吳鵬杰,張 偉,劉圣杰,朱 剛,馬 宏,孟令峰,張 政,張耀光,魏 東,楊 澤,萬 奔,王建業(yè)

[北京醫(yī)院(國家老年醫(yī)學(xué)中心/中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院老年醫(yī)學(xué)研究院):1.泌尿外科;2.病理科;3.國家衛(wèi)生健康委北京老年醫(yī)學(xué)研究所,北京 100730]

近年來我國前列腺癌的發(fā)病率快速上升,據(jù)報道北京、上海、廣州前列腺癌發(fā)病率超過膀胱癌,成為最常見的泌尿外科腫瘤[1]。大多數(shù)前列腺腫瘤生長緩慢,少部分患者發(fā)生進(jìn)展,因此尋找預(yù)測腫瘤預(yù)后的分子標(biāo)記成為臨床研究的焦點。有研究顯示P53基因突變參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展,可是P53在前列腺癌中的表達(dá)與細(xì)胞增殖、腫瘤分期、細(xì)胞分級關(guān)系尚不完全清楚[2-3]。本文通過免疫組化的方法分析P53、Ki-67蛋白表達(dá)的臨床意義,為治療前列腺癌提供分子學(xué)參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料收集衛(wèi)生部北京醫(yī)院泌尿外科行根治性前列腺癌切除術(shù)90例患者資料,所有患者術(shù)前均無淋巴和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的證據(jù),術(shù)前均未行輔助內(nèi)分泌治療或放療?；颊吣挲g52～79歲,平均(69.4±10.1)歲。90例患者中血PSA水平<10 ng/mL者54例、>10 ng/mL者36例;Gleason評分≥8分者21例、7分者39例、≤6分者30例;根據(jù)2002年美國癌癥聯(lián)合委員會(American Joint Committee on Cancer,AJCC) 的腫瘤TNM 臨床分期標(biāo)準(zhǔn)分類:pT2N0M0者66例,pT3～T4N0M0者24例。病理伴有神經(jīng)血管癌栓浸潤者21例。

1.2 免疫組化

1.2.1染色方法 即用型P53、Ki-67抗體購于北京中杉金橋生物技術(shù)公司。采用兩步法做免疫組化研究。所有標(biāo)本用10 g/L甲醛固定12～18 h,石蠟包埋存檔,4 μm石蠟切片,前列腺癌標(biāo)本于腫瘤處取材,常規(guī)脫蠟,逐步入水,用質(zhì)量濃度為3%的過氧化氫孵育,0.01 mmol/L PBS (pH=7.4) 沖洗3次,每次3 min,熱抗原修復(fù),質(zhì)量濃度為3%的過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶的活性,加入一抗,以PBS替代一抗作為陰性對照,用已知的乳腺癌和PBS液作為陽性和陰性對照,室溫1 h,甩去PBS,每張切片加1滴二抗,室溫下孵育40 min,PBS沖洗3次,每次3 min,中性樹脂封片。

1.2.2結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn) 在相同高倍視野下,每張切片均隨機選取10個視野,計數(shù)500個細(xì)胞,并計算出每張切片中陽性細(xì)胞占計數(shù)細(xì)胞的構(gòu)成比。P53陰性表達(dá)(-):腫瘤細(xì)胞核內(nèi)無淡黃色及棕黃色顆粒,或陽性顆粒<10%;P53陽性表達(dá)(+):腫瘤細(xì)胞核內(nèi)淡黃或棕黃色顆粒>10%。Ki-67表達(dá)≥3%為陽性,<3%為陰性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 13.0軟件統(tǒng)計數(shù)據(jù),采用χ2檢驗分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 前列腺癌組織P53表達(dá)及與患者臨床病理特征的關(guān)系前列腺癌組織中P53蛋白在細(xì)胞核中表達(dá),表達(dá)陽性率為27.8%(25/90)。不同的年齡、術(shù)前血PSA的表達(dá)水平、Gleason評分及神經(jīng)血管瘤栓是否浸潤之間,P53表達(dá)陽性率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05,表1);而不同的病理分期及Ki-67 表達(dá)水平之間,P53表達(dá)陽性率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05,表1):即P53表達(dá)陽性率在pT3～T4者中高于pT2,在Ki-67≥3%者中表達(dá)高于<3%者。

表1 前列腺癌組織中P53和Ki-67表達(dá)與患者臨床指標(biāo)的的關(guān)系 [例(%)]

2.2 前列腺癌組織Ki-67表達(dá)及與患者臨床病理特征的關(guān)系以Ki-67染色率為3.0%作為增殖活躍分界值時,Ki-67表達(dá)陽性率為46.7%(42/90)。

