測定儀(丹麥);去甲腎上腺素[NE,遠大醫(yī)藥(中國)有限公司];乙酰膽堿(ACh,上海麥克林公司);硝普納(SNP,廣東宏遠藥業(yè)公司);左旋硝基精氨酸甲酯(N-nitro-L-arginine-methy-ester,L-NAME,Sigma公司);內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase,eNOS)和一氧化氮(nitric oxide,NO)(南京建成生物工程研究所)。

1.3 模型制備和給藥方式 大鼠隨機分成4組(n=6),即正常對照組(NC組)、潰瘍性結腸炎組(DSS組)、蜂膠低劑量組(L-WSP組)、蜂膠高劑量組(H-WSP組),模型制備:大鼠自由飲用5%DSS溶液7 d復制UC模型;造模結束后,NC組和DSS組大鼠經(jīng)口灌胃等量蒸餾水,L-WSP組和H-WSP組大鼠經(jīng)口灌胃WSP 50 mg/(kg·d)和200 mg/(kg·d),連續(xù)7 d,每日一次;觀察并記錄各大鼠的精神狀態(tài)、飲食飲水和糞便情況。

1.4 實驗方法

1.4.1 HE染色觀察結腸組織的形態(tài)學變化 將固定于4%多聚甲醛中的大鼠結腸組織,分別用15%和30%的蔗糖溶液脫水1 d,OCT包埋后切成8 μm的切片,放于-20℃冰箱保存。染色后在顯微鏡下觀察結腸組織的組間變化。

1.4.2 張力測定儀(DMT)檢測離體腸系膜血管張力變化 先將血管環(huán)標準化[8],用60 mmol/L KPSS溶液刺激血管收縮2次,當收縮力>3 mN時血管活性較好[9],可進行下一步實驗。通過采集系統(tǒng)記錄10-9～10-4mol/L的ACh和SNP介導的腸系膜動脈血管的舒張強度變化?？紤]其可能的作用機制,血管槽中加入10-4mol/L的L-NAME孵育血管30 min后加入上述濃度的ACh,記錄血管舒張強度變化。用每一舒張強度占PE的10-5mol/L的收縮強度計算舒張效應,并用百分比表示[舒張強度即△(Ach/SNP)=PE收縮平臺-Ach/Snp舒張反應峰]。

1.4.3 大鼠腸系膜動脈血管組織結構觀察 分離好大鼠腸系膜三級動脈血管在4%的多聚甲醛中固定,先后在15%和30%的蔗糖溶液中各脫水1 d,OCT包埋切成7 μm切片,染色后觀察血管結構,腸系膜動脈血管壁厚度/管腔半徑(WT/LR)用Image-Pro Plus 6.0軟件分析。

1.4.4 檢測腸系膜動脈血管eNOS活性和NO含量 大鼠腸系膜動脈血管中NO用硝酸還原法測定,eNOS用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)測定。操作步驟按試劑盒說明書進行。

2 結果

2.1 大鼠的一般狀況 實驗開始時,大鼠的精神狀況、飲食飲水以及糞便等狀況都比較正常。造模后,隨著實驗的進程,大鼠開始出現(xiàn)精神萎靡、不活躍、食欲下降、嗜睡扎堆,部分老鼠肛周還出現(xiàn)嚴重的血便,身形消瘦并且有拱背站立不穩(wěn)現(xiàn)象。給予WSP灌胃后,大鼠的精神狀況逐漸好轉,開始活躍,肛周血跡逐漸減輕,隱血情況均有所好轉。

2.2 大鼠結腸長度的變化 潰瘍性結腸炎的一個重要特征是老鼠結腸長度縮短[10]。與NC組比較,DSS組大鼠的結腸長度縮短(P<0.01)。與DSS組比較,L-WSP組大鼠結腸長度增長(P<0.05);H-WSP組大鼠結腸長度增長(P<0.01)(圖1)。

n=6,F=29.937,P<0.001;**P<0.01 vs. NC;#P<0.05;##P<0.01 vs. DDS。

2.3 結腸組織形態(tài)學的組間變化 與NC組比較,DSS組大鼠結腸黏膜上皮遭到嚴重破壞,腸黏膜出現(xiàn)脫落,有大量的潰瘍,糜爛嚴重,腸腺細胞和杯狀細胞形態(tài)結構破壞數(shù)量減少。與DSS組比較,L-WSP和H-WSP組大鼠結腸組織的結構和形態(tài)損傷有所恢復,結腸黏膜上皮細胞、腺體細胞和杯狀細胞的數(shù)量和形態(tài)結構已接近正常大鼠(圖2)。

圖2 各組大鼠結腸組織形態(tài)學變化(10×10)

2.4 大鼠腸系膜動脈血管結構和WT/LR的變化 與NC組相比,DSS組大鼠血管壁增厚,且WT/LR升高(P<0.01)。與DSS組相比,L-WSP組和H-WSP組大鼠的血管壁均變薄,WT/LR均下降(P<0.01),見圖3。

