劉俊清,金曉雪,宋科稷,賈 芳,張建峰

(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,秸稈綜合利用與黑土地保護(hù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,吉林 長春 130118)

磷作為一種營養(yǎng)元素,不僅在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用,同時(shí)還是維持植物進(jìn)行新陳代謝(如細(xì)胞分裂、大分子生物合成、信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)率及光合作用等)必需的營養(yǎng)源[1].但是,因?yàn)橥寥辣旧淼幕瘜W(xué)固定效應(yīng),土壤中含有的有效無機(jī)磷濃度卻極低.絕大部分有機(jī)磷農(nóng)藥和部分無機(jī)態(tài)磷肥都以難溶性磷酸鹽的形態(tài)出現(xiàn),植株根系無法充分吸收和利用,磷源匱乏成了制約農(nóng)作物產(chǎn)量增長的主要原因之一[2-3].

為了防止農(nóng)作物減產(chǎn)并滿足不斷增長的人口對食物的需求,自20世紀(jì)60年代以來,全世界廣泛使用磷肥,包括磷酸一銨、磷酸二銨、過磷酸鈣和不同配方的NPK(NPK指的是氮、磷、鉀3種元素),以提供額外的磷[4].在農(nóng)業(yè)中過度使用化學(xué)肥料會(huì)帶來許多的環(huán)境問題,如對水、空氣和土壤的污染;同時(shí)由于化學(xué)肥料在農(nóng)作物中以殘留物的形式存在,嚴(yán)重危害著人類的健康[5].為了作物及人類的健康,需要一種替代磷肥的有效性策略,通過環(huán)境生態(tài)方法保持土壤中磷的臨界(最佳)濃度,而不是為了滿足作物需求而過量使用破壞土壤和微生物群落特性的化學(xué)肥料[1].

溶磷微生物是一種有前途的生物菌劑,可替代化肥和農(nóng)藥,可將不溶性磷溶解成可溶形態(tài),并減少農(nóng)田磷肥的投入.解磷菌的種類繁多,與不同的土壤、不同的植物或作物根際等有關(guān),主要有細(xì)菌、真菌和放線菌,在土壤中細(xì)菌的數(shù)量占絕大多數(shù).溶磷微生物大量存在于土壤中,通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),施入土壤的溶磷微生物不僅能提高土壤中有效磷的含量,還可增加速效鉀含量,從而改善土壤肥力,同時(shí),還可提高土壤酶活性[6].溫室和田間試驗(yàn)表明,溶磷菌接種促進(jìn)了土壤中的植物生長,表明它們作為新型生物肥料具有提高土壤肥力的潛力.

筆者從胡枝子根際土壤中篩選出了1株高效溶磷真菌,對其菌種分類進(jìn)行了鑒定,并對其溶磷特性及促生特性進(jìn)行了研究,以期為生物菌劑的制備提供技術(shù)支持,為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供重要的種質(zhì)資源.

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試土壤

土壤樣品主要來自吉林省伊通市胡枝子根際土壤.

1.1.2 培養(yǎng)基制備

1.1.2.1 溶磷培養(yǎng)基(NBRIP)

每升水含有:葡萄糖10 g,(NH4)SO40.5 g,MgSO4·7H2O 0.3 g,NaCl 0.3 g,FeSO4·7H2O 0.03 g,MnSO4·4H2O 0.03 g,KCl 0.3 g,Ca3(PO4)25 g,DdH2O 1 000 mL,固體培養(yǎng)基加入18 g瓊脂粉,pH自然,115 ℃滅菌20 min[7],所用試劑均為分析純試劑.

1.1.2.2 LB培養(yǎng)基

10 g胰蛋白胨,酵母提取物 5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL,pH 7.2～7.4,固體培養(yǎng)基需加入18 g瓊脂粉,121 ℃滅菌20 min[8],所用試劑均為分析純試劑.

1.1.2.3 PDA 固體培養(yǎng)基

土豆200 g,葡萄糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1 000 mL,pH自然[7],所用試劑均為分析純試劑.