不同的年齡、術(shù)前血PSA的表達(dá)水平及神經(jīng)血管瘤栓是否浸潤之間,Ki-67表達(dá)陽性率的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05,表1);而不同的Gleason評分及病理分期之間,Ki-67表達(dá)陽性率的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.01,表1):即Ki-67表達(dá)陽性率隨著Gleason評分的增高而增高,在pT3～T4者中的表達(dá)高于pT2。Ki-67表達(dá)陽性組的腫瘤較表達(dá)陰性組增殖活躍(P=0.012)。

3 討 論

P53基因是重要的抑癌基因,翻譯生成53 ku的核蛋白,這種蛋白可監(jiān)控細(xì)胞基因組的完整性,參與DNA的損傷修復(fù)過程。一旦P53基因突變,帶有損傷的DNA片段可進(jìn)入細(xì)胞增殖周期,引起細(xì)胞基因組不穩(wěn)定,從而促進(jìn)腫瘤發(fā)生。目前,有研究顯示P53基因突變參與前列腺癌的發(fā)生進(jìn)展,恢復(fù)P53活性有潛在治療價值[4]?？墒荘53蛋白與前列腺癌Gleason評分、病理分期、臨床預(yù)后之間的關(guān)系尚未完全統(tǒng)一認(rèn)識。

野生型P53半衰期很短 (5～45 min),應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)免疫組化方法檢測不到,一般認(rèn)為免疫組化檢測P53蛋白是突變型P53[5]。多數(shù)學(xué)者認(rèn)為突變型P53蛋白過表達(dá)是前列腺癌預(yù)后不佳的指標(biāo)[6]。有研究發(fā)現(xiàn)前列腺癌P53表達(dá)與Gleason評分相關(guān)[6]。本研究發(fā)現(xiàn):早期前列腺癌P53蛋白率陽性為19.7%,晚期P53蛋白表達(dá)率為50.0%。前列腺癌根治術(shù)標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)前列腺癌P53表達(dá)與腫瘤分期、Gleason評分、早期生化復(fù)發(fā)相關(guān)。KLUTH等[7]研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白核累積與前列腺癌手術(shù)治療后不良病理類型和PSA生化復(fù)發(fā)相關(guān)(P<0.001)。我國學(xué)者姜濤等[8]在45例前列腺癌標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)P53表達(dá)與前列腺癌Gleason評分、細(xì)胞分期存在統(tǒng)計學(xué)差異,而且P53表達(dá)與腫瘤生存負(fù)相關(guān)。一項隨訪30年的前瞻性隊列研究中,發(fā)現(xiàn)明確P53表達(dá)可鑒別出高危前列腺癌患者[9]。本研究發(fā)現(xiàn)P53蛋白表達(dá)與腫瘤分期有顯著相關(guān)性(P<0.05);可是與腫瘤Gleason評分無統(tǒng)計學(xué)相關(guān)性:Gleason評分≥8分組前列腺癌P53表達(dá)陽性率為38.1%(8/21),Gleason評分≤7分組P53表達(dá)陽性率為24.6%(17/69)。

Ki-67與增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)一樣,是細(xì)胞核內(nèi)與細(xì)胞分裂及增殖相關(guān)的核蛋白,其表達(dá)與細(xì)胞增殖狀態(tài)高度相關(guān),反映腫瘤細(xì)胞增殖活性,可用于判定腫瘤惡性程度。本研究發(fā)現(xiàn)Ki-67表達(dá)與前列腺癌細(xì)胞分期分級顯著相關(guān)。WAHID等[10]研究發(fā)現(xiàn)PCNA在前列腺癌細(xì)胞表達(dá)水平較低,與P53表達(dá)正相關(guān)。與正常前列腺組織相比,Ki-67蛋白在前列腺癌組織中表達(dá)明顯,且Ki-67表達(dá)與前列腺癌Gleason評分正相關(guān)[11]。本研究發(fā)現(xiàn)P53表達(dá)陽性組腫瘤較表達(dá)陰性組Ki-67表達(dá)水平高(P<0.05)。Ki-67不僅與Gleason評分和P53蛋白表達(dá)有一定相關(guān)性,而且是局限性前列腺癌患者根治術(shù)后不良病理結(jié)果和生化復(fù)發(fā)的獨立預(yù)測因素[12]。另外,通常認(rèn)為血管神經(jīng)瘤栓浸潤是腫瘤預(yù)后不佳的預(yù)后因素。本研究中并沒有發(fā)現(xiàn)P53表達(dá)在神經(jīng)血管瘤栓是否浸潤組間存在統(tǒng)計學(xué)差異。

綜上所述,前列腺癌P53蛋白表達(dá)與腫瘤分期、細(xì)胞增殖關(guān)系密切,而Ki-67表達(dá)與前列腺癌分期分級相關(guān),這些結(jié)果提示P53蛋白和Ki-67與前列腺癌的臨床進(jìn)展關(guān)系密切。