姚逸萍，陽欣，石俊，闞光明，韓興林，顧志媛，宋濤，李登勇，皇甫潔*

(1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院有限公司，北京 100015；2.重慶江記酒莊有限公司,重慶 402289；3.國家酒類品質(zhì)與安全國際聯(lián)合研究中心,北京 100015)

隨著社會的發(fā)展，酒從日常餐桌上助興、消愁解悶的必備品，逐步演變成為一種文化的代名詞，酒體的品質(zhì)也得到越來越多的關(guān)注。社會經(jīng)濟(jì)的發(fā)展進(jìn)步，物質(zhì)文化水平的提高，人們對酒的消費(fèi)正逐步走向理性化，對酒的品質(zhì)提出了更高的要求，酒類消費(fèi)市場已經(jīng)由飲酒轉(zhuǎn)向舒適飲酒，飲后舒適度是酒類產(chǎn)品品質(zhì)非常重要的體現(xiàn)[1-2]。酒的飲用舒適度是人體對所飲用酒的最直接感受，換言之，飲后舒適度最直接地反映了酒品質(zhì)好壞[2]。

酒類產(chǎn)品特有的風(fēng)味主要源自酒體中的微量物質(zhì)[3]，這些微量成分構(gòu)成了種類繁多、風(fēng)格各異的酒體風(fēng)格[4-5]，還對人體內(nèi)酒精代謝及飲后舒適度起重要影響作用。酒精進(jìn)入人體后首先經(jīng)過血液進(jìn)入肝臟，通過肝臟功能代謝分解，主要對肝臟造成嚴(yán)重壓力。短期飲酒會造成嘔吐、記憶力減退、情緒不穩(wěn)定等神經(jīng)問題[6]。長期攝入大量酒精會導(dǎo)致行動(dòng)力喪失，意志模糊，甚至引起昏迷[6-7]。

配制酒又稱為調(diào)制酒，是指以發(fā)酵酒、蒸餾酒或食用酒精作為酒基，配加一定比例的可食用輔料（花、果、動(dòng)植物、中藥材等）或食品添加劑（如著色劑、甜味劑、香精等）進(jìn)行調(diào)配、混合或再加工制成的，改變了原酒基風(fēng)格的飲料酒[8]。配制酒中含有豐富的氨基酸、有機(jī)酸類物質(zhì)、糖類物質(zhì)、酮類物質(zhì)以及香氣成分。

果酒是一種以果汁或者新鮮水果為原料,經(jīng)獨(dú)特的發(fā)酵方式和工藝技術(shù)制備的低酒精度飲料酒[9]。根據(jù)張倩茹等[10]的研究，果酒的主要成分為糖類物質(zhì)、酸類物質(zhì)、氨基酸、酚類物質(zhì)、香氣成分。發(fā)酵完成后，果酒中酸的含量和種類相對穩(wěn)定，主要含有酒石酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、乙酸、檸檬酸、抗壞血酸等有機(jī)酸。檸檬酸和抗壞血酸具有生物活性。酚類化合物是果酒中主要活性成分，影響果酒的色澤、香氣還有口感，主要包括花青素、黃酮醇、沒食子酸、兒茶素、表兒茶素、槲皮素、酚酸等[10]。香氣物質(zhì)是果酒中重要的功能性組成成分，也是評價(jià)果酒品質(zhì)的重要指標(biāo)，香氣成分主要包括醇類、醛類、酯類、酮類、酸類和萜烯類等物質(zhì)。香氣成分不同，果酒的特征香氣也不相同，比如異戊醇具有焦糊味，苯乙醇具有玫瑰香味，糠醛具有谷物香氣，苯甲醇具有花香味等[10]。

甲醇是酒類釀造過程不可避免的的產(chǎn)物之一，對人體有很大危害，攝入甲醇5 g 就會導(dǎo)致嚴(yán)重中毒，攝入12.5 g 便可能導(dǎo)致死亡。甲醇的毒性主要在于對中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有麻醉作用，并且在體內(nèi)蓄積不易排出。甲醇還會在人體中被轉(zhuǎn)化為甲酸和甲醛，毒性更大，會對視力造成不可逆轉(zhuǎn)的傷害[11]。

