于子健 楊冰 謝國駟 史成銀

摘 要：卵黃抗體（IgY）是一種存在于卵黃中的免疫球蛋白，具有性質穩(wěn)定、安全高效、綠色環(huán)保、不產生耐藥性等特點，在水產養(yǎng)殖病害防治領域具有廣泛應用前景。文章介紹了卵黃抗體的分子結構、理化性質和作用機制以及卵黃抗體在水產動物疾病防治中的研究現(xiàn)狀和應用前景，以期為今后卵黃抗體在水產養(yǎng)殖的基礎研究和應用提供參考。

關鍵詞：卵黃抗體；水產養(yǎng)殖；病害防治

我國是漁業(yè)大國，也是水產養(yǎng)殖第一大國。2021年，全國水產品總產量6 690.29萬噸，養(yǎng)殖產品占比達到了80.63%，中國養(yǎng)殖水產品占世界水產品養(yǎng)殖總產量的60%以上［1］。但隨著水產養(yǎng)殖產業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖產量的增加以及養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，導致水體環(huán)境污染嚴重，水產動物病害頻發(fā)，病害發(fā)生的時間增長、規(guī)模增大，病害種類增加，使得水產養(yǎng)殖病害的防治工作難度加大。嚴重的病害問題不僅造成了巨大的經濟損失，制約著水產養(yǎng)殖產業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，而且嚴重威脅到水產品的質量以及人類的安全。因此，加強水產養(yǎng)殖病害防治的研究有著至關重要的意義?？股赜休^強的抑制生長和殺滅細菌的作用，被廣泛用于水產動物細菌性疾病的防治。但抗生素的濫用也會給水產養(yǎng)殖帶來一定程度的副作用及危害，不僅會產生耐藥菌株，破壞水體環(huán)境，藥物殘留問題更會直接危害到人體健康。2020年7月農業(yè)農村部頒布了“禁抗令”，在禁止抗生素使用后，尋找安全、綠色、高效的抗生素替代品成為水產養(yǎng)殖行業(yè)的研究熱點。卵黃抗體具有穩(wěn)定性好、特異性強和使用方便等優(yōu)勢，是預防和治療疾病的理想藥物，其作為一種抗生素藥物的替代品，具有廣闊的應用前景。

1 卵黃抗體研究進展

卵黃免疫球蛋白（immunoglobulin of yolk，IgY）又稱卵黃抗體，是指從免疫后的禽類卵黃中提取的針對特定抗原的抗體［2］。1893年，Klemperer［3］首次發(fā)現(xiàn)通過免疫產蛋母雞可以從其卵黃中獲得具有中和作用的特異性抗體；1969年，Leslie和Clem［4］將這種富集于卵黃中的免疫球蛋白命名為IgY。然而，在之后的很長一段時間里，卵黃抗體的發(fā)現(xiàn)并沒有引起學者們的重視。直到20世紀末期，動物福利問題逐漸受到重視，卵黃抗體才再次進入學者們的視野。目前，卵黃抗體在畜禽養(yǎng)殖、免疫檢測、疾病防治等領域已經得到了廣泛應用。近年來，隨著對IgY研究的不斷深入，卵黃抗體在水產動物細菌性疾病、病毒性疾病防治領域也有相關應用的報道。

1.1 卵黃抗體的分子結構

IgY呈Y型結構，由兩條輕鏈和兩條重鏈組成，分子量約為180 ku。輕鏈約為22～30 kDa，由1個可變區(qū)VL和1個恒定區(qū)CL構成；重鏈約為67～70 kDa，由1個可變區(qū)VH和4個恒定區(qū)Cυ1、Cυ2、Cυ3、Cυ4構成［5-6］。輕鏈（VL-CL）和重鏈（VH-Cυ1）之間通過二硫鍵連接，構成了IgY的抗原結合區(qū)（Fab區(qū)），其可變末端（VL和VH）共同構成了IgY的抗原識別和結合位點，決定了抗體的抗原特異性［7］。重鏈間存在3個重鏈間二硫鍵［8］，重鏈的Cυ2、Cυ3、Cυ4區(qū)為可結晶片段（Fc區(qū)），是IgY與細胞表面受體或補體系統(tǒng)蛋白相互作用的部位，在涉及去除病原體的補體系統(tǒng)中起主要作用，例如裂解入侵細胞、經典補體途徑的激活和吞噬外來病原等［9-10］。

