雷歡，陳雪琴，胡錦玉，吳奇芝，段燕林，方海紅

江西科技師范大學(xué)，江西 南昌 330013

補(bǔ)陽還五湯是活血化瘀療法的代表性配方，最早由清代醫(yī)生王清任在當(dāng)歸補(bǔ)血湯的基礎(chǔ)上創(chuàng)制。補(bǔ)陽還五湯具有益氣、活血通絡(luò)功效［1］。廣泛用于缺血性腦血管病、冠心病、心肌梗死和其他血栓栓塞疾病的預(yù)防和治療。補(bǔ)陽還五湯由七種中藥組成：黃芪、當(dāng)歸、赤芍、川芎、桃仁、紅花和地龍。鑒于我國擁有的豐富草藥資源，有必要對其進(jìn)行深入研究并加以合理地開發(fā)與利用，為補(bǔ)陽還五湯的應(yīng)用創(chuàng)造更多的價(jià)值［2］。

隨著信息時(shí)代的發(fā)展，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)已經(jīng)成為藥物機(jī)制研究和藥物開發(fā)的新途徑，包括探索藥物對疾病的基本藥理作用及其機(jī)制，分析中醫(yī)理論，以及研究中醫(yī)藥的應(yīng)用［3］。目前，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對補(bǔ)陽還五湯治療某一疾病作用的探討已有作者提出，如對心衰、心絞痛、動(dòng)脈粥樣硬化等心血管疾病的研究［4-5］，以及糖尿病、脂肪肝等代謝性疾病的研究等［6-7］。補(bǔ)陽還五湯的多靶點(diǎn)、多通路特點(diǎn)，有治療多種疾病的優(yōu)勢，但未見文獻(xiàn)對其治療不同疾病潛能進(jìn)行報(bào)道。基于此，本研究通過可視化技術(shù)將補(bǔ)陽還五湯生物網(wǎng)絡(luò)中“藥物-靶點(diǎn)-基因-疾病”間的大量信息及他們之間的相互作用的復(fù)雜聯(lián)系轉(zhuǎn)化為直觀的可視網(wǎng)絡(luò)，通過網(wǎng)絡(luò)關(guān)系預(yù)測或揭示藥物對機(jī)體的作用機(jī)制，以期為補(bǔ)陽還五湯的臨床應(yīng)用與開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 補(bǔ)陽還五湯生物活性成分和靶標(biāo)的鑒定

補(bǔ)陽還五湯的中藥生物活性成分從藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)（TCMSP,http://ibts.hkbu.eAdu.hk/LSP/tcmsp.php），中醫(yī)百科全書（ETCM，http://www.tcmip.cn/ETCM/）和文獻(xiàn)中獲得。根據(jù)ADME 的原則，設(shè)置OB ≥30%和BL ≥0.18 為閾值，獲得補(bǔ)陽還五湯的主要活性成分，并從上述數(shù)據(jù)庫獲得各成分的靶基因，通過UniPort 數(shù)據(jù)庫對所有靶基因進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)

將補(bǔ)陽還五湯靶點(diǎn)基因?qū)隨TRING 數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org) 進(jìn)行蛋白分析，得到蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，以置信度≥0.9 為篩查標(biāo)準(zhǔn)，將篩選后靶點(diǎn)信息導(dǎo)入 Cytoscape 3.9.0 繪制并構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)圖，利用Network Analyzer 和CytoNCA 插件，根據(jù)連接度、介度、緊密度等參數(shù)分析并獲取網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)。

1.3 GO 和KEGG 富集分析

將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(https://david.Ncifcrf.gov/)進(jìn)行GO 功能注釋和KEGG 通路富集分析。確定主要的生物過程（BP）、細(xì)胞成分（CC）、分子功能（MF）和關(guān)鍵信號通路，并繪制GO 分析和KEGG 通路富集圖。

1.4 補(bǔ)陽還五湯治療疾病潛能預(yù)測

將富集的關(guān)鍵信號通路導(dǎo)入CTD 數(shù)據(jù)庫（http://ctdbase.org/），通過“Batch Query”查詢并下載各通路相關(guān)聯(lián)的疾病。將所有通路對應(yīng)的疾病以及出現(xiàn)頻次較多的疾病進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5 構(gòu)建“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)

為直觀呈現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯對治療疾病的作用機(jī)制，將篩選的補(bǔ)陽還五湯活性成分、對應(yīng)的靶點(diǎn)、主要通路及對應(yīng)的疾病導(dǎo)入Cytoscape 3.9.0 繪制可視化網(wǎng)絡(luò)圖。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)陽還五湯生物活性成分和靶標(biāo)的收集

從TCMSP、ETCM 數(shù)據(jù)庫和PubMed 文獻(xiàn)中獲得補(bǔ)陽還五湯的生物活性成分92 個(gè)，包括黃芪活性成分19 個(gè)、當(dāng)歸成分7 個(gè)、赤芍成分14 個(gè)、川芎成分11 個(gè)、桃仁成分19 個(gè)、紅花成分16 個(gè)和地龍成分6 個(gè)。去除重復(fù)后獲得80 個(gè)補(bǔ)陽還五湯的活性化合物以及566 個(gè)相應(yīng)靶基因。