青梅果酒顧名思義，是用青梅釀制而成，以青酸為口味的果酒，具有殺菌、消除疲勞、改善腸胃功能、改善血液循環(huán)、鎮(zhèn)痛、強(qiáng)化肝臟功能、抗氧化等功效。本研究通過對飲酒后大鼠酒精代謝程度的對比研究，同時(shí)根據(jù)酒體主要成分包括多酚、二氧化硫、甲醇、氨基甲酸乙酯、氰化物、有機(jī)酸、醛類、酮類和吡嗪類物質(zhì)的含量數(shù)值，建立多元線性回歸模型，預(yù)測影響青梅果酒飲后舒適度的酒體關(guān)鍵成分。對青梅果酒在飲后行為及酒精代謝中起關(guān)鍵作用的酒體風(fēng)味成分初步確定，以期為青梅果酒產(chǎn)品品質(zhì)提高提供理論和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑及儀器

1.1.1 實(shí)驗(yàn)酒樣

選擇5 款市售青梅果酒，如表1 所示。

表1 實(shí)驗(yàn)酒樣列表

表2 梯度洗脫程序

向1#—5#酒樣中分別加入不同程度的標(biāo)準(zhǔn)食用酒精(96%vol)，將所有酒樣的酒精度統(tǒng)一調(diào)整到20%vol。

1.1.2 試劑及耗材

琥珀酸、檸檬酸、酒石酸、硝酸鈉、蘋果酸、乙醛、丙醛、異丁醛、糠醛、乙縮醛、苯甲醛、丙酮、3-羥基-2-丁酮、三甲基吡嗪以及酚類物質(zhì)等標(biāo)準(zhǔn)品，均為色譜純，美國Sigma-Aldrich 公司。

1.1.3 儀器設(shè)備

PE Aoutosystem XL 氣相色譜儀及PE TurboM‐atrix 40 自動(dòng)頂空進(jìn)樣器，美國PerkinElmer；Clarns 600 氣相色譜儀，配火焰離子檢測器（flame ioniza‐tion detector,FID）,美國PerkinElmer；ICS-3000 型離子色譜儀,配有EG4 淋洗液自動(dòng)發(fā)生器、電導(dǎo)檢測器和Chromeleon 6.80 色譜工作站，美國Dionex 公司；高效液相色譜儀(high performance liquid chro‐matography,HPLC)Agilent 1260，安捷倫科技有限公司；Milli-Q 超純水儀，美國Millipore 公司；BS 124S型電子天平，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇和灌胃劑量

將25 只SPF 級SD 大鼠(鼠齡42 d，平均體重200 g)于清潔二級環(huán)境適應(yīng)性飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分組，每組5 只動(dòng)物。以人體每日攝入純酒精劑量0.90 g/kg 單位體重為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)大鼠與人體藥理學(xué)等效劑量進(jìn)行合理折算，確定每只大鼠灌胃劑量為6 mL。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的相關(guān)處理均嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物福利倫理與保護(hù)相關(guān)規(guī)定，隨時(shí)接受實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會的監(jiān)督與檢查，許可證號為(JK)2021-W-003。

1.2.2 主要酒體成分定量測定

有機(jī)酸采用ICS-3000 離子色譜測定。將樣品稀釋50 倍后，過孔徑為0.45 μ m 過濾膜后待用。柱溫設(shè)置為30 ℃。Ionpac AS11-HC分離柱（250 mm×4 mm），Ionpac AS11-HC 保護(hù)柱（50 mm×4 mm），淋洗液流速為1.0 mL/min，電導(dǎo)檢測器進(jìn)行檢測，進(jìn)樣量25 μ L。EG 淋洗液發(fā)生器自動(dòng)產(chǎn)生KOH 淋洗液梯度淋洗：0～16 min，KOH 濃度為1.1 mmol/L；17～29 min，KOH 濃度為16.5 mmol/L；29～35 min，KOH 濃度為20.0 mmol/L；35～39 min，KOH 濃度為35.0 mmol/L，穩(wěn)定2 min；41～47 min，KOH 濃度為50.0 mmol/L，隨后下降；在47.1 min 時(shí)KOH 濃度下降至1.1 mmol/L，穩(wěn)定至59 min 結(jié)束。抑制器再生模式：外加水抑制器。定性方法：將標(biāo)準(zhǔn)品用超純水溶解并稀釋，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。以峰面積進(jìn)行定量。

