朱敏杰,何 琦,苗盈盈 （邯鄲市中心醫(yī)院腎內(nèi)二科，河北 邯鄲 056002）

膿毒癥由感染后機(jī)體免疫系統(tǒng)的異常反應(yīng)引起，是一種全身性炎癥反應(yīng)綜合征，嚴(yán)重時(shí)可引起多器官功能障礙，如多器官衰竭。盡管抗生素治療和生命支持等取得了巨大進(jìn)展，但膿毒癥患者的病死率仍在25%以上，并且其發(fā)病率不斷增加[1]。膿毒癥是危重病患者發(fā)生急性腎損傷的重要原因，占ICU中急性腎損傷的50%以上，具有較高的院內(nèi)病死率[2]。在美國(guó)7個(gè)州的192 980例嚴(yán)重?cái)⊙Y患者中，有22%的患者發(fā)生急性腎損傷，病死率為38.2%[3]。膿毒癥致急性腎損傷對(duì)人們的健康造成了巨大威脅，了解其發(fā)病機(jī)制對(duì)于開發(fā)新的治療策略至關(guān)重要。NOD樣受體家族熱蛋白結(jié)構(gòu)域相關(guān)蛋白3（NOD-like receptor thermal protein domain associated protein 3，NLRP3）是一種胞質(zhì)傳感器，由中心NACHT結(jié)構(gòu)域、C末端LRRs和N末端pyrin結(jié)構(gòu)域組成[4]。研究表明，抑制NLRP3炎性小體活化可抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠炎癥反應(yīng)和腎損傷標(biāo)志物中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（neutrophil gelatinase-associated lipocalin，NGAL）和腎損傷分子-1（kidney injury molecule-1，KIM-1）的表達(dá)[5]。NLRP3的激活導(dǎo)致Caspase-1成熟介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，并調(diào)節(jié)IL-1β和IL-18等促炎細(xì)胞因子的分裂和成熟[6]。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性小體參與急性腎損傷的進(jìn)展[7]，但其在膿毒癥致急性腎損傷中的作用及機(jī)制尚未明確。半乳糖結(jié)合蛋白Galectin-3是一種β-半乳糖苷酶家族蛋白，其在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、黏附和凋亡等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要的作用。Galectin-3過(guò)表達(dá)可促進(jìn)腎細(xì)胞凋亡和I型膠原蛋白合成，導(dǎo)致炎癥和纖維化[8]。而NLRP3激活后會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激，導(dǎo)致Galectin-3的表達(dá)增加[9]，提示NLRP3可能通過(guò)Galectin-3引發(fā)腎損傷?；诖?，本研究以細(xì)胞焦亡和Galectin-3為切入點(diǎn)探討NLRP3炎性小體對(duì)膿毒癥致急性腎損傷的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

NLRP3抑制劑MCC950購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；Caspase-1抑制劑Ac-YVAD-CMK購(gòu)自美國(guó)Glpbio公司；尿素氮、血肌酐、NGAL、IL-1β和IL-18檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白（apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD，ASC)和 Galectin-3抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；Caspase-1、KIM-1和焦亡相關(guān)蛋白消皮素D（Gasdermin D，GSDMD）抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；GAPDH抗體購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；糖原PAS染色液試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；Multiskan FC酶標(biāo)檢測(cè)儀（型號(hào)Accessory-Lamp 6V/10W）購(gòu)自上海賽默飛世爾科技有限公司；垂直電泳轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（型號(hào)1658033）購(gòu)自美國(guó)Biorad公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康SPF級(jí)雄性SD大鼠40只，8周齡，體質(zhì)量（210±10）g，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（冀）2020-001，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（冀）2020-002。大鼠飼養(yǎng)于溫度（22±2）℃、12 h/12 h明暗交替的環(huán)境，自由飲水和飲食。本研究經(jīng)我院動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)（HDCH20210317）。

1.3 分組及造模

將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、MCC950組和Ac-YVAD-CMK組，每組10只。對(duì)照組大鼠僅探查盲腸，不進(jìn)行結(jié)扎或穿透。采用盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)[10]建立膿毒癥大鼠模型：腹腔注射1%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，暴露并結(jié)扎盲腸，針頭穿透游離端2次，將腸管歸位并逐層縫合腹腔。造模結(jié)束后，MCC950組大鼠腹腔注射MCC950 10 mg/kg[11]，Ac-YVAD-CMK組大鼠腹腔注射Ac-YVAD-CMK 5 mg/kg[12]。24 h后，眼眶采血并處死大鼠，取出腎組織。

1.4 尿素氮、肌酐、NGAL含量檢測(cè)

取各組大鼠血液，室溫下1 000 g離心10 min后收集血清，根據(jù)尿素氮試劑盒（脲酶法）、肌酐試劑盒（肌氨酸氧化酶法）和NGAL試劑盒（乳膠增強(qiáng)免疫透射比濁法）進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)定各樣品在450 nm波長(zhǎng)處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算尿素氮、肌酐和NGAL的含量。

