王丙萍 段金凱 張雙 高艷偉 任猛 陳良全 高維實

結直腸癌是十分常見的消化道惡性腫瘤之一。近年在全球范圍內,結直腸癌的發(fā)病率及死亡率有逐漸升高的趨勢,且50歲以下年輕人群發(fā)病率上升[1-2]。對于晚期患者,通常治療后疾病有進展且預后較差。因此,探索安全、有效的結直腸癌治療手段及策略是十分迫切的。

腫瘤免疫治療在近年來發(fā)展迅猛,是目前癌癥治療中最受矚目的治療手段。關于PD-1/PD-L1抑制劑的應用在腎細胞癌、黑色素瘤、膀胱癌、肺癌、食管癌、霍奇金淋巴瘤和結直腸癌的治療中取得了十分重大的突破,被FDA批準可以應用于臨床治療[3-7]。然而免疫檢查點抑制劑在結直腸癌治療方面的應用還處于不斷探索的階段。NK細胞過繼性回輸在多種癌癥的治療中取得了令人滿意的效果[8]。免疫檢查點抑制劑與NK細胞聯(lián)合應用,在治療白血病和非小細胞肺癌患者時是安全、有效且具有生存獲益[9-10]。并且許多研究表明,NK細胞在PD-1信號通路阻斷療法中發(fā)揮著十分重要的作用。

本研究通過檢測NK細胞及PD-1單抗+NK細胞殺傷五種結直腸癌細胞系的效率及最佳效靶比,探討PD-1抑制劑聯(lián)合NK細胞回輸治療結直腸癌的可行性,為探索結直腸癌治療策略提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

結直腸癌細胞株LOVO、Caco-2、HT-29、HT-115和HRT-18購自中國科學院上海細胞所;Lonza X-VIVO15培養(yǎng)基、DMEM高糖培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、F-12K培養(yǎng)基、McCoy′s5A培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、磷酸鹽緩沖液(PBS)購自美國Gibco公司;誘導劑IL-2、IL-7、IL-15、IL-18、IL-21、OKT3購自美國R&D公司;抗人CD16單克隆抗體購自中國北京同立海源生物科技有限公司;PD-1單克隆抗體(Nivolumab)購自中國大連美侖;Ficoll淋巴細胞分離液購自中國TBDTM公司;熒光標記單克隆抗體:CD3-FITC、CD56-PE、鼠抗人IgG-FITC購自美國BD公司;CCK-8試劑盒購自中國博士德生物公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 結直腸癌細胞株的培養(yǎng) LOVO、Caco-2、HT-29結直腸癌細胞株的培養(yǎng)液分別為F-12K、RPMI-1640、McCoy′5A培養(yǎng)基,HT-115和HRT-18結直腸癌細胞株的培養(yǎng)液均為DMEM高糖培養(yǎng)基,FBS濃度均為10%。細胞培養(yǎng)至貼壁90%左右傳代培養(yǎng),0.25%胰蛋白酶在37℃時消化的時間分別是LOVO、HT-29、HT-115為2 min,Caco-2為1.5 min、HRT-18為3 min。

1.2.2 外周血單個核細胞(PBMCs)分離 Ficoll密度梯度離心法分離PBMCs,收集血漿,置于56℃水浴鍋內保持30 min,之后置于4℃冰箱內10 min進行冷卻,離心后收集上清保存于4℃?zhèn)溆?收集白膜層,加入PBS清洗,離心棄上清液,用VIVOTM15培養(yǎng)基重懸PBMCs細胞,顯微計數(shù),取樣進行流式檢測。

1.2.3 NK細胞的誘導擴增 接種日期為第0天,調整PBMCs細胞密度為1.5 M/mL,加入自體血清10%,IL-2 1 000 IU/mL,IL-7 10 ng/mL,IL-15 50 ng/mL,IL-18 10 ng/mL,IL-21 50 ng/mL,OKT3 10 ng/mL,Anti-CD16 10 ng/mL,90% VIVOTM15培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,細胞接種密度≤1.5 M/mL,放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第3～14天補液:每次補液調整細胞密度為0.5～1.0 M/mL,自體血漿10%,加入IL-2 1 000 IU/mL。第14天收獲:流式細胞儀檢測結果,合格后收獲細胞。