1.1.2.4 色氨酸培養(yǎng)基

L-色氨酸0.5 g,胰蛋白胨 10 g,酵母提取物5 g,NaCl 10 g,蒸餾水1 000 mL,所用試劑均為分析純試劑.

1.1.2.5 無氮培養(yǎng)基

葡萄糖10 g,KH2PO40.2 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,CaSO4·2H2O 0.1 g,蒸餾水1 000 mL,所用試劑均為分析純試劑.

1.1.3 供試磷源

磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵,均為分析純試劑.

1.2 溶磷菌的分離、篩選

稱取10 g胡枝子根際土樣加入250 mL錐形瓶并加入90 g水置于搖床震蕩30 min,后靜置10 min,用移液槍吸取1 mL上清至裝有9 mL蒸餾水的試管中稀釋至10-2,并取1 mL至新的裝有9 mL蒸餾水的試管稀釋至10-3,以此類推稀釋至10-4,10-5,10-6,取100 μL不同濃度菌液涂布于溶磷培養(yǎng)基于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱培育5 d.

從7個(gè)不同濃度初篩培養(yǎng)基得到的單個(gè)菌落平板劃線至NBRIP篩選培養(yǎng)基進(jìn)行3次復(fù)篩和純化,篩選出了3株溶磷效果較好的菌株,封存在甘油中,于-80 ℃保藏.

采用鉬銻抗比色法對3株溶磷菌的溶磷量進(jìn)行了測定,解磷量分別為151.21,2 003.95,178.65 mg·L-1,其中X1的解磷量最大,為2 003.95 mg·L-1,說明該菌株對 Ca3(PO4)2有很強(qiáng)的溶解能力,經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后,X1解磷效果仍保持良好,選擇X1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn).

1.3 溶磷菌的鑒定

1.3.1 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

將篩選得到的溶磷菌接種到PDA培養(yǎng)基中,28 ℃培養(yǎng),觀察并記下菌落顏色、大小、形狀、透明度等狀況,從平板上挑出菌絲,采用乳酸石炭酸棉藍(lán)染色法進(jìn)行染色,顯微鏡觀察,對菌株進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)鑒定.

1.3.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

挑選生長良好、穩(wěn)定性強(qiáng)的菌株送至吉林省庫美生物科技有限公司進(jìn)行菌株鑒定.將獲得的DNA序列輸入GenBank,用Blast程序與數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比較分析,并利用MEGA5.1進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建.

1.4 菌株溶磷能力的測定

1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別準(zhǔn)確吸取5 mg·L-1磷(KH2PO4)標(biāo)準(zhǔn)溶液0,2,4,6,8,10 mL于50 mL容量瓶中,同時(shí)加入與顯色測定所用的樣品溶液等體積的空白溶液,加入二硝基酚指示劑2～3滴,并用100 g·L-1碳酸鈉溶液或50 mL·L-1硫酸溶液調(diào)節(jié)至溶液剛呈微黃色,準(zhǔn)確加入5 mL鉬銻抗顯色劑,搖勻,加水定容,即得含磷(P)量分別為0.0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mg·L-1的標(biāo)準(zhǔn)溶液,搖勻,于室溫15 ℃以上放置30 min,在波長700 nm處測定其吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo),磷濃度(mg·L-1)為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[9].

將待測發(fā)酵液(離心后取上清液)適量(第1次做需摸索稀釋倍數(shù))移至50 mL容量瓶中,用水稀釋至總體積約3/5處,加入二硝基酚指示劑1～2滴,并用100 g·L-1氫氧化鈉溶液或50 mL·L-1硫酸溶液調(diào)節(jié)至溶液剛呈微黃色,準(zhǔn)確加入5 mL鉬銻抗顯色劑,搖勻,加水定容,室溫15 ℃以上放置30 min.顯色的樣品溶液在紫外分光光度計(jì)上,以空白培養(yǎng)基為參比液調(diào)節(jié)儀器零點(diǎn),進(jìn)行比色測定,在波長700 nm處測定其吸光度,再從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相應(yīng)的含磷量[10].

