徐愛民 郭國棟 何曉軍

摘 要：本文針對食品中金黃葡萄球菌的檢測方法進行探究。采用文獻總結(jié)法，從金黃色葡萄球菌的特點、危害、耐藥性入手，詳細介紹了傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學方法、分子生物學、快速檢測法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用，為實際檢測工作開展提供參考，保證食品質(zhì)量與安全。

關(guān)鍵詞：食品；金黃葡萄球菌；檢測技術(shù)；質(zhì)量安全

Study on Detection Method of Staphylococcus aureus in Food

XU Aimin， GUO Guodong， HE Xiaojun

（Heze Food and Drug Inspection and Testing Institute， Heze 274000， China）

Abstract： In this paper， the detection method of Staphylococcus aureus in food was explored. By the method of literature review， starting from the characteristics， harm and drug resistance of Staphylococcus aureus， the application of traditional culture method， immunological method， molecular biology and rapid detection method in the detection of Staphylococcus aureus in food was introduced in detail， to provide reference for the actual inspection work to ensure food quality and safety.

Keywords： food; Staphylococcus aureus; detection technology; quality and safety

金黃葡萄球菌是革蘭陽性菌，廣泛存在于空氣、水體、人與動物的排泄物中，很容易污染肉、蛋、奶等食物。其引起的食物中毒現(xiàn)象，是一個世界性的衛(wèi)生問題[1]。近年來，隨著人們生活節(jié)奏的加快，快餐成為一種常見的用餐方式，與此同時人們更加關(guān)注食品安全問題。根據(jù)不同的食品種類，選擇合適的檢測技術(shù)方法，既能保證檢測結(jié)果的準確性，又能提高效率、有效控制成本，是從業(yè)人員的重要研究課題。本文結(jié)合筆者實踐經(jīng)驗和現(xiàn)有研究成果，對食品中金黃葡萄球菌的檢測方法進行綜述。

1 金黃葡萄球菌概述

1.1 金黃葡萄球菌的特點

金黃葡萄球菌多為球狀或橢圓狀，一般聚集排列成葡萄串，可產(chǎn)生黃色的脂溶性色素。它對熱、鹽、干燥均有較強的抵抗能力，在80 ℃下可存活30 min，在10%的氯化鈉溶液中可長期存活并繁殖，在干燥的膿液、痰液中可存活2～3個月。金黃葡萄球菌一般分為A、B、C、D、E這5個類型，以A型腸毒素引起的中毒最為多見[2]。

1.2 金黃葡萄球菌的危害

正常情況下，機體可在一定程度上抵抗金黃葡萄球菌感染；但當皮膚黏膜受損、機體免疫力降低時，病原侵入機體就會產(chǎn)生危害。一類是侵襲性疾病，以組織感染為特征，常見如皮膚感染、傷口化膿、內(nèi)臟器官感染、敗血癥等。另一類是毒素性疾病，以食物中毒、毒素休克綜合征為特征，常見如急性胃腸炎、高熱、腹瀉、皮疹等。對此，《食品安全國家標準 食品中致病菌限量》（GB 29921—2013）中，明確規(guī)定了金黃葡萄球菌在8大類食品中的檢測限量。

1.3 金黃葡萄球菌的耐藥性

隨著細菌感染引起的疾病越來越多，臨床上對于抗生素的使用不合理，導致耐藥性的產(chǎn)生。相關(guān)研究證實，金黃葡萄球菌對多種抗生素具有耐藥性，較為常見且嚴重的是耐甲氧西林金黃葡萄球菌、耐萬古霉素金黃葡萄球菌[3]。

2 傳統(tǒng)培養(yǎng)法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用

《食品安全國家標準 食品微生物學檢 金黃色葡萄球菌檢驗》（GB 4789.10—2016）中規(guī)定傳統(tǒng)培養(yǎng)法是金黃葡萄球菌檢測的國家強制標準，可實現(xiàn)定性與定量檢測。該方法雖然成本低廉，但檢驗操作復雜，整個檢驗周期長，需要5 d左右才能得到檢驗結(jié)果。區(qū)楚君等[4]以冷凍肉及肉制品為對象，針對傳統(tǒng)培養(yǎng)法受雜菌干擾導致假陰性較高的問題，對分離方法進行改進，結(jié)果發(fā)現(xiàn)金黃色葡萄球菌的分離率從2.61%提高至19.98%，有效避免了假陰性現(xiàn)象的發(fā)生。