風(fēng)味物質(zhì)采用Clarus 600 氣相色譜儀測定。吸取10 mL 酒樣后置于25 mL 容量瓶當(dāng)中，加入0.1 mL 1 %內(nèi)標(biāo)液，均勻混合后進(jìn)行檢測。CPWAX57CB 毛細(xì)管柱（50 m×0.25 mm×0.2 μ m），載氣(高純氮)流速1 mL/min，分流比：10∶1；氫氣：流速為45 mL/min；空氣：流速為450 mL/min；檢測器溫度：270 ℃；進(jìn)樣器溫度：240 ℃；進(jìn)樣量：1 μ L。柱溫程序：起始溫度35 ℃，恒溫6 min，以4 ℃/min程序升溫至60 ℃，以6 ℃/min 程序升溫110 ℃，恒溫3 min，以6 ℃/min 程序升溫至205 ℃，恒溫13 min。定性方法：將標(biāo)準(zhǔn)品用無水乙醇溶解并稀釋，建立標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量。

酚類物質(zhì)采用安捷倫Agilent 1260 高效液相色譜測定。檢測器：VWD-1260 檢測器；色譜柱：C18柱(250 mm×4.6 mm×5 μm)；檢測波長：280 nm；流動(dòng)相，A 相：5 %甲醇+0.1 %甲酸+水，B 相：5 %乙腈+0.1 %甲酸+甲醇；柱溫：35 ℃；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μ L。梯度洗脫程序如表2 所示。

甲醇、氰化物、氨基甲酸乙酯和亞硫酸鹽的測定依照國標(biāo)檢測方法，檢測方法依據(jù)如表3 所示。

表3 檢測方法依據(jù)

1.2.3 灌酒后大鼠血清乙醇乙醛含量測定

灌胃酒樣后2 h 采用斷尾取血，采集血液標(biāo)本0.3 mL，加入30 μ L 肝素鈉(1800 U/mg)，混勻后于離心機(jī)中3500 r/min 離心10 min，取上清液，即為血漿，于-80 ℃貯存，待測其乙醇和乙醛含量。

依據(jù)《血液酒精含量的檢驗(yàn)方法GA/T 842—2009》進(jìn)行改進(jìn)，用以檢測乙醇和乙醛含量。對待測血漿進(jìn)行20 倍稀釋，取稀釋樣品1 mL 置于頂空瓶中，密封待用。采用PE Aoutosystem XL 型頂空氣相色譜儀，PE TurboMatrix 40 自動(dòng)頂空進(jìn)樣器進(jìn)行檢測。色譜柱：Agilent J&W-GC 型30 m×0.53 mm× 1.00 m 硅烷化玻璃柱；檢測器溫度為250 ℃，進(jìn)樣口溫度240 ℃，柱溫起始溫度40 ℃，以10 ℃/min 升溫至60 ℃，保持0 min，再以20 ℃/min升溫至120 ℃，保持0 min，再以40 ℃/min 升到215 ℃，頂空55 ℃，加熱時(shí)間40 min；載氣為N2、H2和空氣，流速分別設(shè)置為30 mL/min、45 mL/min、450 mL/min；FID 耦合火焰離子化檢測器，進(jìn)樣量：1 μ L，進(jìn)樣時(shí)間9.38 min。乙醇出峰時(shí)間為3.39 min/L，乙醛出峰時(shí)間為1.35 min/L。

1.2.4 數(shù)據(jù)分析

用Excel 分析處理數(shù)據(jù)，組間檢驗(yàn)采用Anvoa檢驗(yàn)，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均為3 個(gè)平行試驗(yàn)的平均值，用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(Standard error,SE)表示；圖表由Prism 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 酒體主要成分含量分析