1.4.2 溶磷菌對不同磷源的溶磷動(dòng)態(tài)分析

將保存的菌種在PDA培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),在培養(yǎng)箱中28 ℃培養(yǎng)72 h后用蒸餾水沖洗,制成孢子懸液(1×108CFU·mL-1),備用.

分別將50 mL NBRIP培養(yǎng)基倒入150 mL錐形瓶中(每個(gè)錐形瓶單獨(dú)稱量磷酸鈣0.35 g、磷酸鋁0.3 g、磷酸鐵0.5 g),分別按照2%接種量接種孢子懸液,以空白不接種培養(yǎng)基為對照,置于搖床中培養(yǎng)(160 r·min-1,28 ℃),每處理3個(gè)重復(fù).分別在培養(yǎng)1,2,3,5,7,9,11,13 d時(shí)測量溶磷量、pH和生物量.取4mL菌液于12 000 r·min-1離心5 min,取上清液,用鉬藍(lán)比色法測定磷含量.

1.5 溶磷菌促生特性的研究

1.5.1 溶磷菌產(chǎn)IAA能力的測定

將純菌種接種于LB培養(yǎng)基中,在(28±2) ℃,120 r·min-1轉(zhuǎn)速的恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng)至對數(shù)生長期.隨后,從培養(yǎng)至對數(shù)生長期的菌液中取2 mL菌液離心去上清,用1 mL PBS洗滌沉淀再懸浮在磷酸鹽緩沖液(PBS)中,將約1 mL菌懸液(相當(dāng)于107cells·mL-1的細(xì)胞密度)加入色氨酸培養(yǎng)基中,在(28±2) ℃,120 r·min-1連續(xù)振蕩48 h后,取2 mL細(xì)菌培養(yǎng)液,12 000 r·min-1離心10 min.取上清液約1 mL,加入等體積的Salkowski試劑(Salkowski試劑:內(nèi)含 0.5 mol·L-1FeCl3溶液10 mL、35%高氯酸500 mL),于使用前混合搖勻,避光保存.室溫黑暗靜置30 min后觀察,顏色變紅表明IAA產(chǎn)生.同時(shí)在530 nm波長處用紫外分光光度計(jì)測定IAA濃度,并與IAA標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較,計(jì)算出IAA濃度.

1.5.2 溶磷菌產(chǎn)氨能力的測定

將菌液以2%接種量接種于100 mL蛋白胨水培養(yǎng)基中(蛋白胨10 g·L-1,氯化鈉5 g·L-1,pH 7.0±0.2),重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),在28 ℃,160 r·min-1下培養(yǎng),每隔2 d采集培養(yǎng)樣品,1 000 r·min-1離心1 min.然后將上清液與納斯勒試劑反應(yīng),用紫外分光光度計(jì)在420 nm處測量吸光值,以空白培養(yǎng)基作為對照.

1.5.3 溶磷菌固氮能力和纖維素酶活性的測定

將菌株接種在無氮培養(yǎng)基中,通過觀察菌株生長的狀況來判定菌株的固氮能力.將菌株接種在以ACC為唯一碳源的固體培養(yǎng)基平板上,對ACC脫氨酶的產(chǎn)生進(jìn)行測定,若菌株在平板上生長則證明該菌株具有產(chǎn)ACC脫氨酶的能力.菌株纖維素酶活性的定性測定:將菌株接種至羧甲基纖維素鈉固體培養(yǎng)基平板上,培養(yǎng)5 d后,用1 g·L-1剛果紅溶液進(jìn)行染色30 min,棄去染色液,倒入0.5%的NaCl溶液,進(jìn)行脫色,脫色15 min后,觀察透明圈;菌株纖維素酶活性的定量測定:將菌株接種至液體羧甲基纖維素鈉培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵,在28 ℃,160 r·min-1轉(zhuǎn)速的恒溫?fù)u床中震蕩培養(yǎng),每間隔1 d取發(fā)酵菌液,采用DNS法測定菌株纖維素酶活性.

