劉靜莎，張健鵬

（1.北京市順義區(qū)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，北京 101300 ；2.中國人民解放軍總醫(yī)院第三醫(yī)學(xué)中心呼吸科，北京 100039）

自1971 年P(guān)auling 等[1]發(fā)現(xiàn)人呼出氣體中存在著極微量的揮發(fā)性有機(jī)化合物（volatile organic compounds，VOCs）以來，相關(guān)的基礎(chǔ)研究顯示，呼出氣VOCs 可能對(duì)一些疾病的早期診斷具有價(jià)值。人體內(nèi)的VOCs 是在人體組織的正常生理過程及與疾病相關(guān)的病理過程中產(chǎn)生的[2]，是體內(nèi)代謝過程的降解產(chǎn)物，可以通過呼出氣獲得，其成分直接因病理過程（如感染或惡性腫瘤）而發(fā)生改變[3]。VOCs 譜的變化可能反映了整個(gè)身體或特定組織的代謝紊亂[4]。近年來，VOCs 已經(jīng)顯示出作為各種疾病生物標(biāo)志物的巨大潛力[5]，VOCs 的使用已被提議作為一種快速、潛在低成本和非侵入性的方法來診斷多種疾病。本研究擬采用光聲光譜技術(shù)（Photoacoustic spectroscopy，PAS）進(jìn)行檢測(cè)，觀察比較細(xì)菌性肺炎患者的呼出氣與同種細(xì)菌頂空氣體VOCs 光聲光譜圖之間的差異，以評(píng)價(jià)細(xì)菌性肺炎患者的呼出氣對(duì)同種致病細(xì)菌是否具有代表性。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

肺炎組：隨機(jī)選擇2021 年1 月至2022 年1 月期間在某三甲醫(yī)院住院的痰細(xì)菌培養(yǎng)陽性的肺炎患者20例，其中大腸桿菌感染性肺炎4 例，肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎8 例，銅綠假單胞菌感染性肺炎8 例。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）年齡18 ～80 歲，性別不限；（2）確診細(xì)菌性肺炎；（3）連續(xù)三次痰細(xì)菌培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)同一種致病菌；（4）無吸煙史，無循環(huán)系統(tǒng)疾病、消化系統(tǒng)疾病、糖尿病、腎功能不全等；（5）對(duì)研究知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并其他系統(tǒng)疾??；（2）需要進(jìn)行有創(chuàng)或無創(chuàng)通氣；（3）存在通氣或換氣功能障礙；（4）無法配合正確收集呼出氣體。細(xì)菌組：選取大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、銅綠假單胞菌三種細(xì)菌為研究對(duì)象，這三種細(xì)菌均通過對(duì)上述患者進(jìn)行痰細(xì)菌培養(yǎng)分離得到，對(duì)致病菌進(jìn)行傳代接種，得到單純致病菌株。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材

1.2.1 光聲光譜分析儀（型號(hào)：PASTA- 10001）由中國航天科技集團(tuán)某研究所提供，儀器主要參數(shù)：采樣容積：30 mL；檢測(cè)時(shí)間：30 min；檢測(cè)精密度：PPb 級(jí)；工作適宜溫度：0℃～40 ℃。該儀器測(cè)量結(jié)果的穩(wěn)定性較好，不會(huì)因?yàn)榄h(huán)境溫度和氣壓的變化而產(chǎn)生漂移。

1.2.2 培養(yǎng)儀器 Tedlar 氣體采樣袋（圖1）及外接一次性吹嘴，購于大連德霖氣體包裝有限公司。Tedlar氣體采樣袋容量為300 mL，反復(fù)利用時(shí)需用純氧氣進(jìn)行反復(fù)充氣和抽氣，并在60 ℃條件下老化4 h（經(jīng)過老化后的采樣袋能有效降低背景值，可以再次使用）。增菌培養(yǎng)基（哥倫比亞型）購于賽默飛世爾生物化學(xué)制品（北京）有限公司。雙通道玻璃氣密樣品取樣瓶為實(shí)驗(yàn)小組自行設(shè)計(jì)制作（圖2）。恒溫恒濕培養(yǎng)箱由北京中西遠(yuǎn)大科技有限公司提供，產(chǎn)品參數(shù)：型號(hào)：TH70-HWS-350；控溫范圍：5℃～50 ℃；溫度波動(dòng)度：±0.5 ℃。