1.5 Western blot檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)

將各組大鼠腎組織剪碎，RIPA裂解液裂解組織，在4 ℃下12 000 g離心10 min后取上清，BCA法測(cè)定蛋白濃度。取20 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜上（250 mA，50 min）。10%脫脂奶粉封閉，隨后加入 KIM-1（1:1 000）、NLRP3（1:2 000）、ASC（1:1 000）、Caspase-1（1:1 000）、GSDMD（1:1 000）、Galectin-3（1:1 000）和GAPDH（1:5 000）一抗，4 ℃下孵育過(guò)夜。加入HRP標(biāo)記的二抗（1:5 000），室溫孵育1 h后，滴加BeyoECL Star工作液到膜上，化學(xué)發(fā)光成像儀檢測(cè)。

1.6 HE染色觀察腎組織病理學(xué)改變

大鼠腎組織用4%多聚甲醛固定72 h，梯度酒精脫水，二甲苯透明。石蠟包埋、切片，常規(guī)二甲苯、酒精脫蠟至水，蘇木素染色10 min，0.7%鹽酸酒精分化，流水清洗后，伊紅液浸染3 min。梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。切片于光學(xué)顯微鏡下放大觀察分析。由3位腎病理專家分別對(duì)切片進(jìn)行組織病理學(xué)損傷評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

表1 腎組織病理學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[13]

1.7 PAS染色觀察腎小管損傷情況

制備大鼠腎組織石蠟切片，然后常規(guī)脫蠟至水，高錳酸酒精溶液反應(yīng)10 min，70%酒精清洗后，加入還原液1 min，70%酒精清洗后，加入無(wú)色堿性品紅溶液1 h。流水沖洗后蘇木素復(fù)染5 min，1%鹽酸酒精分化；流水沖洗，脫水，透明，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。用Image J軟件進(jìn)行糖原沉積相對(duì)定量。

1.8 IL-1β和IL-18的檢測(cè)

取各組大鼠血液，1 000 g離心10 min后收集血清，根據(jù)IL-1β和IL-18 ELISA檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行檢測(cè)，酶標(biāo)儀測(cè)定各樣品在450 nm波長(zhǎng)處的OD值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算IL-1β和IL-18含量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x-±s)表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進(jìn)一步組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MCC950和Ac-YVAD-CMK改善膿毒癥致急性腎損傷大鼠腎功能

與對(duì)照組相比，模型組大鼠尿素氮、肌酐、NGAL和KIM-1表達(dá)均顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，MCC950組和Ac-YVAD-CMK組大鼠尿素氮、肌酐、NGAL和KIM-1表達(dá)均顯著降低（P<0.05），見圖1。

圖1 MCC950和Ac-YVAD-CMK對(duì)膿毒癥急性腎損傷大鼠腎功能的影響

2.2 MCC950和Ac-YVAD-CMK改善大鼠腎組織病理學(xué)損傷

HE染色顯示，對(duì)照組大鼠腎組織結(jié)構(gòu)正常；與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎小球肥大伴腎小球間隙擴(kuò)大，有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，腎小管上皮細(xì)胞胞漿空泡化，腎組織病理學(xué)評(píng)分顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，MCC950組和Ac-YVAD-CMK組大鼠腎組織病理學(xué)損傷得到明顯改善，腎組織病理學(xué)評(píng)分顯著降低（P<0.05），見圖2。

圖2 HE染色觀察大鼠腎組織病理學(xué)變化

PAS染色顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠腎組織糖原沉積水平顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，MCC950組和Ac-YVAD-CMK組大鼠腎組織糖原沉積水平顯著降低（P<0.05），見圖3。

圖3 PAS檢測(cè)大鼠腎組織糖原沉積水平

2.3 MCC950和Ac-YVAD-CMK抑制NLRP3/Caspase-1通路蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組NLRP3、ASC和Caspase-1表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，MCC950組大鼠NLRP3和Caspase-1表達(dá)顯著降低（P<0.05），Ac-YVAD-CMK組大鼠Caspase-1表達(dá)顯著降低（P<0.05），MCC950組和Ac-YVAD-CMK組ASC表達(dá)無(wú)顯著差異（P>0.05），見圖4。

2.4 MCC950和Ac-YVAD-CMK抑制大鼠細(xì)胞焦亡和炎癥反應(yīng)

Western blot和ELISA結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠GSDMD蛋白表達(dá)、IL-1β和IL-18含量顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，MCC950組和Ac-YVAD-CMK組大鼠GSDMD蛋白表達(dá)、IL-1β和IL-18含量顯著降低（P<0.05），見圖5。