1.2 卵黃抗體的理化性質

IgY性質穩(wěn)定，即使作為一種生物蛋白大分子，也具有較強的耐熱、耐酸以及抗酶降解能力。IgY在30～70 ℃的溫度范圍內也能保持穩(wěn)定，但在70 ℃或更高溫度下加熱15 min后活性會明顯下降［11-12］；干燥處理后的IgY制劑可以在4 ℃條件下儲存5～10年，在室溫條件下放置6個月其活性也不會明顯改變［13］。IgY在pH值4.0～11.0時比較穩(wěn)定，當pH值＜4.0或pH值＞12.0時活性會迅速下降［14］。研究顯示，pH值和酶與底物的比例不同，卵黃抗體對胃蛋白酶的耐受程度也會發(fā)生變化；卵黃抗體抗胰蛋白酶及胰凝乳蛋白酶的水解能力要強于胃蛋白酶，在胰蛋白酶或胰凝乳蛋白酶消化8 h后，仍能保留部分活性［15］。

1.3 卵黃抗體的作用機制

關于IgY防治疾病的具體機制尚未闡明，但是根據(jù)現(xiàn)有的研究結果來看，卵黃抗體在防治疾病過程中，主要通過以下幾種機理發(fā)揮作用［16］：一是卵黃抗體可以通過凝集作用使細菌凝集，破壞細菌表面結構，抑制細菌的生長和定植。靖凱霖等［17］通過透射電鏡、免疫熒光電鏡和掃描電鏡實驗表明，特異性IgY可以使燦爛弧菌凝集，改變其細胞結構，破壞細胞完整性致菌體死亡。二是卵黃抗體可以通過黏附作用，抑制細菌的生長，進而減少毒素的產生和釋放。靖凱霖等［17］的研究顯示，特異性IgY能夠有效阻止燦爛弧菌在固體培養(yǎng)基上黏附，抑制細菌的生長和繁殖。三是卵黃抗體可以增強巨噬細胞的吞噬作用，清除有害物質，避免病原的擴散。Li等［18］通過研究發(fā)現(xiàn)，與非特異性卵黃抗體相比，抗鰻弧菌卵黃抗體可顯著提高巨噬細胞對鰻弧菌的體外吞噬活性，表明特異性IgY可通過促進巨噬細胞的吞噬作用來降低組織中的細菌負荷。四是當卵黃抗體進入體內后，會被腸道內的消化酶降解為小肽，這些小肽可以與特定病原體結合達到中和病毒的作用［19］。五是卵黃抗體可以識別病毒表面的結構蛋白或整個病毒粒子，并與之結合后破壞病毒的結構，影響病毒與細胞結合，從而避免宿主受到病毒的侵染。Li等［20］的研究證實，抗rVP60-N IgY可以很好地識別和檢測到RHDV（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）感染的肝臟中的病毒粒子，阻斷病毒的傳播與感染。

2 卵黃抗體在水產養(yǎng)殖病害防治中的應用

目前的研究表明，卵黃抗體能夠有效防治水產動物細菌性疾病和病毒性疾病。卵黃抗體的應用方式有注射、浸泡和口服，不同的使用方式，所產生的免疫保護效果也會有所差異。其中，注射方式的免疫效果最好，可直接提高血清中的抗體水平，適用于因病原體感染引起的全身性病變［21］。浸泡免疫對于很多水生動物體表病原引起的感染效果更好，與注射免疫相比，浸泡免疫雖然能在一定程度上減小對水生動物的刺激，但是也存在抗體需求量大、生產成本較高等問題?？诜庖吒m用于防治腸道微生物引起的感染［22］，通過口服卵黃抗體的方式來靶向消除病原的感染是有顯著療效的。因此，在考慮動物福利和實際生產可行性的同時，口服免疫是一種更理想的預防策略［23］。