圖1 Tedlar 氣體采樣袋

圖2 雙通道玻璃氣密樣品取樣瓶

1.3 方法

1.3.1 氣體收集 （1）肺炎組呼出氣收集：①Tedlar采樣袋第一次使用時(shí)用蒸餾水清洗，烘干，去除殘留物，以后重復(fù)使用時(shí)用純氧氣進(jìn)行反復(fù)充氣和抽氣3次，以置換殘留氣體，備用。②受試者晨起空腹安靜狀態(tài)，在通風(fēng)良好的室內(nèi)平靜呼吸0.5 h，用清水進(jìn)行口腔清潔后待測(cè)。③連接一次性吹嘴，打開夾子，囑患者向Tedlar 采樣袋中吹氣，反復(fù)呼吸數(shù)次，盡量使袋內(nèi)氣體接近肺泡氣體濃度。④關(guān)閉夾子，10 min內(nèi)連接光聲光譜儀進(jìn)行檢測(cè)。（2）細(xì)菌頂空氣體收集：將三種目標(biāo)細(xì)菌接種到增菌培養(yǎng)基（哥倫比亞型）平板中，將培養(yǎng)基放至雙通道玻璃氣密樣品取樣瓶中，放于35 ℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 得到細(xì)菌頂空氣體。

1.3.2 氣體光聲光譜檢測(cè) 肺炎組：將收集好呼出氣且處于夾閉狀態(tài)的Tedlar 氣體采樣袋的出口端用橡膠管與PASTA1001 進(jìn)氣閥管連接，然后運(yùn)行機(jī)器抽氣1 min，形成管道負(fù)壓（此時(shí)池壓為233 mBar）。打開橡膠管抽氣，當(dāng)儀器顯示壓力平衡后運(yùn)行機(jī)器，開始檢測(cè)，分別獲得初始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和初始光譜曲線（橫坐標(biāo)X 值表示波數(shù)，單位為cm-1，縱坐標(biāo)Y 值表示幅值，單位為au），本研究選擇檢測(cè)波數(shù)范圍為1000 ～1250 cm-1，因?yàn)榇瞬〝?shù)段可涵蓋絕大部分的VOCs 和部分無機(jī)揮發(fā)性化合物，且幅值與所測(cè)揮發(fā)性化合物的濃度成正比。細(xì)菌組：將取樣瓶上端的橡膠管（止血鉗夾閉狀態(tài)）與光聲光譜分析儀的進(jìn)氣閥連接，打開進(jìn)氣口橡膠管上的止血鉗，對(duì)取樣瓶中的頂空氣體進(jìn)行抽氣檢測(cè)，獲得初始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。重復(fù)上述方法檢測(cè)其他取樣瓶中的氣體實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1.4 數(shù)據(jù)分析

本實(shí)驗(yàn)采用Originpro 8.5 繪圖軟件對(duì)初始實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，合成光聲光譜圖（X 值表示波數(shù)cm-1，Y 值表示幅值au），選擇檢測(cè)的波數(shù)范圍為1000 ～1250 cm-1，因?yàn)榇瞬〝?shù)段可涵蓋絕大部分的VOCs 和部分無機(jī)揮發(fā)性化合物，其中幅值與所測(cè)揮發(fā)性化合物的濃度成正比。

