劉劍橋，張明媚，劉曉闖，霍星星，姜娟娟，李傳潤*

（1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室，安徽 合肥 230031；2.安徽中醫(yī)藥大學 藥學院，安徽 合肥 230013）

類風濕關節(jié)炎是一種常見的慢性炎癥性自身免疫性疾病，其主要病理特征是滑膜內膜增生，大量成纖維細胞樣滑膜細胞（Fibroblast-like Synoviocytes,FLSs）活化?；罨蟮腇LSs 表現出過度增殖以及凋亡減少的腫瘤樣行為，通過與T 細胞、B 細胞、巨噬細胞以及多種細胞因子相互作用，分泌大量炎癥細胞因子和分解代謝酶，形成持續(xù)的關節(jié)炎癥[1]。在FLSs增生的慢性破壞下，類風濕關節(jié)炎病情逐步加重[2-3]，最終導致關節(jié)破壞，功能喪失[4]。因此，了解FLSs作為類風濕關節(jié)炎病理因素的分子機制對于治療類風濕關節(jié)炎及相關疾病非常重要。佐劑型關節(jié)炎模型因其與人類類風濕關節(jié)炎發(fā)病過程類似，同樣存在被激活的FLSs，并且制備方便、成模率高，被廣泛用作類風濕關節(jié)炎研究的動物模型。

健脾化濕通絡方是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院劉健教授在臨床實踐中，基于新安醫(yī)學“脾虛致痹”“健脾化濕”理念創(chuàng)制的中藥復方，由黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣組成。前期臨床研究表明，健脾化濕通絡方可抑制類風濕關節(jié)炎滑膜成纖維細胞炎癥反應，促進細胞凋亡，發(fā)揮治療作用[5]。本研究首先建立佐劑型關節(jié)炎大鼠模型，通過分離培養(yǎng)佐劑型關節(jié)炎大鼠FLSs，觀察健脾化濕通絡方含藥血清對FLSs 過度增殖的抑制作用和炎癥水平影響，探究健脾化濕通絡方治療類風濕關節(jié)炎的作用機制。

1 材料

1.1 實驗動物

7 ～ 8 周齡SPF 級健康雄性SD 大鼠30 只，體質量為（250±10）g，購自濟南朋悅實驗動物繁育有限公司[許可證號：SCXK（魯）20190003]。標準動物房飼養(yǎng)，室溫為 22 ～24℃，濕度為50%～60%。實驗方案經安徽中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會論證批準（許可證號：AHUCM-Rats-2021005）。

1.2 藥品與試劑

健脾化濕通絡方（組方：黃芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣；飲片由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經水煎后濃縮為含生藥量為1.0 g/mL 的藥液，冷藏保存）。CCK-8 檢測試劑盒（批號：CR2112050）、DMEM 高 糖 培 養(yǎng) 基（批 號：GP21050050710）、D-Hank’s（批 號：GP2006080873）、PBS（批 號：GP20060701001），均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；ELISA 定量檢測試劑盒IL-1β（批號：RX302869R）、IL-10（批號：RX302880R）、IL-4（批號：RX302858R），均購自泉州市睿信生物科技有限公司；胰酶（批號：C0201）、DAPI（批號：C1002）、Cy3 標記山羊抗兔IgG（H + L）（批號：A0516），均購自碧云天生物技術公司；凋亡試劑盒（批號：BB20081，上海貝博生物科技有限公司）；弗氏完全佐劑（批號：C13083712，上海麥克林生化公司）。

1.3 主要儀器

CytoFLEX 型流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特有限公司）；CKX53 型倒置顯微鏡[奧林巴斯（中國）公司]；3111 型細胞培養(yǎng)箱[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；RT6100 型酶聯免疫檢測儀（雷杜生命科學股份有限公司）；JW-10 型離心機（安徽嘉文儀器裝備有限公司）；LIOO XC20 型成像系統[奧林巴斯（中國）公司]。

2 方法

2.1 模型組大鼠模型建立

大鼠適應性飼養(yǎng)一周后，隨機分為正常組和模型組，每組10 只。第0 天，模型組大鼠右后足趾皮內注射0.1 mL 弗氏完全佐劑，正常組大鼠注入液體石蠟。第8 天起每3 天測量左后足趾腫脹度（mL）。第20 天3%戊巴比妥鈉（30 mg/kg）腹腔麻醉大鼠，分離膝關節(jié)，多聚甲醛固定。于超凈臺中分離大鼠滑膜組織，分離培養(yǎng)原代FLSs。

2.2 膝關節(jié)組織HE 染色觀察

將經過多聚甲醛固定的膝關節(jié)組織進行脫鈣；乙醇脫水，二甲苯透化；石蠟包埋切片，66℃ 烤片20 ～30 min；依次二甲苯、乙醇脫蠟；蘇木素浸染2 ～ 5 min，1%鹽酸酒精分化后伊紅染液浸染；依次過苯酚-二甲苯、二甲苯I、II 透明；中性樹膠封片，顯微鏡觀察結果。