3 免疫學方法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用

3.1 乳膠凝集試驗

乳膠凝集試驗是使用有抗體的彩色乳膠顆粒，對金黃葡萄球菌細胞懸液進行檢測，若懸液中有特異性抗原，就會發(fā)生凝集或沉淀。該試驗方法的優(yōu)點是操作簡單、反應(yīng)快速，缺點是靈敏度不高，需在檢測前進行增菌處理。以法國生物梅里埃公司為例，對樣品進行24 h增菌處理，只需20 s就能得到陽性或陰性結(jié)果。

3.2 酶聯(lián)免疫吸附法

酶聯(lián)免疫吸附法在食品檢測領(lǐng)域的適用范圍廣、技術(shù)成熟。其原理是利用固相載體上的抗體，捕捉樣本中的抗原，加入酶標抗體后，形成抗體-抗原-抗體復合物；最后加入顯色底物反應(yīng)后，用肉眼觀察并使用酶標儀判定。該方法的靈敏度不高，需在檢測前進行增菌處理。時玉菲等[5]針對金黃色葡萄球菌A型腸毒素，使用單克隆抗體作為捕獲抗體，抗SEA兔多抗血清作為檢測抗體，建立雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法，檢測下限為1.89 μg·L-1，回收率為94%～114%，變異系數(shù)小于10%。

3.3 免疫層析檢測

免疫層析檢測利用毛細原理，在硝酸纖維素膜上固定抗體，干燥的硝酸纖維素一端浸入樣品溶液中，樣品沿著毛細管移動，移動至固定有抗體的區(qū)域時，樣品中的抗原與抗體發(fā)生特異性結(jié)合，根據(jù)顏色變化達到特異性檢測目標。該方法的檢測速度快，結(jié)果準確性較高。布日額等[6]建立牛乳中金黃色葡萄球菌的膠體金免疫層析檢測方法，結(jié)果顯示最低檢出限為1.0×105 CFU·mL-1，分離鑒定符合率在83.3%～90.0%，具有操作簡單、快捷、穩(wěn)定等優(yōu)點。

4 分子生物學在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用

4.1 PCR技術(shù)

PCR即聚合酶鏈式反應(yīng)，具有快速、靈敏度高、特異性好的優(yōu)點。由于食品成分較為復雜，加工過程中可能破壞DNA，限制了該技術(shù)的應(yīng)用。對此，通過技術(shù)創(chuàng)新可彌補這一缺陷，如實時熒光定量PCR、微滴式數(shù)字PCR、多重PCR等。滕要輝等[7]以速凍食品為對象，針對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌建立了多重PCR檢測方法，結(jié)果特異性為100%，可檢出菌落數(shù)低于100 CFU·g-1的菌群。

4.2 LAMP技術(shù)

LAMP即DNA環(huán)介導等溫擴增技術(shù)，適用于基因診斷，顯著特點是反應(yīng)時間短、靈敏度高。郭建平等[8]采用LAMP技術(shù)，基于顏色判定對金黃色葡萄球菌進行檢測，結(jié)果表明基因組靈敏度達到0.01 fg·μL-1，菌落靈敏度達到1.9 CFU·mL-1，不僅可靠性和特異性良好，而且不需要特殊設(shè)備。

4.3 RPA技術(shù)

RPA即重組酶聚合酶恒溫擴增技術(shù)，它主要依賴于3種酶：①能與單鏈核酸結(jié)合的重組酶；②鏈置換DNA聚合酶；③單鏈DNA結(jié)合蛋白，最佳反應(yīng)溫度是37 ℃。該檢測技術(shù)的優(yōu)點包括：①常溫下檢測，不需要熱循環(huán)，對儀器設(shè)備要求低；②僅需少量核酸分子，在3～10 min即可完成檢測任務(wù)，且一個人就能完成操作過程；③能在同一個管中，同時進行多個擴增反應(yīng)；④靈敏度高，可滿足定量檢測要求。在市場應(yīng)用方面，英國TwistDX公司研發(fā)的TwistAmp產(chǎn)品，可在常溫下完成檢測，用時在15 min以內(nèi)，尤其適用于食品安全、生物安全、體外診斷、獸醫(yī)以及農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域[9]。

4.4 SAT技術(shù)

SAT即實時熒光核酸恒溫擴增技術(shù)，它的標靶和擴增產(chǎn)物均是RNA，整個反應(yīng)時間較短，熒光信號經(jīng)熒光檢測儀器實時捕獲，可實時反映擴增循環(huán)情況。李桂金等[10]采用SAT法檢測食品中的金黃色葡萄球菌，并對檢測能力進行評價，結(jié)果顯示純培養(yǎng)物檢出限為103 CFU·mL-1，靈敏度為100%，假陰性率為0%，假陽性率為2.9%，各項結(jié)果均達標。