2 結(jié)果

2.1 大腸桿菌培養(yǎng)頂空氣體（細(xì)菌培養(yǎng)大腸）與大腸桿菌感染性肺炎（大腸）患者呼出氣的光聲光譜檢測(cè)結(jié)果

如圖3 所示，在增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 的大腸桿菌頂空氣體的光聲光譜檢測(cè)結(jié)果顯示：1236 ～1238波 數(shù) 段、1228 ～1232 波 數(shù) 段、1120 ～1126 波 數(shù)段：大腸桿菌頂空氣體均出現(xiàn)了與大腸桿菌感染性肺炎患者相似的波峰。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌培養(yǎng)頂空氣體的光聲光譜結(jié)果在1120 ～1126 波數(shù)段的波峰與大腸桿菌感染性肺炎患者呼出氣產(chǎn)生的波峰形態(tài)不完全相同，似乎右側(cè)又有一個(gè)小峰，使該峰變成雙峰，但可能因濃度較低，不能完全形成波峰。另外，大腸桿菌細(xì)菌培養(yǎng)頂空氣體的光聲光譜檢測(cè)結(jié)果在1120 ～1126 波數(shù)段呈現(xiàn)的波峰形態(tài)相同，但患者呼出氣檢測(cè)結(jié)果卻呈現(xiàn)出多樣化改變。

圖3 大腸桿菌感染性肺炎患者呼出氣與相應(yīng)細(xì)菌培養(yǎng)頂空氣體檢測(cè)結(jié)果的比較

2.2 肺炎克雷伯桿菌頂空氣體與肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者呼出氣的光聲光譜檢測(cè)結(jié)果

如圖4 所示，在增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 的肺炎克雷伯桿菌頂空氣體的光聲光譜檢測(cè)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：（1）1240 ～1242 波數(shù)段：出現(xiàn)與肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者呼出氣中相似的波峰，但波峰不明顯，幅度存在差異；（2）1236 ～1238 波數(shù)段：并未出現(xiàn)與肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者呼出氣相應(yīng)的波峰。另外，我們發(fā)現(xiàn)肺炎克雷伯桿菌細(xì)菌培養(yǎng)所得到的頂空氣體光聲光譜檢測(cè)結(jié)果中在1240 ～1242 波數(shù)段產(chǎn)生的波峰均較平坦，而肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者的呼出氣在此波數(shù)段產(chǎn)生的波峰較尖銳，相似但不完全相同。

圖4 肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者呼出氣與相應(yīng)細(xì)菌培養(yǎng)頂空氣體檢測(cè)結(jié)果的比較

2.3 銅綠假單胞菌頂空氣體與銅綠假單胞菌感染性肺炎患者呼出氣的光聲光譜檢測(cè)結(jié)果

如圖5 所示，在增菌培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h 的銅綠假單胞菌頂空氣體的光聲光譜檢測(cè)譜線中發(fā)現(xiàn)：（1）1214 ～1216 波數(shù)段：并未出現(xiàn)與銅綠假單胞菌感染性肺炎患者相似的波峰，曲線較平坦；（2）1228 ～1232 波數(shù)段：出現(xiàn)了與銅綠假單胞菌感染性肺炎患者相似的波峰。

