張 闖,汪萌芽

(皖南醫(yī)學院 細胞電生理研究室,安徽 蕪湖 241002)

去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)在運動調節(jié)中具有重要的作用[1],Tartas等首次證明新生大鼠腰部脊髓運動神經元(Motoneuron,MN)上表達α1、α2、β三種腎上腺素能受體[2]。目前,NE通過降低鉀電導引起脊髓MN去極化的作用已較為明確[2];然而,在神經網(wǎng)絡中的MN不僅接受神經調質的直接作用,其突觸輸入也是調節(jié)脊髓MN興奮性的一個重要部分。其中,Abramets等運用腹根場電位記錄技術發(fā)現(xiàn)NE可增強運動神經元的放電[3]。由于實驗方法的緣故,早期的研究還不能詳細分析NE在MN突觸傳遞上的作用。因此,本研究采用脊髓切片MN細胞內記錄技術,用電刺激同側背根(ipsilateral dorsal root,iDR)作為感覺傳入纖維的激活[4],探討NE對脊髓MN的外周傳入性突觸傳遞的影響并分析EPSP的受體動力學機制,為脊髓運動控制機制的研究提供新的認識。

1 材料和方法

1.1 實驗材料 8～14日齡新生Sprague-Dawley(SD)大鼠,雌雄不拘,購買自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司,許可證號SCXK(魯)2019-0003;DL-去甲腎上腺素鹽酸鹽購自上海麥克林生化科技有限公司,產品批號:C10982431;藥品用蒸餾水配成母液后置于低溫避光保存,臨用前用人工腦脊液(artificial cerebrospinal fluid,ACSF)稀釋到所需濃度灌流。ACSF配方:CaCl22.4 mmol/L,NaCl 127.0 mmol/L,MgSO4·7H2O 1.3 mmol/L,Glucose·H2O 10.0 mmol/L,NaHCO326.0 mmol/L,KH2PO41.2 mmol/L,KCl 1.9 mmol/L。

1.2 脊髓切片制備 根據(jù)已報道的方法[5],取SD新生大鼠經乙醚麻醉后,分離出腰骶膨大處脊髓段,用振蕩切片機(Vibratome 1500)制備400～500 μm脊髓橫切片3～6片,室溫下(25±2)℃置于含95%O2和5%CO2混合氣體飽和的ACSF中備用。

1.3 電生理記錄 將脊髓切片快速移入全浸式記錄浴槽,采用上、下絲網(wǎng)相夾的方式固定切片,經恒流泵持續(xù)向浴槽內持續(xù)灌流用混合氣體飽和的ACSF。取內充3 mol/L乙酸鉀、尖端阻抗為60～120 MΩ的微電極借助微操縱儀(MP-1,Narishige,Japan)在顯微鏡下對脊髓腹角進行細胞穿刺,記錄的電信號通過微電極放大器(Axoclamp 9000A,Axon Instruments,USA)放大后,經DigiData 1440A轉換接口(Axon)輸入計算機,用Clampex 10.2軟件(Axon)進行采樣、記錄和貯存。細胞內電流刺激經微電極注入細胞內,同側背根(iDR)和同側腹根(ipsilateral ventral root,iVR)電刺激由三通道電刺激器(Nihon Kohden,Japan)輸出,經隔離器(Nihon Kohden,Japan)以恒壓模式至同芯雙極刺激電極(Frederick Haer & Co．,USA)。利用置于iVR的刺激電極,對靜息電位(resting potential,RP)負于-60 mV且動作電位(action potential,AP)有超射的穩(wěn)定細胞進行逆行激活鑒定,若記錄到具有“全或無”特點的逆行AP,即可鑒定為MN,并用于實驗。

1.4 數(shù)據(jù)記錄與分析 實驗記錄到的數(shù)據(jù)用Clampex 10.2(Axon)保存,再用Clampfit 10.2軟件(Axon)進行細胞電生理參數(shù)分析,其中上升時間(rise time)是上升相10%～90%的時間,衰減時間(decay time)是下降相90%～10%的時間。另用表觀受體動力學分析方法對EPSP進行分析[6],其K1為表觀結合速率常數(shù);K2為表觀解離速率常數(shù);KT為表觀平衡解離常數(shù);Vmax為表觀最大反應。

2 結果

2.1 NE對脊髓MN電學性質的影響 在7個穩(wěn)定記錄的MN,1、5、25 μmol/L的NE各累積灌流15 min,均濃度依賴性誘導了伴有膜電阻增大的去極化反應(P<0.01),并降低誘發(fā)AP的基強度(P<0.01)、AP的幅度(P<0.01)、閾電位(P<0.05)、超射值(P<0.05)、鋒電位幅度(P<0.01)和最大上升速率(P<0.05),見表1。