2.5 MCC950和Ac-YVAD-CMK抑制Galectin-3蛋白表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠Galectin-3蛋白表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與模型組相比，MCC950組和Ac-YVAD-CMK組大鼠Galectin-3蛋白表達(dá)顯著降低（P<0.05），見圖6。

圖6 Western blot 檢測(cè)大鼠Galectin-3表達(dá)

3 討論

腎常駐單核細(xì)胞和實(shí)質(zhì)細(xì)胞的激活取決于炎癥依賴性NLRP3，而這種激活與各種腎疾病中的無(wú)菌性炎癥和慢性炎癥密切相關(guān)。因此，炎癥依賴性NLRP3的激活在腎疾病的進(jìn)展中具有重要作用。當(dāng)NLRP3被激活時(shí)，傳感器蛋白寡聚并招募銜接蛋白ASC，然后與Caspase-1結(jié)合形成NLRP3炎性小體，隨后介導(dǎo)IL-1β和IL-18等促炎細(xì)胞因子的成熟和分泌[14]。研究表明，造影劑致腎巨噬細(xì)胞中NLRP3炎性小體活化，而敲除NLRP3的小鼠腎上皮細(xì)胞損傷和炎癥減輕，造影劑導(dǎo)致的急性腎損傷得到改善[15]。本研究結(jié)果表明，膿毒癥致急性腎損傷大鼠NLRP3、ASC和Caspase-1蛋白表達(dá)上調(diào)，說(shuō)明膿毒癥致急性腎損傷大鼠NLRP3炎性小體被激活；NLRP3抑制劑MCC950和Caspase-1抑制劑Ac-YVAD-CMK干預(yù)后，大鼠尿素氮、肌酐、NGAL和KIM-1等腎損傷相關(guān)指標(biāo)表達(dá)均明顯下調(diào)，腎組織病理學(xué)損傷得到明顯改善，血清IL-1β和IL-18含量明顯下調(diào)。這說(shuō)明抑制NLRP3炎性小體的激活可改善膿毒癥大鼠急性腎損傷，減輕炎癥。

細(xì)胞焦亡被認(rèn)為是炎癥性Caspase-1依賴的程序性細(xì)胞死亡，與炎性小體的激活密切相關(guān)。Caspase-1可切割非活性IL-1β和IL-18前體，將其轉(zhuǎn)化為具有活性的炎癥因子，導(dǎo)致細(xì)胞焦亡[16]。小鼠心肌梗死后，NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路被激活，而抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β通路后，小鼠心肌損傷得到明顯改善[17]。此外，Caspase-1可以裂解GSDMD產(chǎn)生N末端裂解產(chǎn)物，該產(chǎn)物進(jìn)一步形成質(zhì)膜孔引起細(xì)胞焦亡[18]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥致急性腎損傷大鼠腎GSDMD表達(dá)及血清IL-1β、IL-18含量較對(duì)照組大鼠明顯上調(diào)，而使用MCC950和Ac-YVAD-CMK后，大鼠GSDMD表達(dá)、IL-1β和IL-18含量明顯下調(diào)，說(shuō)明激活NLRP3/Caspase-1通路可能通過(guò)促進(jìn)膿毒癥大鼠細(xì)胞焦亡，加重急性腎損傷。

Galectin-3是一種β-半乳糖苷結(jié)合凝集素，在腎纖維化和腎功能衰竭中起重要作用，是腎損傷進(jìn)展的關(guān)鍵因子之一。研究表明，改性柑桔果膠抑制Galectin-3表達(dá)后，可明顯改善順鉑誘導(dǎo)的急性腎損傷[19]。急性缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷刺激了腎和心臟組織中Galectin-3的表達(dá)，敲低Galectin-3可抑制炎癥反應(yīng)，改善心肌損傷和功能障礙[17]。已有研究表明，可通過(guò)上調(diào)NLRP3/Caspase-1通路中Galectin-3的表達(dá)，促進(jìn)糖尿病兔心房顫動(dòng)和結(jié)構(gòu)重塑[20]。本研究結(jié)果顯示，膿毒癥致急性腎損傷大鼠腎組織中Galectin-3表達(dá)明顯上調(diào)，而使用MCC950和Ac-YVAD-CMK后，大鼠腎組織中Galectin-3表達(dá)明顯下調(diào)。說(shuō)明激活NLRP3/Caspase-1通路可能通過(guò)上調(diào)Galectin-3的表達(dá)，加重膿毒癥大鼠急性腎損傷。

綜上所述，NLRP3炎性小體通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞焦亡和上調(diào)Galectin-3的表達(dá)促進(jìn)膿毒癥大鼠急性腎損傷。本研究為明確膿毒癥致急性腎損傷的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供了新的研究方向。但本研究并未深入探討NLRP3炎性小體/Galectin-3軸促進(jìn)膿毒癥急性腎損傷的具體機(jī)制，有待后續(xù)進(jìn)一步研究。