圖5 銅綠假單胞菌感染性肺炎患者呼出氣與相應(yīng)細(xì)菌培養(yǎng)頂空氣體檢測(cè)結(jié)果的比較

3 討論

臨床實(shí)踐中對(duì)于下呼吸道感染的患者，尤其是急危重癥患者，及早明確感染的病原菌極其重要，可影響患者的救治時(shí)機(jī)，甚至?xí)苯佑绊懟颊叩念A(yù)后和病死率。另外，隨著臨床抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，感染性疾病患者中耐藥菌株的種類和數(shù)量逐年增加。因此，準(zhǔn)確檢測(cè)病原微生物有助于臨床制定精準(zhǔn)的治療方案，防止抗生素的濫用，同時(shí)也減低了患者的平均住院時(shí)間和平均住院費(fèi)用，減輕了患者家庭的負(fù)擔(dān)。目前，臨床上常用的檢測(cè)病原菌的方法有微生物分離培養(yǎng)、抗原檢測(cè)、血清學(xué)抗體檢測(cè)、常規(guī)病原學(xué)核酸檢測(cè)等。其中微生物分離培養(yǎng)被認(rèn)為是病原學(xué)檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但培養(yǎng)時(shí)間長，周期通常在2 ～14 d 左右，最長可達(dá)21 d，易影響患者的及時(shí)救治。另外，微生物分離培養(yǎng)的條件要求高、易失敗、混雜因素多，且敏感性較低，并不利于疾病的早期診斷?？乖瓩z測(cè)是通過檢測(cè)病原體表面的糖蛋白抗原物質(zhì)來判斷機(jī)體感染何種病原體，可用于早期的快速病原診斷。但抗原檢測(cè)易受到采樣限制，病原體濃度低時(shí)，敏感度相對(duì)較差，且檢測(cè)陰性并不能排除感染。抗體檢測(cè)因免疫窗口期較長，不能用于急性感染的病原學(xué)診斷。常規(guī)病原學(xué)核酸檢測(cè)的敏感度和特異性高，不受抗菌藥物應(yīng)用的影響，無免疫窗口期，但因氣溶膠污染可能造成假陽性，部分病毒陽性不能確定現(xiàn)癥感染的問題。因此，針對(duì)下呼吸道感染，探索一種無創(chuàng)、準(zhǔn)確率高、及時(shí)快速、敏感度高、符合臨床實(shí)際的快速病原學(xué)檢測(cè)方法非常必要。近年來，VOCs 檢測(cè)技術(shù)的蓬勃發(fā)展，無疑為解決這個(gè)問題指明了新的方向。

在醫(yī)療領(lǐng)域，人體呼出氣中的多種氣體都可以作為醫(yī)療診斷的生物標(biāo)志物[6]。如呼出氣一氧化氮檢測(cè)被臨床呼吸科廣泛應(yīng)用于檢測(cè)氣道炎癥的性質(zhì)和程度，協(xié)助支氣管哮喘的診治，評(píng)估肺癌患者的氣道炎癥等，已然是一種極為成熟的檢測(cè)技術(shù)。目前，檢測(cè)VOCs 的方法主要有氣相色譜法、質(zhì)譜法、光譜吸收檢測(cè)法、傳感器或電子鼻法以及PAS 等[7]。氣相色譜法的設(shè)備復(fù)雜、體積較大且價(jià)格昂貴，很難用于現(xiàn)場(chǎng)測(cè)量。質(zhì)譜法對(duì)于不能氣化時(shí)發(fā)生分解的化合物不適用。光譜吸收檢測(cè)方法是基于氣體對(duì)特定波長光的吸收，通過吸收光譜和光強(qiáng)度的變化來判斷氣體的濃度，易受到光散射的影響。電子鼻是一種能夠模擬動(dòng)物嗅覺的電子裝置，由三大功能部件組成，分別是氣體采樣器、氣體傳感器陣列和模式識(shí)別系統(tǒng)。其工作原理是進(jìn)入電子鼻的氣體樣品與傳感器發(fā)生可逆的物理、化學(xué)反應(yīng)，產(chǎn)生電信號(hào)，電信號(hào)通過放大、數(shù)字轉(zhuǎn)換進(jìn)入信號(hào)處理系統(tǒng)和模式識(shí)別系統(tǒng)，完成對(duì)氣體樣品的檢測(cè)。目前，關(guān)于上述檢測(cè)方法的研究均存在著樣本量小、檢測(cè)方法復(fù)雜、可重復(fù)性差、檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)和方法不統(tǒng)一、對(duì)操作人員要求高等不足，因此，離實(shí)際臨床應(yīng)用尚有較大距離。PAS 是通過測(cè)量光聲效應(yīng)產(chǎn)生的聲波信號(hào)，而不是采用直接測(cè)量光強(qiáng)度的變化來達(dá)到對(duì)氣體檢測(cè)的目的，其檢測(cè)結(jié)果與光的散射和透射無關(guān)。因此，PAS 是一種無背景信號(hào)干擾的間接測(cè)量方法，具有靈敏度和選擇性高、容易實(shí)現(xiàn)多氣體檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，使得該技術(shù)在多組分氣體檢測(cè)方面具有十分廣闊的應(yīng)用前景。