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次重復(fù)處理,所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0版計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)偏差,使用Origin 8.0版和Photoshop CS 8.0版處理圖片.

2 結(jié)果與分析

2.1 溶磷菌篩選結(jié)果

經(jīng)NBRIP篩選培養(yǎng)基篩選出了1株溶磷效果較好的菌株(X1),如圖1(左)所示,其透明圈明顯,采用鉬銻抗比色法對該溶磷菌的溶磷量進(jìn)行了測定,解磷量為2 003.95 mg·L-1,對 Ca3(PO4)2有很強(qiáng)的溶解能力;經(jīng)過多次傳代培養(yǎng)后,X1解磷效果仍保持良好,說明其對不溶性磷酸鹽的分解效果比較穩(wěn)定.

對菌株X1的溶磷能力進(jìn)行了初步測定,將菌株X1接種至NBRIP固體培養(yǎng)基上,經(jīng)培養(yǎng)7 d后,如圖1(右)所示,具有較明顯的透明圈,其D/d比值為1.08,說明菌株的溶磷能力大小并不是與其溶磷指數(shù)呈正比相關(guān).

左圖:初篩培養(yǎng)基平板,箭頭示透明圈;右圖:篩選的菌株接種到NBRIP培養(yǎng)基平板,箭頭示透明圈.圖1 溶磷菌菌株X1的篩選

2.2 溶磷菌鑒定結(jié)果

菌株X1在PDA固體培養(yǎng)基上,菌株生長迅速,菌落干燥,不透明,氣生菌絲呈絮狀,產(chǎn)孢面呈暗綠色,背面為淡黃色,如圖2(左)所示.從左圖的平板上挑出菌落置于載玻片上在顯微鏡下觀察,根據(jù)顯微鏡鏡檢圖(圖2(右))可以看出,菌絲和孢子呈掃帚狀,與青霉菌形態(tài)相似.

左圖:PDA平板菌落形態(tài);右圖:顯微鏡下菌絲孢子形態(tài)(×1 000).圖2 溶磷菌菌株X1的形態(tài)特征

利用引物(TCCTCCGCTTATTGATATGC)擴(kuò)增菌株X1 18S rDNA,得到334 bp的目的DNA序列TCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCACTTTATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAGTACCTTACTACATGGATACCTGTGGTAATTCTAGAGCTAATACATGCTAAAAACCCCGACTTCAGGAAGGGGTGTATTTATTAGATAAAAAACCAACGCCCTTCGGGGCTCCTTGGTGAATCATAATAACTTAACGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTGCCCTATCAACTTTCGATGGTAGGATAGTGGCCTACCATGGTGGCAACGGGT,對DNA序列進(jìn)行測序.利用Blast軟件與MEGA中的相似序列進(jìn)行同源性比較,結(jié)果顯示(圖3),菌株X1與斜臥青霉的同源性達(dá)97%,因此將其鑒定為斜臥青霉菌屬(Penicilliumdecumbens).(上述工作委托吉林省庫美生物技術(shù)有限公司完成)

圖3 根據(jù)溶磷菌菌株X1 18S rDNA構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 斜臥青霉X1對不同磷源溶解情況

為了解斜臥青霉X1動(dòng)態(tài)溶磷的特性,測定了斜臥青霉X1對磷酸鈣、磷酸鋁、磷酸鐵的動(dòng)態(tài)溶磷能力,結(jié)果如圖4所示.斜臥青霉X1對不同磷源均具有溶解能力,且溶解特性差別較大,其中對磷酸鈣的溶解能力最強(qiáng),其次是磷酸鋁,對磷酸鐵的溶解能力較低.

圖4 斜臥青霉X1以磷酸鈣為磷源的溶磷動(dòng)態(tài)、生物量和pH變化

如圖4所示,斜臥青霉X1以磷酸鈣為唯一磷源,在初期階段(2 d內(nèi))溶磷量上升幅度很小,直至第3天溶磷量才大幅上升,此時(shí)pH也降低至3.29.隨著發(fā)酵時(shí)間的延長,在第9 天時(shí),斜臥青霉X1對磷酸鈣的溶磷量達(dá)到最大值,為2 003.95 mg·L-1,同時(shí)此時(shí)的生物量也達(dá)到了最高,為12.93 g·L-1.

