張鈺祺，顏干明，龔千鋒，于歡

1.江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004；2.萍鄉(xiāng)市食品藥品檢驗(yàn)所，江西 萍鄉(xiāng) 337055

附子為毛茛科植物烏頭Aconitum carmichaelii Debx.子根的加工品［1］。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其功效能上助心陽(yáng)，中溫脾陽(yáng)，下補(bǔ)腎陽(yáng)。附子藥效顯著，但因其生品有大毒，臨床上多用其炮制品。附子的炮制方法歷代以來(lái)有火制、輔料制等多種方法［2］，其中江西特色中藥炮制流派“樟幫”采用米泔水漂，加入姜片蒸制，使附子炮生為熟，以達(dá)到減毒增效的作用，飲片命名為“臨江片”；是“樟幫”一大特色優(yōu)勢(shì)飲片［3］。

目前關(guān)于該傳統(tǒng)飲片的相關(guān)報(bào)道十分少見(jiàn)，其炮制工藝、質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)缺乏。據(jù)《樟樹(shù)中藥炮制全書(shū)》記載［4］，其炮制方法為：將鹽附子洗去鹽分，冷水漂1～2 d，用竹刀刮去外皮，清水漂凈，切成2～3分(約0.66～0.99 cm)厚橫片，再用米泔水漂2～3 d（早、中、晚?yè)Q米泔水1 次），取出加生姜片拌勻，最后置蒸籠中蒸至透心，倒入大篩內(nèi)用扇子扇涼，使其結(jié)面，邊扇邊鋪開(kāi)藥片，烘干（先用大火，后用小火，經(jīng)常翻動(dòng)）。由于缺乏具體的工藝參數(shù)，其炮制技術(shù)經(jīng)驗(yàn)性強(qiáng)，生產(chǎn)上受到一定的影響，臨床應(yīng)用亦受到限制。

為繼承和發(fā)展傳統(tǒng)炮制方法，本研究采用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)方法，結(jié)合多指標(biāo)綜合加權(quán)分析，優(yōu)選出臨江片的炮制工藝，進(jìn)一步發(fā)掘并整理其特色炮制工藝，以期為臨江片的生產(chǎn)和使用提供參考［5］。

1 材料

1.1 儀器

Dionex UltiMate3000 液相色譜儀，PDA-3000 二極管陣列紫外檢測(cè)器，Chromeleon 工作站，Sartorius BS214-D 天平（萬(wàn)分之一），Mettler AE240 天平（十萬(wàn)分之一），HY-4 調(diào)速多用振蕩器，GZX-9076MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱等。

1.2 材料

烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：PF191204-26，純度：98.52%）購(gòu)于美國(guó)Stanford Chemicals 公司。新烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：110799-201608，純度：98.5%），次烏頭堿對(duì)照品（批號(hào)：110798-202010，純度：99.2%），苯甲酰烏頭原堿（批號(hào)：111794-202006，純度：99.5%），苯甲酰新烏頭原堿（批號(hào)：111795-201805，純度：93.1%），苯甲酰次烏頭原堿（批號(hào)：111796-201906，純度：96.4%）購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院。鹽附子采自四川江油，經(jīng)江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院龔千鋒教授鑒定為鹽附子。甲醇、乙腈均為色譜純。

鹽附片的制備方法：取鹽附子，洗凈，加入30倍量的清水，浸漂7 d，每日換水2 次。將浸漂后的鹽附子置75 ℃烘箱內(nèi)烘1.5 h 后取出，切成3 mm厚片，繼續(xù)烘2 h，即得。

臨江片的制備方法：鹽附子洗去表面鹽分，清水浸漂2 d，每天換水2 次（春夏季節(jié)為防止腐敗，換水為3 次/d），撈出，刮去外皮，洗凈，切6～9 mm厚橫片，再用米泔水漂3 d（早、中、晚各換水1 次），撈出。輔料生姜用量、蒸制時(shí)間、烘干溫度以及烘干時(shí)間按照L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，分別得到9 份臨江片樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1 總生物堿的含量測(cè)定［6］

分別取臨江片正交試驗(yàn)樣品粉末10 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，加三氯甲烷-乙醚（1∶3）的混合溶液50 mL，以及氨試液4 mL，密塞，搖勻，放置陰涼處12 h 以上，濾過(guò)，藥渣加上述混合溶液50 mL，連續(xù)振搖1 h，靜置后過(guò)濾，藥渣再用上述混合溶液洗滌3 至4 次，每次20 mL，濾過(guò)，合并洗液與濾液，水浴蒸干。殘?jiān)右掖?0 mL 使溶解，轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，精密加入硫酸滴定液（0.01 mol/L）15 mL，水15 mL 與甲基紅指示劑3 滴，用氫氧化鈉滴定液（0.02 mo1/L）滴至黃色。每1 mL 硫酸滴定液（0.01 mol/L）相當(dāng)于12.9 mg 的烏頭堿（C34H47NO11）。