1.2.4 流式細胞檢測 免疫熒光標記法進行流式細胞分析,取NK細胞PBS洗滌后懸浮細胞,加入CD3-FITC和CD56-PE,4℃避光孵育30 min。PBS洗滌后流式細胞儀分析檢測,用異硫氰酸(FITC)標記IgG作為陰性對照,根據(jù)流式細胞分析圖中CD3-CD56+的百分比,確定NK細胞所占比例。

1.2.5 CCK-8法檢測殺傷效率 分別以NK細胞、NK+PD-1單抗為效應細胞,靶細胞分別為五種結直腸癌細胞系。靶細胞接種培養(yǎng)12 h后,加入效應細胞。NK+PD-1單抗為效應細胞的處理方式是106個NK細胞加入6 μg PD-1單抗在培養(yǎng)箱中培育2 h。兩組均按效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1、5∶1、10∶1、15∶1、20∶1的比例分別加入效應細胞為實驗組,同時設置單獨靶細胞孔和每種比例的單獨效應細胞孔,3個復孔。共同培養(yǎng)24 h后,加入CCK-8試劑孵育3.5 h后用酶標儀測定450 nm波長的OD值,以此方法檢測NK細胞的細胞毒活性,公式如下:

殺傷率(%)=[1-(實驗組OD值-單獨效應細胞OD值)/單獨靶細胞組OD值]×100%。

1.2.6 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,組內比較采用兩因素方差分析,組間比較采用方差分析結合事后檢驗Bonfferoni法進行兩兩比較,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NK細胞的培養(yǎng)結果

健康人外周血分離PBMCs后,經(jīng)細胞因子誘導擴增NK細胞。第0天為散落的顆粒狀細胞(圖1A),3～4天后聚集成團,出現(xiàn)細胞集落(圖1B),培養(yǎng)10～14天后,細胞重新分散為單個細胞(圖1C)。經(jīng)流式細胞儀鑒定CD3-CD56+細胞(圖1D-I),外周血中占比較少的NK細胞(10.97%±3.28%),擴增到占比(83.20%±8.54%),細胞總數(shù)擴增倍數(shù)為(251.66±19.05)倍,NK細胞擴增倍數(shù)為(1 940.17±402.22)倍。

圖1 NK細胞的培養(yǎng)結果

2.2 效應細胞對結直腸癌細胞系Caco-2的殺傷效果

NK細胞效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1和2∶1組對靶細胞Caco-2殺傷效率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);PD-1單抗+NK細胞效靶比0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1組對靶細胞Caco-2殺傷效率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);效靶比2:1時NK細胞組與PD-1單抗+NK細胞組對靶細胞Caco-2的殺傷效率存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表1,圖2A)。

表1 NK細胞及PD-1單抗+NK細胞對靶細胞Caco-2的殺傷效率(%)

圖2 NK細胞、PD-1單抗+NK細胞對靶細胞LOVO、Caco-2、HT-29、HT-115、HRT-18在不同效靶比時的殺傷效率(%)

2.3 效應細胞對結直腸癌細胞系LOVO的殺傷效果

NK細胞對靶細胞LOVO在效靶比為1∶1、2∶1、5∶1、10∶1和15∶1時殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);PD-1單抗+NK細胞對靶細胞LOVO在效靶比為2∶1、5∶1、10∶1和15∶1時殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);NK細胞組與PD-1單抗+NK細胞組對靶細胞LOVO的殺傷效率,在各個效靶比中差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表2,圖2A),此結果表明PD-1單抗的加入并不能提高NK細胞對結直腸癌細胞系LOVO的殺傷效率。

表2 NK細胞及PD-1單抗+NK細胞對靶細胞LOVO的殺傷效率(%)

2.4 效應細胞對結直腸癌細胞系HT-29的殺傷效果

NK細胞對靶細胞HT-29在效靶比為5∶1、10∶1、15∶1和20∶1時殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);PD-1單抗+NK細胞對靶細胞HT-29在效靶比為5∶1、10∶1、15∶1和20∶1時殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);效靶比5∶1和10∶1時NK細胞組與PD-1單抗+NK細胞組對靶細胞HT-29的殺傷效率,存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)(表3,圖2A)。