通過理化指標(biāo)檢測對5 款青梅果酒中主要成分進(jìn)行定量分析，結(jié)果如表4 所示。由表4 可知，2#酒樣中多酚物質(zhì)含量遠(yuǎn)高于其余4 款酒樣，1#酒樣中二氧化硫、甲醇和氰化物含量遠(yuǎn)高于其余4 款酒樣，4#酒樣中氨基甲酸乙酯、檸檬酸含量遠(yuǎn)高于其余4 款酒樣，5#酒樣中琥珀酸遠(yuǎn)低于其余4 款酒樣，1#和3#酒樣中的酒石酸和硝酸根的總含量遠(yuǎn)高于其余3 款酒樣，3#和4#酒樣中蘋果酸的含量遠(yuǎn)高于其余3 款酒樣，2#酒樣中乙醛含量遠(yuǎn)低于其余4 款酒樣，5#酒樣中糠醛含量遠(yuǎn)高于其余4 款酒樣，4#酒樣中乙縮醛和苯甲醛的含量遠(yuǎn)高于其余4 款酒樣，3#酒樣中丙酮的含量遠(yuǎn)高于其余4 款酒樣。

表4 酒體主要成分定量分析檢測結(jié)果

2.2 酒精代謝水平分析

乙醇進(jìn)入人體后隨血液流經(jīng)肝臟，被乙醇脫氫酶氧化為乙醛，該過程會導(dǎo)致血液中乙醛的累積。乙醛再被乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸，最終乙酸被代謝為二氧化碳和水[12-13]。當(dāng)血液中乙醇濃度超過一定限度時(shí)，血流量增加而代謝作用下降，造成乙醇在腦中不能及時(shí)代謝排出，引起頭痛、頭暈。乙醛會使人心跳加速，血壓升高，嗓子發(fā)干，頭暈頭痛[14]。酒精代謝產(chǎn)物乙醛如果在體內(nèi)大量積累未轉(zhuǎn)化，容易引起“上臉、頭疼”的不舒適反應(yīng)。

采用氣相色譜測定血清中乙醇以及乙醛含量。根據(jù)圖1 灌胃2 h 后血清中殘余酒精積累量可知，酒精代謝慢即醉酒度高的酒依次是4#、2#、5#、1#、3#。根據(jù)圖2 灌胃2 h 后血清乙醛積累量結(jié)果可知，乙醛積累量從高到低依次是4#、2#、5#、1#、3#。

圖1 灌胃2 h 后殘余酒精積累量

圖2 灌胃2 h 后血清乙醛積累量

根據(jù)血清未代謝酒精水平和酒精代謝產(chǎn)物乙醛積累水平得到的醉酒度和醒酒度綜合分析，5 款青梅果酒整體飲后舒適性從高到低依次是3#、1#、5#、2#、4#。

2.3 影響青梅果酒飲后舒適度酒體關(guān)鍵成分線性回歸模型預(yù)測

根據(jù)酒體主要成分含量（2.1）和酒精代謝水平（2.2），建立多元線性回歸模型，預(yù)測影響青梅果酒飲后舒適度的酒體關(guān)鍵成分，結(jié)果如圖3 所示。

圖3 影響青梅果酒飲后舒適度酒體關(guān)鍵成分多元線性回歸預(yù)測

由圖3a 可知，與飲后舒適度成負(fù)相關(guān)的酒體成分有總多酚(Slope=-2054，R2=0.6917)、氨基甲酸乙 酯 EC(Slope=-49.88，R2=0.9279)、氰化物(Slope=-2449，R2=0.3939)、甲醇(Slope=-160.9，R2=0.13330)，二氧化硫(Slope=-9.065，R2=0.03)。除二氧化硫外，其他成分均具有顯著差異。甲醇和氰化物在1#中含量較高，極為顯著。

由圖3b 可知，與飲后舒適度成極為顯著負(fù)相關(guān)的酒體成分是檸檬酸(Slope=-11274，R2=0.4838)；與舒適度成正相關(guān)的酒體成分是琥珀酸(Slope=1998，R2=0.1725)，酒石酸+硝酸根(Slope=1285，R2=0.01845)，蘋果酸(Slope=990，R2=0.1221)，其中顯著的是琥珀酸和蘋果酸。根據(jù)含量，綜合分析其主要作用的負(fù)性成分是檸檬酸。

由圖3c 可知，與飲后舒適度成正相關(guān)的酒體成分是異丁醛(Slope=0.9329，R2=0.6981)、丙酮(Slope=15.30，R2=0.6773)，其中顯著的是丙酮。與飲后舒適度成負(fù)相關(guān)的酒體成分是乙醛(Slope=-13.22，R2=0.08)、苯甲醛(Slope=-17.81，R2=0.6697)、丙醛(Slope=-0.5576，R2=0.05)、糠醛(Slope=-3.23，R2=0.02)、乙縮醛(Slope=-5.02，R2=0.1456)、3-羥基-2-丁酮(Slope=-0.88，R2=0.005)、3-甲基吡嗪(Slope=-1.098，R2=0.0737)，其中顯著的是乙醛。