2.2 雙酯型生物堿、單酯型生物堿含量

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Hypersil BDS C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-40 mmol/L乙酸銨溶液；梯度洗脫：0～10 min，15%→25%乙腈，10～25 min，25%～30%乙腈，25～35 min，70%乙腈，35～50 min，30% →38% 乙 腈，50～70 min，38% →50%乙腈；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：230 nm。色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品（A）及鹽附片（B）的 HPLC 圖

2.2.2 混合對(duì)照品溶液制備 精密稱取烏頭堿對(duì)照品7.27 mg、次烏頭堿對(duì)照品9.84 mg、新烏頭堿對(duì)照品10.06 mg、苯甲酰烏頭原堿對(duì)照品3.84 mg、苯甲酰新烏頭原堿對(duì)照品3.02 mg、苯甲酰次烏頭原堿對(duì)照品3.00 mg，置5 mL 量瓶中，加入0.05 %鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.3 供試品溶液制備 取鹽附片、臨江片樣品細(xì)粉約4 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，加入4 mL 濃氨水，浸潤(rùn)0.5 h，再加入乙醚75 mL，密塞，陰涼處放置12 h 以上，超聲提取10 min，過(guò)濾，藥渣加乙醚洗滌3 次，每次25 mL，濾過(guò)，合并洗液與濾液，水浴蒸干。殘?jiān)?.05% 鹽酸甲醇溶液使溶解，轉(zhuǎn)移至2 mL 量瓶中，搖勻，即得。

2.2.4 線性關(guān)系考察 精密吸取上述混合對(duì)照品溶液50、100、200、300、400、500 μL 分別置于5 mL容量瓶中，用0.05%鹽酸甲醇溶液稀釋至刻度，搖勻，分別進(jìn)樣20 μL。以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程分別為：新烏頭堿y=196.51x+0.602，r=0.997 9，線性范圍0.021～0.210 mg/mL；烏頭堿y=197.3x+0.205 4，r=0.998 6，線性范圍0.014～0.143 mg/mL；次烏頭堿y=238.63x-1.353 1，r=0.999 8，線性范圍0.019～0.195 mg/mL；苯甲酰新烏頭原堿y=193.76x-0.156 2，r=0.999 6，線性范圍0.006～0.056 mg/mL；苯甲酰烏頭原堿y=181.9x-0.406 2，r=0.998 3，線性范圍0.007～0.077 mg/mL；苯甲酰次烏頭原堿y=111.25x+0.079 5，r=0.996 2，線性范圍0.006～ 0.058 mg/mL；表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 取鹽附片樣品細(xì)粉，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，精密吸取樣品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，進(jìn)樣體積為20 μL。測(cè)得樣品中6 種生物堿對(duì)照品面積的RSD分別為1.50%、1.21%、0.90%、2.38%、1.72%、0.81%，表明儀器精密度良好。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取同一批鹽附片樣品細(xì)粉6 份，按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20 μL。測(cè)得樣品中6 種生物堿面積的RSD 分別為0.86%、0.38%、0.68%、0.54%、2.17%、1.89%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一鹽附片樣品溶液,分別于0、4、8、16、24 h 進(jìn)樣，進(jìn)樣體積為20 μL。測(cè)得樣品中6 種生物堿面積的RSD 分別為0.32%、1.25%、0.85%、1.78%、1.49%、0.54%，表明該方法穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知6 種生物堿含量的鹽附片細(xì)粉6 份，每份約2 g，精密稱定。分別精密加入“2.2.2”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液0.5 mL，按“2.2.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行制備，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定并計(jì)算回收率。結(jié)果6 種生物堿的平均回收率分別為101.1%（RSD 1.49%）、99.8%（RSD 0.96%）、100.90%（RSD 1.98%）、98.9%（RSD 2.08%）、101.3%（RSD 1.78%）、99.99%（RSD 2.11%）。

2.2.9 樣品含量測(cè)定 分別取臨江片正交試驗(yàn)樣品細(xì)粉4 g，精密稱定，照“2.2.3”項(xiàng)下方法制備，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣體積為20 μL，測(cè)得樣品中6 種生物堿的相應(yīng)峰面積。

2.3 浸出物含量

分別取臨江片正交試驗(yàn)樣品細(xì)粉4 g，精密稱定，置100 mL 錐形瓶中，精密加水50 mL，密塞，稱定重量，靜置1 h 后，加熱回流1 h，加入適量水補(bǔ)足減失重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液25 mL，置干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸至近干，105 ℃干燥3 h，置干燥器中冷卻0.5 h，精密稱定。9 份試驗(yàn)樣品平行操作，分別計(jì)算浸出物含量。

2.4 正交試驗(yàn)

2.4.1 因素和水平 依據(jù)臨江片傳統(tǒng)的炮制方法，分別考察蒸制時(shí)間（A）、輔料生姜用量（B）、烘干溫度（C）和烘干時(shí)間（D），選用L9（34）正交表進(jìn)行試驗(yàn)，具體見(jiàn)表1。雙酯型生物堿含量為新烏頭堿、烏頭堿、次烏頭堿的含量之和，單酯型生物堿含量為苯甲酰新烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、苯甲酰次烏頭原堿的含量之和［7］。采用多指標(biāo)綜合加權(quán)評(píng)分方法進(jìn)行評(píng)分，具體權(quán)重為：總生物堿、雙酯型生物堿和單酯型生物堿均為附子的主要有效成分，其含量占權(quán)重均為30% ；浸出物為評(píng)價(jià)飲片質(zhì)量的重要指標(biāo)，其含量占權(quán)重10%。各指標(biāo)均為越高越好，計(jì)算方法為：綜合分=總生物堿含量/最大值×100×30%+雙酯型生物堿含量/最大值×100×30%+單酯型生物堿含量/最大值×100×30%+浸出物含量/最大值×100×10%。