表1 NE對脊髓MN基本電生理參數(shù)的影響

2.2 NE對脊髓MN動作電位發(fā)放頻率的影響 在7個穩(wěn)定記錄的MN,1、5、25 μmol/L的NE各累積灌流15 min,細胞不但呈現(xiàn)濃度依賴性去極化作用伴隨AP和鋒電位幅度的減小,而且升高了AP發(fā)放頻率;手動鉗制膜電位至RP水平后,AP和鋒電位的幅度可增加,但仍可觀察到NE濃度依賴性增加脊髓MN鋒電位發(fā)放頻率,ACSF沖洗后,興奮作用可被洗出,見圖1。

對照:用藥前;RP:靜息電位;鉗制:手動鉗制膜電位至RP水平,左側數(shù)字表示NE的濃度;右側數(shù)字表示膜電位的變化;沖洗:ACSF沖洗40 min。

對記錄的7個MN給予不同強度(0.4～0.8 nA,100 ms)的細胞內去極化脈沖,脊髓MN的放電頻率與電流強度相關性升高(I-F關系曲線),對7個穩(wěn)定記錄的MN累積灌流1、5、25 μmol/L的NE各15 min,觀察到脊髓MN的I-F關系曲線上移,NE濃度依賴性升高MN的動作電位發(fā)放頻率(P<0.01),見圖2。

2.3 NE對脊髓MN iDR-EPSP的影響 電刺激(0.1～0.2 ms,0.1 Hz,10～100V)脊髓iDR在7個MN誘發(fā)出iDR-EPSP,待記錄穩(wěn)定后,累積灌流1、5、25 μmol/L的NE各15 min,可濃度依賴性降低iDR-EPSP的幅度(P<0.01)、曲線下面積(P<0.01)、時程(P<0.01)、衰減時間(P<0.05),ACSF沖洗后可恢復;其典型記錄見圖3,電生理參數(shù)的統(tǒng)計結果見表2。

表2 NE對離體脊髓MN iDR-EPSP電生理參數(shù)的影響

2.4 NE影響脊髓MN iDR-EPSP表觀受體動力學的分析 對12個誘導出iDR-EPSP后可穩(wěn)定記錄的MN,灌流5 μmol/L NE可抑制iDR-EPSP,分析用藥前后的表觀受體動力學的變化,見圖4A;在12個測試細胞中的10個,iDR-EPSPs的表觀受體動力學分析顯示,NE降低表觀最大反應(Vmax)從(4.20±1.41)mV至(2.55±1.34)mV(P<0.01),降低表觀結合速率常數(shù)(K1)從(0.694±0.540)T-1·ms-1至(0.408±0.309)T-1·ms-1(P<0.05),而顯示增高表觀解離速率常數(shù)(K2)從(0.042±0.022)ms-1至(0.046±0.022)ms-1的趨勢(P>0.05),增加表觀平衡解離常數(shù)(KT)從(0.146±0.211)T至(0.248±0.297)T(P<0.05),見圖4B;另外2個MNs iDR-EPSPs的表觀受體動力學分析顯示,表觀平衡解離常數(shù)(KT)和表觀解離速率常數(shù)(K2)均減小。

3 討論

腎上腺素能受體(adrenergic receptor,AR)均為G蛋白耦聯(lián)受體,根據(jù)受體亞型激活不同的下游信號介導不同的信號轉導通路,可分為三類:α1受體(α1A、α1B、α1C)、α2受體(α2A、α2B、α2C)和β腎上腺素受體(β1、β2、β3)[7]。α1-AR激活Gq途徑,促進磷脂酶C(phospholipase C,PLC)、蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)和Ca2+釋放,并降低K+電導;而α2-AR與Gi蛋白耦聯(lián),抑制環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine,cAMP)的產生,可增加K+電導并抑制Ca2+通道[8-10]。β-AR通過Gs途徑激活腺苷酸環(huán)化酶,激活β-AR可降低K+電導,增加cAMP,增強Ca2+電流[11-12]。