2.1 防治水產動物細菌性疾病

近年來，將卵黃抗體用于防治水產動物細菌性疾病的研究已有較多報道。Zhang等［23］在抗哈維氏弧菌特異性IgY對日本河豚的被動免疫保護研究中發(fā)現(xiàn)，注射、口服和浸泡的方式均能夠增強日本河豚的抵抗力。攻毒后特異性卵黃抗體組的存活率分別為80%、50%和60%，均顯著高于非特異性卵黃抗體組和對照組，表明特異性卵黃抗體能夠有效預防日本河豚哈維氏弧菌病。Li等［24］的實驗表明，注射和浸泡抗燦爛弧菌特異性IgY能夠顯著降低仿刺參呼吸樹、體壁、腸和體腔液中的細菌載量，增強體腔細胞的吞噬活性，將感染仿刺參的存活率提高了60%，具有良好的預防和治療的作用。Xu等［25］在飼料中添加5%、3%和1%殼聚糖-藻酸鹽包被的特異性IgY，連續(xù)投喂7 d后，對大菱鲆進行愛德華氏菌的注射攻毒，并在攻毒后對大菱鲆頭腎和脾臟組織的免疫相關基因表達水平進行了測定。結果顯示，口服微囊化IgY可以顯著降低脾臟和頭腎中促炎細胞因子（IL-1β、IL-8、TNF-α）和補體C3的轉錄水平，減輕炎癥反應，并將大菱鲆的存活率由0%提高到63.3%、56.7%和20%。王仁寶等［26］用添加了含0.2%和0.5%抗致急性肝胰腺壞死病副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus associated with acute hepatopancreatic necrosis disease，VpAHPND）卵黃抗體制劑的飼料來投喂凡納濱對蝦，測定了對蝦肝胰腺免疫酶活和免疫基因的相對表達水平，并通過浸浴感染實驗對特異性IgY的保護效果進行了研究。研究結果顯示，添加0.2% VpAHPND卵黃抗體制劑可顯著提高凡納濱對蝦肝胰腺酚氧化酶（PO）、超氧化物歧化酶（SOD）、溶菌酶（LZM）活力和抗菌肽基因（Crustin）的相對表達水平，增強對蝦免疫機能。在浸浴感染實驗中，0.2%免疫組對蝦的存活率為72.22%，0.5%免疫組對蝦的存活率為48.89%，兩個實驗組的存活率均高于對照組的23.33%，但0.5%免疫組與對照組的差異不顯著；結果表明，卵黃抗體的抗病效果與其添加劑量密切相關，適量添加卵黃抗體制劑可顯著提高患病對蝦的存活率，提高對蝦抗VpAHPND感染的能力。

2.2 防治水產動物病毒性疾病

目前，關于卵黃抗體在防治水產動物病毒性疾病的研究主要集中在了對蝦白斑綜合征（white spot disease，WSD）上，對于病毒性神經壞死?。╲iral nervous necrosis，VNN）和錦鯉皰疹病毒?。╧oi herpes virus disease，KHVD）也有少量報道。王仁寶等［27］的人工感染結果顯示，添加了0.2%和0.5%抗白斑綜合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）的卵黃抗體制劑實驗組的存活率分別為48.89%和87.78%，均顯著高于對照組。免疫功能實驗結果顯示，添加0.5% WSSV卵黃抗體制劑能夠明顯提高對蝦的PO、SOD活力和熱休克蛋白70基因（Hsp70）相對表達水平。研究表明，口服特異性卵黃抗體，能夠增強凡納濱對蝦的免疫力，提高對蝦抗WSSV感染的能力，在一定程度上延緩對蝦的死亡。盧亞楠等［28］通過構建重組質粒制備了抗WSSV特異性IgY，并且采用注射、口服、浸泡的方式對抗WSSV特異性卵黃抗體的保護效果進行了評估。研究結果顯示，注射、口服、浸泡滅活疫苗的IgY各實驗組累計存活率相對陽性對照顯著提升80%、46.7%及66.7%，表明IgY能夠很好地中和病毒，降低感染實驗動物的死亡率，表現(xiàn)出很好的免疫保護效果。Liu等［29］發(fā)現(xiàn)制備的特異性卵黃抗體能夠中和病毒，有效阻斷赤點石斑魚神經壞死病毒（red spotted grouper nervous necrosis virus，RGNNV）對石斑魚鰭細胞系（grouper fin cell line，GF-1）的侵襲。用含10%特異性卵黃粉的飼料投喂石斑魚幼魚，治療組和連續(xù)喂養(yǎng)組的相對保護率分別達到了68%和70%，組織中的病毒載量也顯著降低，表明抗RGNNV-IgY能夠有效地保護石斑魚免受RGNNV感染。Liu等［30］通過免疫蛋雞獲得了抗鯉皰疹病毒3型特異性卵黃抗體，并在連續(xù)投喂10 d含0.05%特異性IgY的顆粒飼料后，對鯉進行攻毒。經IgY口服被動免疫后，鯉的死亡率由85%下降至30%。結果表明，抗CyHV-3 IgY可以有效降低鯉皰疹病毒3型（cyprinid herpesvirus 3，CyHV-3）感染的鯉的死亡率，為鯉提供被動保護。