4.5 核酸探針技術(shù)

核酸探針技術(shù)利用核苷酸堿基順序互補的原理，對DNA或RNA片段進行標記，檢測樣本中某個特定微生物的核苷酸順序。不同微生物的基因序列不同，因此該檢測技術(shù)具有先進性。然而，食品中金黃葡萄球菌的含量少，一般不直接采用核酸探針檢查，目前只有少數(shù)公司在研究推廣該技術(shù)。例如，美國GEN-Probe公司研制的AccuProbe試劑，可在72 h內(nèi)對食品中的金黃葡萄球菌進行檢測。

5 快速檢測法在食品中金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用

傳統(tǒng)培養(yǎng)法是金黃葡萄球菌檢測的國家強制標準，可實現(xiàn)定性與定量檢測。但是，食品檢測具有工作量大、范圍廣的特點，傳統(tǒng)培養(yǎng)法在操作方法和檢測周期上不具有優(yōu)勢，不能滿足實際檢測需求。對此，相關(guān)企業(yè)和從業(yè)人員對傳統(tǒng)培養(yǎng)法進行優(yōu)化改良，形成快速檢測技術(shù)，以顯色培養(yǎng)基法、鑒別培養(yǎng)基法、紙片法為代表，具有操作簡單、成本低廉、快速準確的優(yōu)點。

5.1 顯色培養(yǎng)基法

顯色培養(yǎng)基法是利用微生物自身代謝產(chǎn)生的酶，加入顯色底物后反應(yīng)顯色實現(xiàn)檢測效果，在特異性酶的作用下，通過觀察菌落的顏色對菌種進行鑒定，其特異性和靈敏度均高于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。周霞霞等[11]對金黃色葡萄球菌標準菌株、食品樣本分離菌株采用顯色培養(yǎng)基進行檢驗，并與國標法、微生物鑒定藥敏分析系統(tǒng)的檢驗結(jié)果進行比較，結(jié)果顯示顯色培養(yǎng)基能快速鎖定疑似目標菌落，定量檢測與其他方法在計數(shù)值上無顯著性差異。

5.2 鑒別培養(yǎng)基法

鑒別培養(yǎng)基法是在培養(yǎng)基中加入試劑或化學藥品，不同微生物對這些成分的分解能力不同，指示劑對不同菌落顯示不同顏色，達到鑒別與區(qū)分的效果。法國生物梅里埃公司研制的Baird Parket+RPF培養(yǎng)基，加入兔血漿，在37 ℃下培養(yǎng)24 h，得到不透明的菌落即是金黃色葡萄球菌。仇華磊等[12]以導致奶牛發(fā)生乳腺炎的金黃色葡萄球菌為對象，在Baird-parker培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上選擇mBP培養(yǎng)液，根據(jù)培養(yǎng)液是否渾濁、產(chǎn)生黑色物質(zhì)，判斷奶樣中金黃色葡萄球菌對所試抗生素的敏感性。該方法簡單、快速，不需使用專門的設(shè)備，具有較高推廣價值。

5.3 紙片法

美國3M公司生產(chǎn)的第2代金黃色葡萄球菌快速檢測紙片，檢測過程包括兩個階段：第一階段使用改良后的B-P培養(yǎng)基，含有金黃色葡萄球菌的樣本培養(yǎng)24 h后，在紙片上呈現(xiàn)為暗紫色；第二階段若呈現(xiàn)為其他顏色，就使用含有顯色劑和DNA的確認反應(yīng)片，1～3 h后金黃色葡萄球菌形成粉紅色環(huán)，其他菌落不會形成，作為鑒別判斷依據(jù)。孫鑫澤等[13]的研究中，以乳制品、熟肉制品和方便食品為對象，對比紙片法和B-P平板法對金黃色葡萄球菌的檢出率和用時，結(jié)果顯示兩種方法的檢出率無明顯差異，但紙片法檢測用時明顯縮短。

此外還有其他檢測技術(shù)，如生物素標記法、魯米諾信號化學發(fā)光法、BAX Q7全自動病原菌檢測系統(tǒng)等[14]。

6 結(jié)語

綜上所述，食品衛(wèi)生安全直接關(guān)系到人體健康，金黃葡萄球菌檢測一直是食品檢測的一個重要項目。文章以傳統(tǒng)培養(yǎng)法、免疫學方法、分子生物學、快速檢測法為例，闡述了其在金黃葡萄球菌檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀。未來，快速檢測技術(shù)因操作簡單、成本低廉、方便快捷的優(yōu)點，具有良好的市場發(fā)展前景，將會成為一個重點發(fā)展方向。

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