2.3 含藥血清制備

健脾化濕通絡方經體表面積比值折算以相當于人臨床等效用量0.324 mg/g 為基礎給藥劑量，大鼠以10倍劑量灌胃3.24 mg/g，每日2 次，連續(xù)給藥3 d，末次給藥1 h 后，腹主動脈取血，3 000 r/min 離心10 min分離血清，56 ℃水浴30 min 滅活，無菌操作分裝，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 原代FLSs 培養(yǎng)與鑒定

分離模型組大鼠膝關節(jié)中滑膜組織；4 ℃預冷的無菌D-Hank’s 液沖洗；2 倍體積Ⅱ型膠原酶，37 ℃消化2 h；將組織塊均勻置于培養(yǎng)瓶，加入1 ～ 2 mL 20%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基；免疫熒光法鑒定FLSs 特定波形蛋白（Vimentin）：破膜，血清室溫封閉20 min，200 μL一抗（1∶200）4 ℃ 過夜孵育；二抗（1∶500）37 ℃避光孵育30 min。200 μL DAPI 染液，室溫避光孵育5 min?？篃晒獯銣绶馄瑒┓馄?，鏡檢拍照。FLSs 在含20%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，5%CO2、37 ℃培養(yǎng)。

2.5 細胞實驗分組

正常組：由正常組大鼠滑膜分離培養(yǎng)的滑膜細胞；模型組：模型組大鼠滑膜中分離培養(yǎng)的FLSs；給藥組：模型組細胞經10%含藥血清干預。

2.6 CCK-8 法評價健脾化濕通絡方含藥血清對FLS增殖能力影響

FLSs 以1×105個/mL 接種于96 孔板，5% CO2、37 ℃孵育過夜，選用前期實驗確定的最佳含藥血清濃度（10%含藥血清）分別干預 0、24、48、72 h 后終止培養(yǎng)，每孔加入10 μL CCK-8，在酶聯免疫檢測儀450 nm 處測量各孔的吸光值（A）。細胞增殖率 =（A實驗組-A空白組）/（A對照組-A空白組）×100%。

2.7 流式細胞術檢測健脾化濕通絡方含藥血清對FLSs 凋亡影響

胰酶消化貼壁FLSs，收集0.5 ～ 1×106個細胞，1 500 r/min 離心3 min，棄上清。PBS 清洗2 次，按凋亡試劑盒說明書操作。用FlowJo VX 軟件對流式細胞凋亡的圖像進行分析，凋亡細胞數 = Q2 + Q3。

2.8 炎癥因子水平檢測

采用ELISA 方法，取FLSs 培養(yǎng)上清液，嚴格按照各試劑盒說明書進行操作，檢測IL -1β、IL-4、IL-10 水平。

2.9 統計學方法

用SPSS 24.0 軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

3 實驗結果

3.1 佐劑型關節(jié)炎大鼠模型建立

從造模第8 天模型組大鼠足趾腫脹度明顯高于正常組（P＜ 0.01），并且在造模期間始終維持高腫脹度，見圖1。

圖1 模型足趾腫脹度（±s，n = 10）Fig.1 Swelling degree of toe in model（±s，n = 10）

光鏡觀察大鼠膝關節(jié)HE 切片，正常組大鼠關節(jié)腔內可見滑膜組織為2 ～ 3 層滑膜細胞組成，光潔平整，無增生和血管翳；模型組大鼠關節(jié)腔內可見滑膜細胞過度增生，滑膜組織乳頭狀突起，褶皺，血管翳明顯增多，見圖2。綜上表明佐劑型關節(jié)炎大鼠模型成功建立，可用于后續(xù)實驗。

圖2 HE 病理（×200）Fig.2 Pathological of HE（×200）

3.2 FLSs 分離培養(yǎng)及鑒定

原代滑膜細胞培養(yǎng)7 d 后，滑膜組織基本消失，大量滑膜細胞游離，呈卵圓形、梭形。經過三次傳代，通過免疫熒光法檢測波形蛋白（Vimentin）鑒定FLSs，波形蛋白表達陽性，呈梭形，細胞核清晰，呈橢圓形，位于細胞中央。波形蛋白的存在表明分離培養(yǎng)的細胞為FLSs，可用于后續(xù)實驗，見圖3。

圖3 FLSs 鑒定（×400）Fig.3 Identification of FLSs（×400）

3.3 健脾化濕通絡方含藥血清對FLSs 增殖影響

與正常組相比，模型組12、24、48、72 h 細胞增殖率均明顯上升（P＜0.01）；與模型組相比，給藥組細胞增殖率明顯下降（P＜0.05），給藥時間的延長增強了含藥血清對FLSs 的抑制增殖作用，在10%含藥血清干預72 h時FLSs的增殖率最低，見圖4。