3 展望

卵黃抗體具有性質穩(wěn)定、特異性強、綠色安全、符合動物福利要求等優(yōu)勢，在水產動物病害防治方面得到了廣泛應用。目前的研究表明，用特異性抗原免疫蛋雞制備出的特異性卵黃抗體，通過注射、口服、浸泡的方式均可以引發(fā)動物機體的被動免疫機制，起到預防、治療動物疾病的作用。卵黃抗體口服應用中，IgY在進入動物腸道后會受到胃蛋白酶和胰蛋白酶的影響，但是利用β-環(huán)糊精［31］、卵磷脂、膽固醇［32］、海藻酸鈉［25，33］等進行包被處理后，能極大提高IgY抗水解能力，充分保證了IgY的活性。雖然口服的效果不如注射和浸泡，但是口服的方式不會對動物產生刺激，勞動強度小，節(jié)約成本，具有很強的可行性。同時，將卵黃抗體作為添加劑添加到飼料中，不僅可以促進水生動物的生長發(fā)育，改善水產品的品質，還能在一定程度上提高機體的免疫功能，對預防和治療水產動物疾病具有積極作用。

目前，卵黃抗體在生產應用中也存在以下幾個問題：一是，卵黃抗體的免疫保護效果受添加劑量的影響，不同抗原的卵黃抗體的最適添加劑量難以確定；二是，目前卵黃抗體產業(yè)還未形成標準化規(guī)程，生產出的產品參差不齊，實際應用過程中的保護效果差異明顯；三是，卵黃抗體的大規(guī)模應用仍受到提純工藝的限制，目前的卵黃抗體提純工藝差，生產成本高，還沒有一種適用于工業(yè)生產的經濟高效的提純方法。因此，今后應在如何提高抗體的免疫保護效果、降低生產成本等方面展開深入研究，充分發(fā)揮卵黃抗體在水產動物病害防治方面的作用，推動水產養(yǎng)殖行業(yè)的綠色健康、可持續(xù)發(fā)展。

參考文獻：

[1]

農業(yè)農村部漁業(yè)漁政管理局，全國水產技術推廣總站，中國水產學會.2022中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒[M].北京：中國農業(yè)出版社，2022：17-37.

[2] SILVA M T L D，DEODATO R M，VILLAR L M.Exploring the potential usefulness of IgY for antiviral therapy：A current review[J].International Journal of Biological Macromolecules，2021，189：785-791.

[3] KLEMPERER F.Ueber natürliche Immunitt und ihre Verwerthung für die Immunisirungstherapie[J].Archiv für Experimentelle Pathologie und Pharmakologie，1893，31（4-5）：356-382.

[4] LESLIE G A，CLEM L W.Phylogen of immunoglobulin structure and function Ⅲ.Immunoglobulins of the chicken[J].Journal of Experimental Medicine，1969，130（6）：1337-1352.

[5] SUZUKI N，LEE Y C.Site-specific N-glycosylation of chicken serum IgG[J].Glycobiology，2004，14（3）：275-292.

[6] BAE H D，HONDA H，MUROTA R，et al.Production of recombinant chicken IgY-Fc and evaluation of its transport ability into avian egg yolks[J].Journal of Poultry Science，2010，47（3）：256-261.

[7] 夏民權，李小萌，柳聰，等.禽蛋黃免疫球蛋白促進人體健康作用的研究進展[J].食品科學，2022，43（5）：346-355.

[8] 徐永平，徐樂，李紀彬，等.卵黃抗體飼料添加劑在畜牧及水產養(yǎng)殖病害防控中的研究進展[J].飼料工業(yè)，2021，42（18）：1-11.

[9] LIPMAN N S，JACKSON L R，TRUDEL L J，et al.Monoclonal versus polyclonal antibodies：distinguishing characteristics，applications，and information resources[J].ILAR Journal，2005，46（3）：258-268.

[10] LEE W，ATIF A S，TAN S C，et al.Insights into the chicken IgY with emphasis on the generation and applications of chicken recombinant monoclonal antibodies[J].Journal of Immunological Methods，2017，447：71-85.

[11] SHIMIZU M，NAGASHIMA H，SANO K，et al.Molecular stability of chicken and rabbit immunoglobulin G[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1992，56（2）：270-274.

[12] HATTA H，TSUDA K，AKACHI S，et al.Productivity and some properties of egg yolk antibody （IgY） against human rotavirus compared with rabbit IgG[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1993，57（3）：450-454.

[13] LARSSON A，BLW R M，LINDAHL T L，et al.Chicken antibodies：taking advantage of evolution - a review[J].Poultry Science，1993，72（10）：1807-1812.

[14] 那紅，楊曜中，歐伶，等.雞卵黃免疫球蛋白Y的性質[J].華東理工大學學報，1998，24（2）：172-175，180.