A.大鼠腸系膜動脈血管HE染色切片(10×10);B.WT/LR(n=6);F=19.922,P<0.001;**P<0.01 vs. NC;##P<0.01 vs. DDS。

2.5 大鼠腸系膜動脈血管舒張功能的變化

2.5.1 ACh/SNP介導NC、DSS組大鼠腸系膜動脈的舒張反應 與NC組相比,DSS組大鼠腸系膜動脈對ACh介導的舒張反應減弱(P<0.01);對SNP介導的舒張反應差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖4)。

n=6,**P<0.01,***P<0.001 vs. NC。

2.5.2 ACh介導的各組大鼠腸系膜動脈舒張反應 與NC組相比,DSS組大鼠腸系膜動脈對ACh介導的舒張反應降低(P<0.01)。與DSS組比較,L-WSP組和H-WSP組大鼠腸系膜動脈對ACh介導的舒張反應增強(P<0.05)(圖5)。

n=6,**P<0.01,***P<0.001 vs. NC;#P<0.05,##P<0.01,##P<0.001 vs. DDS。

2.5.3 抑制劑對大鼠動脈血管舒張反應的影響 NO抑制劑L-NAME孵育血管30 min后,NC組、L-WSP組和H-WSP組大鼠腸系膜動脈對ACh介導的舒張反應均受到抑制(P<0.05);而DSS組改變無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖6)。

n=6,*P<0.05;**P<0.01;***P<0.001。

2.6 大鼠腸系膜動脈eNOS活性和NO含量的變化 與NC組相比,DSS組大鼠腸系膜血管中eNOS活性和NO含量降低(P<0.01);與DSS組相比,L-WSP和H-WSP組大鼠腸系膜血管中eNOS活性和NO含量增加(P<0.01)(見表1)。

表1 大鼠腸系膜動脈eNOS活性和NO含量的組間變化

3 討論

UC發(fā)病率日益增多,患者病程反復發(fā)作,致使腸道癌變的風險增加,嚴重影響患者的生存質(zhì)量,尋找更有效的防治療策略顯得尤為重要。本研究采用5% DSS溶液誘導UC大鼠模型。結果表明,與NC組相比,DSS組大鼠的一般狀態(tài)變差、結腸長度明顯縮短、結腸組織病理變化明顯,與Saber等[11]報道的模型標準相似。有研究證實UC患者的病程嚴重程度與血管內(nèi)皮功能障礙等相關[12],血管內(nèi)皮功能受損,使血管通透性增加及微循環(huán)功能障礙[13]。若微循環(huán)功能障礙,將引發(fā)一系列的病理生理變化,致使組織器官功能障礙[14]。目前UC患者均以對癥治療為主且副作用大,尚缺乏根治手段,尋求有效防治策略迫在眉睫,富含多酚的食物和植物藥由于在炎癥局部作用、起效明顯、副作用小等特點,在防治UC過程中具有潛力。

WSP來自蜜蜂從富含多酚的植物中收集的樹脂,實驗顯示W(wǎng)SP能改善高血壓大鼠的血管內(nèi)皮損傷[6]。本研究顯示UC大鼠腸系膜動脈血管壁增厚,WT/LR上升。WSP灌胃給藥后大鼠腸系膜動脈血管壁變薄,WT/LR下降,表明WSP對UC大鼠腸系膜動脈血管損傷有改善作用。

血管內(nèi)皮細胞在調(diào)控血管收縮和舒張功能,維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)以及新陳代謝等方面發(fā)揮重要作用。ACh是膽堿能神經(jīng)遞質(zhì),能結合內(nèi)皮上的M3受體刺激NO的產(chǎn)生舒張血管內(nèi)皮[15],SNP則可以分解NO激活sGC/cGMP/PKG通路引起血管平滑肌產(chǎn)生舒張反應[16-17]。本研究對血管張力檢測發(fā)現(xiàn),與NC組相比,DSS組大鼠血管對ACh介導的舒張反應明顯下降,而對SNP介導的舒張反應差異無統(tǒng)計學意義。表明UC會導致動脈血管內(nèi)皮舒張功能障礙,而不是SNP介導的平滑肌舒張功能障礙。內(nèi)皮細胞中NO主要是通過eNOS作用生成的并發(fā)揮內(nèi)皮依賴性血管舒張效應,如果血管內(nèi)皮功能障礙,導致eNOS活性降低,NO生成亦減少,致使血管內(nèi)皮舒張功能低下[18]。本研究用NO抑制劑L-NAME孵育血管30 min檢測血管對ACh介導舒張反應,同時檢測腸系膜動脈血管組織中的eNOS和NO含量。結果顯示,除DSS組外,各組大鼠腸系膜血管對ACh介導舒張反應均被抑制;UC大鼠腸系膜動脈組織中eNOS活性和NO含量降低,用WSP干預后,腸系膜中eNOS活性和NO含量升高。

綜上所述,WSP對UC大鼠腸系膜動脈血管和內(nèi)皮功能損傷有保護作用,其作用機制可能與調(diào)節(jié)eNOS/NO信號通路有關。