圖4 健脾化濕通絡方含藥血清對FLSs 增殖影響（±s，n = 3）Fig.4 The effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum on the proliferation of FLSs cells（±s，n = 3）

3.4 健脾化濕通絡方含藥血清對FLSs 凋亡的影響

流式細胞術檢測凋亡細胞結果見圖5、圖6，模型組與正常組相比，模型組凋亡細胞明顯減少（P＜0.01）；給藥組和模型組比較，給藥組凋亡細胞明顯增加（P＜0.01）。

圖5 流式細胞術檢測健脾化濕通絡方含藥血清對FLSs 凋亡的影響（±s，n = 3）Fig.5 Effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum on apoptosis of FLSs by flow cytometry（±s，n = 3）

圖6 健脾化濕通絡方含藥血清對FLSs 凋亡的影響（±s，n = 3）Fig.6 The effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum medicated serum on the apoptosis of FLSs（±s，n = 3）

3.5 健脾化濕通絡方含藥血清對FLSs 中IL-1β、IL-10 、IL-4 表達的影響

ELISA 結果顯示，模型組與正常組相比，模型組IL-1β、IL-4 的表達水平明顯升高（P＜0.01），IL-10 的表達水平明顯下降（P＜0.05）；健脾化濕通絡方含藥血清干預后，給藥組與模型組相比，IL-1β、IL-4 表達水平明顯下降（P＜0.01，P＜0.05），IL-10 表達水平明顯上升（P＜0.01），見圖7。

圖7 健脾化濕通絡方含藥血清對FLSs 細胞因子表達的影響（±s，n = 3）Fig.7 The effect of Jianpi Huashi Tongluo Formula-containing serum on the expression of FLS cytokines（±s，n = 3）

4 討論

FLSs 在慢性炎癥環(huán)境下激活導致滑膜組織增生與滑膜炎癥，是類風濕關節(jié)炎重要的病理特征。本研究在佐劑型關節(jié)炎大鼠中發(fā)現FLSs 激活，表現出過度增殖、凋亡減少，炎癥相關細胞因子異常表達，HE 觀察到大鼠軟骨表面粗糙破壞，滑膜血管翳明顯增多，滑膜組織乳頭狀增生，這與類風濕關節(jié)炎病理特征一致。

IL-1β、IL-4 和 IL-10 等細胞因子的異常表達，形成了FLSs 激活需要的慢性炎癥環(huán)境。這些細胞因子在免疫應答過程中由免疫細胞分泌，在促進炎癥、抑制炎癥和細胞生長等方面起到重要作用。IL-1β是重要的促炎因子，由類風濕關節(jié)炎患者關節(jié)滑膜液中巨噬細胞分泌，在滑膜液中高表達[6]，本研究在模型組中檢測到IL-1β 的明顯高表達，給藥組干預后表達明顯降低。IL-4 和IL-10 具有抑炎作用，可抑制T 細胞、單核巨噬細胞分泌炎性細胞因子TNF-α、IL-1、IL-17 以及多種趨化因子，在類風濕關節(jié)炎中起到抑制炎癥作用[7-9]，本研究中模型組中IL-4 表達升高，可能與疾病活動時IL-4 的負反饋調節(jié)有關，含藥血清干預后IL-4 表達降低與治療后炎癥水平下降趨勢一致；健脾化濕通絡方含藥血清可以顯著提高模型組IL-10 表達，發(fā)揮抗炎作用。綜上所述，降低IL-1β 表達，增強IL-10 表達是健脾化濕通絡方治療類風濕關節(jié)炎的作用機制之一。

臨床研究顯示，健脾化濕通絡方通過改善類風濕關節(jié)炎患者關節(jié)疼痛和炎癥反應，明顯提高類風濕關節(jié)炎患者的生活質量[10]；健脾化濕通絡方通過調節(jié)信號通路影響促炎細胞因子的表達，促進成纖維細胞樣滑膜細胞凋亡[11-12]。健脾化濕通絡方的有效成分研究中，臣藥雷公藤中Macroregelines 成分對類風濕關節(jié)炎病人滑膜細胞有明顯的抗增殖作用；蜈蚣中的多肽可以通過調節(jié)T 淋巴細胞減輕炎癥和關節(jié)損傷[13-14]。這些研究共同證明了健脾化濕通絡方通過抑制FLSs發(fā)揮抗類風濕關節(jié)炎作用。

5 結論

本研究從FLSs 的過度增殖這一類風濕關節(jié)炎的主要病理表現角度探討了健脾化濕通絡方在動物模型中作用的可能機制。通過檢測FLSs 在健脾化濕通絡方干預后凋亡水平和炎癥因子水平變化，確定抑制FLSs 的過度增殖，降低炎癥因子表達是健脾化濕通絡方治療佐劑型關節(jié)炎的一種可能機制。但作為體外實驗，本實驗結果具有一定的局限性，有待于通過體內實驗進一步驗證。