氣相色譜法的檢測(cè)模式是必須事先明確目標(biāo)氣體成分，之后再檢測(cè)該氣體是否存在，所以采用的是“逆推”模式。傳感器和電子鼻法則是先通過氣味傳感器對(duì)目標(biāo)氣體進(jìn)行初步識(shí)別，之后再對(duì)整體氣體混合物的生物揮發(fā)性特征進(jìn)行檢測(cè)判斷，而后以某種相似的屬性進(jìn)行重新組合排列，進(jìn)而區(qū)別氣體成分，也就是說采用的是“順比較法”模式。本研究所采用的PAS既可以通過“順比較法”，根據(jù)不同細(xì)菌揮發(fā)性有機(jī)化合物所形成的光聲光譜圖之間的差異來辨別病原菌，又可以通過“逆推”模式，進(jìn)一步驗(yàn)證目標(biāo)氣體是否存在[8]。因此，可大大提升靈敏度，且該方法操作簡單、快速、無創(chuàng)且成本低，1 h 左右即可做出準(zhǔn)確的診斷，無疑給醫(yī)生的臨床決策提供了快速、精準(zhǔn)的技術(shù)支持。這也是該方法在病原學(xué)檢測(cè)中的優(yōu)勢(shì)所在。用PAS 檢測(cè)VOCs 為病原菌的鑒定提供了一種簡單、快速的方法，有望成為臨床早期病原學(xué)檢測(cè)的新技術(shù)。

本研究通過對(duì)細(xì)菌性肺炎及同種致病菌培養(yǎng)頂空氣體進(jìn)行光聲光譜分析發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌頂空氣體在1120 ～1126 波數(shù)段均出現(xiàn)了與大腸桿菌感染性肺炎患者相似的單峰；肺炎克雷伯桿菌頂空氣體在1240 ～1242 波數(shù)段出現(xiàn)了與肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者呼出氣中相似的波峰；銅綠假單胞菌頂空氣體在1228 ～1232 波數(shù)段也出現(xiàn)了與銅綠假單胞菌感染性肺炎患者相似的波峰。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，大腸桿菌培養(yǎng)氣體的光聲光譜結(jié)果在1120 ～1126 波數(shù)段的波峰與大腸桿菌感染性肺炎患者呼出氣產(chǎn)生的波峰形態(tài)又不完全相同，似乎右側(cè)又有一個(gè)小峰，使該峰變成雙峰，但可能因?yàn)闈舛容^低，不能完全形成波峰。同樣的，肺炎克雷伯桿菌細(xì)菌培養(yǎng)所得的頂空氣體光聲光譜檢測(cè)結(jié)果中在1240 ～1242 波數(shù)段產(chǎn)生的波峰均較平坦，而肺炎克雷伯桿菌感染性肺炎患者在此波數(shù)段產(chǎn)生的波峰較尖銳，二者相似但不完全相同。同一種細(xì)菌培養(yǎng)所得的頂空氣體的光聲光譜檢測(cè)結(jié)果在同一位置出現(xiàn)的波峰相同，但人體感染后的呼出氣在相同位置的波峰卻出現(xiàn)了多樣化，如大腸桿菌感染性肺炎患者的呼出氣在1120 ～1126 波數(shù)段有單峰、有雙峰，體現(xiàn)了人體呼出氣混雜因素的多樣性。這充分印證了人體呼出氣中的VOCs 其成分直接因病理過程（如感染或惡性腫瘤）而發(fā)生改變[3]。可見，人體是一個(gè)復(fù)雜多變的整體，加之呼出氣的混雜因素較多，在細(xì)菌與機(jī)體的相互作用中，細(xì)菌單獨(dú)培養(yǎng)及人體感染后所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物是否有所變化及具體機(jī)制如何，有待于進(jìn)一步研究明確。此外，由于本研究中的樣本量很小，數(shù)據(jù)對(duì)整體的代表性欠佳，且細(xì)菌培養(yǎng)過程中可能出現(xiàn)其他細(xì)菌的污染、細(xì)菌在不同代謝時(shí)間產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物不盡相同等多種混雜因素的存在，均可影響實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。因此，未來我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，完善實(shí)驗(yàn)方法及檢測(cè)技術(shù)，使下一步的實(shí)驗(yàn)更加完善，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加可靠。