2.2 PPI 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建以及篩選關(guān)鍵靶點(diǎn)

將補(bǔ)陽還五湯篩選的566 個(gè)靶基因?qū)隨TRING 平臺(tái)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，并利用Cytoscape3.9.0進(jìn)行可視化，獲得459 個(gè)節(jié)點(diǎn)，2 523 條邊的網(wǎng)絡(luò)。構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)如圖1 所示。

圖1 補(bǔ)陽還五湯核心靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 GO 功能和KEGG 途徑富集分析

通過David 數(shù)據(jù)庫對459 個(gè)關(guān)鍵靶基因進(jìn)行了富集和分析，共獲得1 444 個(gè)富集項(xiàng)目，包括237個(gè)MF，1 060 個(gè)BP 和147 個(gè)CC 類別，根據(jù)count值構(gòu)建了前10 項(xiàng)的條形圖（圖2）。在BP 類別中，排名靠前的包括RNA 聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)控，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等；CC 組分排名靠前的包括細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核等；MF 過程排名靠前的有蛋白結(jié)合、酶結(jié)合等。KEGG 富集分析獲得1 016 條信號通路。根據(jù)count 值繪制了20 條關(guān)鍵信號通路的氣泡圖（圖3），主要包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、代謝作用等。

圖2 補(bǔ)陽還五湯作用靶點(diǎn)GO富集分析圖

圖3 補(bǔ)陽還五湯作用靶點(diǎn)KEGG通路富集分析圖

2.4 補(bǔ)陽還五湯治療疾病潛能預(yù)測

將前20 條KEGG 通路導(dǎo)入CTD 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行疾病分析，將所得到的疾病進(jìn)行匯總，篩選出富集較為集中的為心腦血管疾病以及多種腫瘤，其中調(diào)控肝硬化、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肝癌、胃腫瘤等腫瘤的基因富集顯著。

2.5 “成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

用Cytoscape 3.9.0軟件建立補(bǔ)陽還五湯“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)，見圖4，清楚地展現(xiàn)補(bǔ)陽還五湯的活性成分、通路、靶點(diǎn)與不同疾病的作用關(guān)系，也揭示補(bǔ)陽還五湯的藥效作用機(jī)制。

圖4 補(bǔ)陽還五湯治療多疾病的“成分-靶點(diǎn)-通路-疾病”交互網(wǎng)絡(luò)

3 討論

補(bǔ)陽還五湯是一個(gè)經(jīng)典的中藥方劑，廣泛用于緩解神經(jīng)功能障礙和改善氣虛血瘀型冠心?。?］。本研究利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討補(bǔ)陽還五湯的治療潛能及作用機(jī)制，使用數(shù)據(jù)挖掘，從補(bǔ)陽還五湯的7 種中藥中獲得了92 個(gè)活性成分和556 個(gè)潛在目標(biāo)。其中槲皮素、川芎嗪、藁本內(nèi)酯、羥基紅花黃色素A和二氫辣椒素等主要活性成分涉及的通路包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、代謝作用等信號通路，對心腦血管疾病及多種腫瘤具有較好的治療潛能。

中醫(yī)認(rèn)為肝硬化后期辨證主要屬氣虛血瘀，補(bǔ)陽還五湯能補(bǔ)氣活血、化瘀通絡(luò)，正切合本病病機(jī)。有研究［9］表明它能改善微循環(huán)，對抗增生性炎癥，還可降低血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶。乳腺腫瘤前期臨床表現(xiàn)為乳房腫塊、脹痛等，病機(jī)多為肝郁氣滯之實(shí)證，常選用補(bǔ)陽還五湯加減［10］。槲皮素具有抑制腫瘤細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡的作用，在抗肝癌、肺癌、胃癌、鼻咽癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌及膀胱癌中發(fā)揮的藥理作用與使用劑量都已得到國內(nèi)外的廣泛認(rèn)可，且大多都呈現(xiàn)劑量與時(shí)間的依賴性［11-12］。川芎嗪具有抑制白血病、乳腺癌、前列腺腫瘤等多種惡性腫瘤的作用［13-14］。羥基紅花黃色素 A 是中藥紅花活血通經(jīng)、散瘀止痛功效相關(guān)的有效成分之一，研究表明，羥基紅花黃色素 A 除了抗心肌缺血作用外，還具有抗腦缺血，改善認(rèn)知，抗帕金森病，降血糖，抗癌，改善肺、肝、腎及骨組織功能等多種藥理作用［15］。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對補(bǔ)陽還五湯作用的關(guān)鍵通路與治療潛能進(jìn)行了分析。補(bǔ)陽還五湯可能通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫系統(tǒng)、代謝作用等信號通路，改善心腦血管疾病，同時(shí)對肝硬化、前列腺腫瘤、乳腺腫瘤、肝癌、胃腫瘤等疾病具有較好治療潛能，為補(bǔ)陽還五湯治療腫瘤等疾病提供了理論依據(jù)。