表3 NK細胞及PD-1單抗+NK細胞對靶細胞HT-29的殺傷效率(%)

2.5 效應細胞對結直腸癌細胞系HT-115的殺傷效果

從結果可以看出(表4,圖2A),效應細胞和效靶比的交互作用對因變量殺傷效率的影響存在統(tǒng)計學差異(F=4.366,P=0.002),即效應細胞不同對殺傷效率的影響在不同效靶比之間存在差異。NK細胞對靶細胞HT-115在效靶比為2∶1、5∶1和10∶1時殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);PD-1單抗+NK細胞對靶細胞HT-115在效靶比為2∶1、5∶1和10∶1時殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);在效靶比為0.1∶1、0.5∶1時NK細胞組與PD-1單抗+NK細胞組對靶細胞HT-115的殺傷效率,存在統(tǒng)計學差異(P<0.05)。

表4 NK細胞及PD-1單抗+NK細胞對靶細胞HT-115的殺傷效率(%)

2.6 效應細胞對結直腸癌細胞系HRT-18的殺傷效果

NK細胞對靶細胞HRT-18在效靶比為0.1∶1、0.5∶1、1∶1、2∶1和5∶1時殺傷率顯著高于其它效靶比組(P<0.05);PD-1單抗+NK細胞對靶細胞HRT-18在其它效靶比時顯著高于15∶1和20∶1的實驗組(P<0.05);NK細胞組與PD-1單抗+NK細胞組對靶細胞HRT-18的殺傷效率,在各個效靶比中差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(表5,圖2A),此結果表明PD-1單抗的加入并不能提高NK細胞對結直腸癌細胞系HRT-18的殺傷效率。

表5 NK細胞及PD-1單抗+NK細胞對靶細胞HRT-18的殺傷效率(%)

2.7 NK細胞對結直腸癌細胞系殺傷效果的比較

由于PD-1單抗并不能增加NK細胞對結直腸癌細胞系的殺傷效果,因此只比較了NK細胞對不同結直腸癌細胞系最高殺傷效率的差異性以及效靶比之間的差異性。從結果可以看出(圖2B),NK細胞對LOVO、HT-29的殺傷效率與Caco-2、HT-115的殺傷效率相比差異顯著(P<0.05),與HRT-18的殺傷效率相比差異極顯著(P<0.01)。不同細胞系最高殺傷效率的效靶比結果顯示,LOVO以及HT-29均為10∶1,Caco-2為0.1∶1,HT-115為2∶1,HRT-18為1∶1。每種殺傷效率最高的效靶比都有與其無統(tǒng)計學意義的效靶比組,通過統(tǒng)計結果表明,五種靶細胞均在效靶比為2∶1時有一個好的殺傷結果,而后隨著效靶比的增高有三種靶細胞(Caco-2、TH-115、HRT-18)的殺傷效率降低明顯。

3 討論

免疫檢查點是指在免疫細胞上表達的一系列分子,它能調節(jié)免疫細胞的激活,是人體維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要調控機制。PD-1發(fā)揮作用是在免疫應答的后期,通過影響干擾素γ(IFN-γ)、腫瘤壞死因α(TNF-α)以及白細胞介素2(IL-2)等細胞因子的分泌進而影響T細胞的增值。目前,在我國已經(jīng)上市的PD-1抑制劑帕博利珠單抗適用于各種類型的高突變負荷的錯配修復缺失MSI型腫瘤,但對微衛(wèi)星穩(wěn)定MSS型結直腸癌患者不起作用[11]。然而對于結直腸癌患者,MSS型占絕大多數(shù),如何提高PD-1抑制劑對這部分患者的治療效果十分具有探討研究價值。

NK細胞參與天然免疫和適應性免疫,是先天免疫系統(tǒng)中最具殺傷性的細胞毒性淋巴細胞,能夠介導強大的抗病毒和抗腫瘤作用[12]。同時還具有強大的間接增強T細胞免疫應答的作用,是T細胞發(fā)揮抗腫瘤功能的基礎[13]。有研究表明,NK細胞受損和細胞數(shù)量的減少,與各類腫瘤的進展都具有相關性[14-15]。本研究通過細胞因子誘導擴增PBMCs的方法體外擴增培養(yǎng)NK細胞,將外周血中數(shù)量占比較少(10.97%±3.28%)的NK細胞擴增至占比(83.20%±8.54%),細胞總數(shù)擴增倍數(shù)為(251.66±19.05)倍,NK細胞擴增倍數(shù)為(1 940.17±402.22)倍。本研究結果說明,通過細胞因子誘導培養(yǎng)的方法可以大量擴增純度較高的NK細胞,為NK細胞的臨床應用奠定基礎。