3 結(jié)論

本研究選用了生理生化層面的基本評價(jià)指標(biāo)，即酒精代謝水平進(jìn)行分析，通過該指標(biāo)可以對酒體的飲后舒適度進(jìn)行評價(jià)[15]。舒適度較好的酒具有酒精代謝快即血清酒精積累量低及酒精代謝產(chǎn)物乙醛積累量低的特點(diǎn)。結(jié)合酒體主要成分含量，建立多元線性回歸模型，綜合分析潛在顯著性酒體成分在青梅果酒中的含量，確定影響青梅果酒飲后舒適度的關(guān)鍵酒體成分，按照影響負(fù)性程度可以分為關(guān)鍵成分和主要成分兩大類，其中，關(guān)鍵成分包括甲醇和氰化物，主要成分包括氨基甲酸乙酯、二氧化硫、檸檬酸、醛類。

甲醇的危害主要是對人體的中樞神經(jīng)系統(tǒng)、眼睛以及酸堿平衡造成影響，例如會引起人頭暈乏力、視物模糊、視力減退、嗜睡等情況，甲醇在體內(nèi)分解較慢，有蓄積作用，視神經(jīng)對甲醇的毒性很敏感，7～8 mL 即可引起失明，30～100 mL 可能致死。氰化物對人體的傷害主要是神經(jīng)方面的，可能會導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)迅速喪失功能，繼而使人體出現(xiàn)呼吸肌麻痹、心跳停止、多臟器衰竭等癥狀而中毒，還可能引起后續(xù)的致癌反應(yīng)[16-17]。氨基甲酸乙酯是葡萄酒發(fā)酵過程中產(chǎn)生的不良代謝產(chǎn)物，是公認(rèn)對人體有害的物質(zhì)，主要由尿素和乙醇反應(yīng)形成，其次由氨甲酰磷酸和瓜氨酸與乙醇反應(yīng)生成[5，18]。二氧化硫SO2是一種食品添加劑，葡萄酒釀造過程中添加少量二氧化硫，可防止變質(zhì)，但必須嚴(yán)格控制用量。在體內(nèi)SO2首先被轉(zhuǎn)化為亞硫酸鹽，亞硫酸鹽被亞硫酸鹽氧化酶(SO)氧化成無毒的硫酸鹽，通過尿液排出體外。長期攝入過量的亞硫酸鹽會造成呼吸困難、嘔吐等癥狀，還可能會破壞維生素B1，影響生長發(fā)育。根據(jù)GB 15037—2006 葡萄酒規(guī)定，檸檬酸在葡萄酒中限量不超過2 g/L。長期食用含檸檬酸的食品，有可能導(dǎo)致低鈣血癥，并且會增加患十二指腸癌的幾率。兒童表現(xiàn)有神經(jīng)系統(tǒng)不穩(wěn)定、易興奮，大人則為手足抽搐、肌肉痙攣、感覺異常、瘙癢及消化道癥狀等。人體吸收醛類后，會引起交感神經(jīng)興奮，有害心肌，使血壓升高，還會刺激黏膜系統(tǒng)。如酒中醛類含量過高，飲用后會造成口干舌燥，喉嚨痛和胃痛[19-20]。

基于青梅果酒飲后舒適度酒體關(guān)鍵成分研究，初步確定影響青梅果酒飲后舒適度的關(guān)鍵酒體成分包括甲醇、氰化物、氨基甲酸乙酯、二氧化硫、檸檬酸及醛類。本項(xiàng)目研究結(jié)果可為青梅果酒產(chǎn)品酒體設(shè)計(jì)以及產(chǎn)品品質(zhì)提升提供理論和數(shù)據(jù)支撐。企業(yè)可以通過工藝調(diào)整如加強(qiáng)原料批次源頭污染物控制，建立工藝控制規(guī)范，以及加強(qiáng)發(fā)酵過程控制等有效措施，進(jìn)一步降低負(fù)性成分含量，從而生產(chǎn)出品質(zhì)更好，飲后舒適度更佳的青梅果酒產(chǎn)品。