[15] HATTA H，TSUDA K，AKACHI S，et al.Oral passive immunization effect of anti-human rotavirus IgY and its behavior against proteolytic enzymes[J].Bioscience Biotechnology and Biochemistry，1993，57（7）：1077-1081.

[16] XU Y P，LI X Y，JIN L K，et al.Application of chicken egg yolk immunoglobulins in the control of terrestrial and aquatic animal diseases：A review[J].Biotechnology Advances，2011，29（6）：860-868.

[17] 靖凱霖.特異性卵黃抗體對燦爛弧菌感染仿刺參的保護作用研究[D].大連：大連理工大學，2016.

[18] LI C H，LU X J，LI D F，et al.Passive protective effect of chicken egg yolk immunoglobulins against experimental Vibrio anguillarum infection in ayu （Plecoglossus altivelis）[J].Fish & Shellfish Immunology，2014，37（1）：108-114.

[19] 巨曉軍，楊海明，王志躍，等.卵黃免疫球蛋白在畜禽生產中的研究與應用[J].動物營養(yǎng)學報，2015，27（3）：691-697.

[20] LI Z X，HU W D，LI B C，et al.Egg yolk IgY against RHDV capsid protein VP60 promotes rabbit defense against RHDV infection[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，2014，157（1-2），97-104.

[21] YI L Z，QIN Z D，LIN H Z，et al.Features of chicken egg yolk immunoglobulin （IgY） against the infection of red-spotted grouper nervous necrosis virus[J].Fish & Shellfish Immunology，2018，80：534-539.

[22] LI X Y，JIN L J，UZONNA J E，et al.Chitosan-alginate microcapsules for oral delivery of egg yolk immunoglobulin （IgY）：In vivo evaluation in a pig model of enteric colibacillosis[J].Veterinary Immunology and Immunopathology，2009，129（1-2）：132-136.

[23] ZHANG M X，GENG H J，JAVER M T，et al.Passive protection of Japanese pufferfish （Takifugu rubripes） against Vibrio harveyi infection using chicken egg yolk immunoglobulins （IgY）[J].Aquaculture，2021，532：736009.

[24] LI X Y，JING K L，WANG X T，et al.Protective effects of chicken egg yolk antibody （IgY） against experimental Vibrio splendidus infection in the sea cucumber （Apostichopus japonicus）[J].Fish & Shellfish Immunology，2016，48：105-111.

[25] XU L，CHE J，XU Y P，et al.Oral administration of microencapsulated egg yolk immunoglobulin （IgY） in turbot （Scophthalmus maximus） to combat against Edwardsiella tarda 2CDM001 infections[J].Fish & Shellfish Immunology，2020，106：609-620.

[26] 王仁寶，史成銀，宋曉玲，等.卵黃抗體對凡納濱對蝦生長、免疫及抗VpAHPND感染的影響[J].水產學報，2022，46（12）：2409？2420.

[27] 王仁寶，王一婷，張惠芬，等.口服特異性卵黃抗體對凡納濱對蝦抗WSSV感染的免疫保護效果[J].漁業(yè)科學進展，2022，43（4）：226-233.

[28] 盧亞楠.抗對蝦白斑綜合癥病毒特異性卵黃抗體的制備及其保護作用的研究[D].大連：大連理工大學，2009.

[29] LIU J Y，QIN Y H，YAN L M，et al.Protective effects of egg yolk immunoglobulins （IgY） on juvenile groupers （Epinephelus fuscoguttatus × Epinephelus lanceolatus） with red-spotted grouper nervous necrosis virus infection[J].Aquaculture，2021，545（11）：737218.

[30] LIU Z X，KE H，MA Y P，et al.Oral Passive immunization of carp Cyprinus carpio with anti-CyHV-3 chicken egg yolk immunoglobulin （IgY）[J].Fish Pathology，2014，49（3）：113-120.

[31] GAO X J，ZHANG X J，SUN J J，et al.Passive protection effect of anti-Vibrio anguillarum IgY-encapsulated feed on half-smooth tongue sole （Cynoglossus semilaevi） against V.anguillarum[J].Fish & Shellfish Immunology，2016，56：483-488.

[32] RAHMAN S ，NGUYEN S V，ICATLOJR F C，et al.Oral passive IgY-based immunotherapeutics：A novel solution for prevention and treatment of alimentary tract diseases[J].Human Vaccines & Immunotherapeutics，2013，9（5）：1039-1048.

[33] 寇海燕，郭培紅，田丹陽，等.抗鯉皰疹Ⅱ型病毒卵黃抗體制備及其功能鑒定[J].淡水漁業(yè)，2021，51（1）：65-71.

（收稿日期：2022-12-11）