過繼性免疫治療是腫瘤免疫療法的一種,其原理是將人體內的抗腫瘤免疫細胞采集后,經(jīng)過體外培養(yǎng)擴增后回輸患者,以增強人體免疫系統(tǒng),從而達到抗腫瘤的目的。本研究結果顯示,當達到最佳殺傷效率的效靶比后,隨著效靶比的增加,NK細胞對結直腸癌細胞系的殺傷效率反而降低,此結果提示應用NK細胞過繼回輸治療結直腸癌時,并不是NK細胞越多越好,將效靶比控制在2∶1時可能是一個安全且治療效果最好的比例。

許多研究結果都說明NK細胞在PD-1信號通路阻斷療法中發(fā)揮著十分重要的作用。本研究結果表明,PD-1單抗與NK細胞聯(lián)合應用對Caco-2(效靶比2∶1)、HT-29(效靶比5∶1和10∶1)以及HT-115(效靶比0.1∶1和0.5∶1)細胞系的殺傷效率與單獨NK細胞相比差異顯著(P<0.05),其余各組間差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。提示PD-1單抗可以聯(lián)合NK細胞過繼性回輸治療結直腸癌且有一定的治療意義。

LOVO細胞系是人源高轉移的晚期結腸癌細胞系(來源于左鎖骨上區(qū)轉移灶,TNM Ⅳ期),HT-115細胞系來源于人的肺轉移病灶,兩種細胞系均屬于惡性程度較高的未分化細胞系,具有較強的侵襲和遷移能力。HT-29細胞系來源于中等程度分化的腺癌(人結腸原發(fā)灶,TNMⅠ期),惡性程度較低,侵襲和遷移能力較弱。HRT-18細胞系又名HCT-8,是人源的回盲部結直腸腺癌(結腸癌原發(fā)灶);Caco-2細胞系來源于人結腸腺癌,常被用于體外腸上皮屏障模型;這兩種細胞系均屬于高分化的結直腸癌細胞系。從結果可以看出,NK細胞對未分化細胞系LOVO以及中分化細胞系HT-29的殺傷效率最高,在效靶比為10∶1時,幾乎可以達到100%的殺傷效果;對于未分化細胞系HT-115以及高分化細胞系Caco-2的殺傷效率在較低效靶比時(分別是0.1∶1和2∶1)也能達到70%以上的殺傷效果;然而對于惡性程度很低的高分化細胞系HRT-18,NK細胞對其最高殺傷效率僅能達到38.78%±8.94%,這些結果表明NK細胞對結直腸癌的殺傷效率與其分化程度無關。除HRT-18細胞系外,NK細胞對其余四種細胞系的最高殺傷效率都達到了70%以上,提示NK細胞對大多數(shù)結直腸癌的殺傷效果較好,NK細胞過繼性回輸適用于結直腸癌的治療。本研究結果還提示了HRT-18結直腸癌細胞系的特殊性,因此需要后續(xù)進行深入研究探索其作用機制。

本研究通過CCK-8法檢測NK細胞及PD-1單抗+NK細胞殺傷五種結直腸癌細胞系LOVO、Caco-2、HT-29、HT-115、HRT-18的效率及最佳效靶比,通過統(tǒng)計比較兩種效應組對結直腸癌細胞系的殺傷效果。結果表明PD-1單抗與NK細胞聯(lián)合應用對結直腸癌有一定的治療意義,將效靶比控制在2∶1時可能是一個安全且治療效果最好的比例。本研究的結果為腫瘤免疫逃逸的研究提供了可作為目標的研究細胞以及研究方向,為應用NK細胞過繼性回輸治療結直腸癌的臨床應用奠定了基礎。目前,科學家認為腫瘤免疫治療是攻克人類腫瘤難題的一個極有希望的治療方法,對腫瘤免疫的深入研究將為攻克人類癌癥提供新的方向。