表1 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

2.4.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 取9 份鹽附子各200 g，按表2 中的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，加入不同比例的生姜片拌勻，蒸制不同時(shí)間，攤開(kāi)放置待其冷卻至室溫，在不同溫度下，烘干不同時(shí)間，得到9 份樣品。取每份樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1，采用正交設(shè)計(jì)助手V3.1 版計(jì)算機(jī)軟件對(duì)綜合評(píng)分進(jìn)行方差分析，方差分析見(jiàn)表2。

表2 方差分析

通過(guò)方差分析［8］，烘干溫度和蒸制時(shí)間對(duì)結(jié)果具有顯著影響，四個(gè)因素的影響程度為C＞A＞D＞B，故得到臨江片的最佳炮制工藝為A3B3C2D1，即：加入12%的生姜片，蒸制10 h 后，70 ℃烘4 h。

2.4.3 炮制工藝驗(yàn)證試驗(yàn) 按照優(yōu)選的炮制工藝，制備3 批樣品，分別測(cè)定各指標(biāo)，總生物堿含量、雙酯型生物堿含量、單酯型生物堿含量、浸出物含量以及綜合評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表3。驗(yàn)證試驗(yàn)與正交試驗(yàn)優(yōu)選結(jié)果相近，說(shuō)明優(yōu)選的炮制方法穩(wěn)定可行。

表3 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果 分

3 討論

附子主含生物堿類成分，其雙酯型生物堿既是主要的藥理活性成分，同時(shí)也是主要的毒性成分［9］。經(jīng)水解后的雙酯型生物堿轉(zhuǎn)變?yōu)閱熙バ蜕飰A，其毒性明顯降低，進(jìn)一步水解為胺醇類堿后毒性更?。?0］。臨江片采用的炮制方式是蒸制和姜制兩種，其中蒸制由于是隔水蒸，能有效避免附子長(zhǎng)時(shí)間與水接觸而使生物堿大量流失，同時(shí)高溫高濕的環(huán)境能較好地將雙酯型生物堿轉(zhuǎn)化為單酯型生物堿，減毒效果顯著，蒸制還可使附子中的淀粉充分糊化，成品呈角質(zhì)樣，質(zhì)地堅(jiān)硬，因此不易蟲(chóng)蛀、易于保管，同時(shí)飲片中的成分相對(duì)均勻穩(wěn)定，醫(yī)生處方時(shí)易于掌握劑量［3,11］。生姜作為輔料自古與附子配伍以達(dá)到增效的功效,《本草綱目》記載“附子得生姜?jiǎng)t能發(fā)散，以熱攻熱，又導(dǎo)虛熱下行，以除冷病”，姜制可使附子功效增加。蒸制減毒與姜制增效，使得臨江片獨(dú)具特色和功效［3］。

為證明其減毒的效果，實(shí)驗(yàn)采用HPLC 法建立了酯型生物堿的含量測(cè)定方法，可同時(shí)檢測(cè)附子中的6 種酯型生物堿，方法操作簡(jiǎn)單，穩(wěn)定可行。對(duì)比了鹽附片和臨江片的生物堿含量變化情況后發(fā)現(xiàn)：鹽附子經(jīng)樟幫法炮制為臨江片后，雙酯型生物堿含量大大下降，從221 μg/g 下降至25 μg/g，單酯型生物堿含量顯著增加，從55 μg/g 增加至240μg/g，總生物堿含量從175 μg/g 增加至239 μg/g，證明樟幫法炮制附子能有效地保留生物堿成分，同時(shí)降低了毒性成分的含量，符合附子炮制減毒增效的目的。

實(shí)驗(yàn)首次使用多指標(biāo)綜合加權(quán)分析法優(yōu)選臨江片的炮制工藝，以總生物堿、雙酯型生物堿、單酯型生物堿以及浸出物為考察指標(biāo)。通過(guò)預(yù)試驗(yàn)，篩選出影響臨江片成分和活性影響較大的因素，即生姜用量、蒸制時(shí)間、烘干溫度以及烘干時(shí)間。通過(guò)正交試驗(yàn)，確定了臨江片的最佳炮制工藝，即：加入12%的生姜片，蒸制10 h 后，70 ℃烘4 h，炮制出的飲片，片形美觀，質(zhì)地堅(jiān)硬，半透明，呈角質(zhì)樣光澤，且有姜香氣，極少灰屑，符合原書(shū)記載，可為今后發(fā)展與應(yīng)用臨江片這一優(yōu)勢(shì)傳統(tǒng)飲片提供炮制工藝技術(shù)參考。