近期的研究表明NE在MN上的作用是興奮的,可降低鉀電導并引起去極化反應[2,13-14],另有研究表明,早期的超極化作用可能是由于方法學上的差異造成的[15]。實驗中觀察到NE濃度依賴性誘導去極化反應并伴隨膜電阻增大等現(xiàn)象與文獻的報道一致[2]。在累積灌流不同濃度NE的MN中,AP和鋒電位的幅度均濃度依賴性減小,但手動鉗制膜電位至RP水平,其AP和鋒電位的幅度可明顯增加。該結果說明脊髓MN的AP的幅度和鋒電位的幅度降低與其去極化反應有關。另外,NE濃度依賴性增強脊髓MN鋒電位的放電頻率,其MN的I-F關系濃度依賴性上移,這與報道的NE可增加MN的放電頻率的結果一致[2]。KIR通道對膜電位和神經元興奮性具有重要的作用,也是許多G蛋白耦聯(lián)受體的主要靶標[16],在新生大鼠脊髓中,NE通過抑制KIR電流而增加MN的興奮性[2]。

研究發(fā)現(xiàn),NE既可濃度依賴性增強脊髓MN的自身活動,又可濃度依賴性抑制iDR-EPSP,且NE對突觸傳遞的抑制作用與MN膜電阻增大、放電頻率增加等電生理特性背道而馳。根據(jù)本實驗室提出的突觸反應的表觀受體動力學分析方法[6],可探討遞質與受體結合、解離的速率和受體的親和力等受體動力學性質,為抑制的機制研究提供思路。iDR-EPSP的表觀受體動力學分析表明,表觀最大反應Vmax和表觀結合速率常數(shù)K1減小,而表觀平衡解離常數(shù)KT增大和表觀解離速率常數(shù)K2有增大趨勢;該結果提示,NE作用后,突觸后表觀受體動力學過程發(fā)生改變、遞質與受體結合速率減小和突觸后受體親和力降低;另外,表觀最大反應Vmax減小可能反映了能產生效應的受體總量的減少。因此,NE抑制外周傳入的興奮性突觸傳遞可能涉及突觸后受體動力學改變或突觸后谷氨酸受體親和力降低的機制。

另有研究表明,NE通過激活突觸前的α1和β腎上腺素能受體可增加脊髓腹角神經元自發(fā)性EPSCs的頻率和幅度[8],并增強脊髓T13-L2網(wǎng)絡向運動神經元的谷氨酸能突觸輸入[2]。而在小鼠內嗅皮層神經元中,NE通過激活α2-AR減少谷氨酸能傳遞[9];在大腦皮層中,激活α1-AR可抑制谷氨酸受體介導的興奮性傳遞[17-18]。與α-AR的復雜作用不同的是,β-AR可在促進LTP的誘導和維持中發(fā)揮重要的作用[19]。此外,Liu等發(fā)現(xiàn),α2A-ARs通過負向調節(jié)AC/cAMP/PKA通路并抑制NMDA受體功能,β-AR通過正向調節(jié)cAMP/PKA途徑增強NMDA受體功能,α1A-ARs可激活PLC/IP3/Ca2+通路而抑制NMDA受體的功能[20]。因此,一種較為可能的機制是,NE既可通過G蛋白耦聯(lián)受體介導的信號轉導通路影響K+通道來改變MN的興奮性,又可通過信號轉導通路影響谷氨酸受體等的功能,從而抑制外周傳入的興奮性突觸傳遞。

A.NE濃度依賴性增加脊髓MN AP發(fā)放頻率的典型實驗記錄,RP為-63 mV;對照:用藥前;左側數(shù)字表示NE的濃度;右側數(shù)字表示細胞內去極化電流強度;沖洗:ACSF沖洗45 min。B.NE對離體脊髓MN I-F關系曲線的影響重復測量雙因素方差分析:FNE濃度=54.083,##P<0.01;F電流=5.010,**P<0.01;FNE濃度×電流=0.165,P>0.05。

對照:用藥前,左側數(shù)字表示NE的濃度,累積灌流1、5和25 μmol/L NE各15 min,沖洗:ACSF沖洗45 min,RP為-63 mV;圖中每一記錄為10次采樣的平均曲線,箭頭所指為iDR電刺激偽跡。

A.NE對脊髓MN iDR-EPSP的影響;對照:用藥前;沖洗:ACSF沖洗30 min;RP為-65 mV;B.a、b、c、d分別表示NE對iDR-EPSP表觀受體動力學參數(shù)K1、K2、KT和Vmax的影響。

綜上所述,NE抑制iDR-EPSP可能與改變突觸后受體動力學過程并主要降低谷氨酸受體的親和力有關,但仍需進一步驗證;另外,NE的作用可能是突觸前和突觸后多種受體的綜合效應,NE是否還存在其他更為復雜的機制,有待進一步的探索。