如圖5所示,斜臥青霉X1以磷酸鋁為唯一磷源,從第1天溶磷量就開始大幅提高,此時(shí)發(fā)酵液的pH也開始迅速下降,直至第5 天,斜臥青霉X1對磷酸鋁的溶磷量達(dá)到了最大值387.88 mg·L-1,且此時(shí)發(fā)酵液的pH也降至最低值3.05.

圖5 斜臥青霉X1以磷酸鋁為磷源的溶磷動(dòng)態(tài)、生物量和pH變化

由圖6可知,斜臥青霉X1以磷酸鐵為唯一磷源時(shí),從第1天開始,溶磷量就迅速提高,此時(shí)發(fā)酵液的pH也開始迅速下降,直至第3 天,斜臥青霉X1對磷酸鐵的溶磷量達(dá)到了最大值30.76 mg·L-1,發(fā)酵液中的pH最低可降至2.42.

2.4 溶磷菌X1作為菌劑的相關(guān)促生能力初探

采用Salkowski試劑比色法測定斜臥青霉X1分泌IAA量最大值為14.93 mg·L-1,納斯勒試劑反應(yīng)法測定斜臥青霉X1產(chǎn)氨量最大值可達(dá)509.24 mg·L-1.

對斜臥青霉X1的產(chǎn)ACC脫氨酶能力、固氮能力以及產(chǎn)纖維素酶能力進(jìn)行定性測定,結(jié)果如圖7所示.由圖7(左)可知,斜臥青霉X1可以在以ACC為唯一碳源的平板上生長,說明斜臥青霉X1具有分泌ACC脫氨酶的能力,能夠有效地促進(jìn)植物生長.由圖7(中)可知,斜臥青霉X1可以在無氮培養(yǎng)基上生長,說明斜臥青霉X1具有一定的固氮能力,可以為植物提供豐富的氮源,供植物生長所需.由圖7(右)可知,斜臥青霉X1在羧甲基纖維素鈉平板上可以生長,且經(jīng)剛果紅染色以及NaCl脫色后,平板上可以明顯看到透明圈,經(jīng)DNS法定量測定,斜臥青霉X1產(chǎn)纖維素酶活性為34.41 U·mL-1.

圖7 斜臥青霉X1產(chǎn)ACC脫氨酶(左)、固氮能力(中)、產(chǎn)纖維素酶(右)驗(yàn)證平板圖

3 討 論

土壤溶磷微生物不僅可以通過溶磷作用促進(jìn)植物對磷的吸收、促進(jìn)植物生長,還可以通過自身分泌一些代謝產(chǎn)物促進(jìn)植物生長.有研究認(rèn)為,溶磷微生物可以促進(jìn)植物對磷的吸收,不是因?yàn)樗鼘⑼寥乐械挠行Я揍尫懦鰜?而是因?yàn)槿芰孜⑸锓置诘拇偕L物質(zhì)刺激根系的伸長進(jìn)一步增加植物對土壤中磷的吸收[11].目前研究發(fā)現(xiàn),溶磷微生物能夠分泌生長素(IAA)、赤霉素(GA)、細(xì)胞分裂素(CK)、1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(ACC)、鐵載體(siderophores)、揮發(fā)性氫氰酸(HCN)和脫落酸(ABA)等物質(zhì),同時(shí)溶磷微生物還具有解鉀、固氮等作用[12].范丙全等[13]從種植葵花的鹽堿地中篩選出了1株高效的溶磷真菌日本曲霉M1,其對磷酸鈣的溶解量最高可達(dá)1 020.89 mg·L-1,pH最低可降至3.36.張建峰等[7]從長春市農(nóng)安縣西鹽堿地篩選出了1株溶磷能力較強(qiáng)的菌株,繩狀青霉P1,該菌株對磷酸鈣的最高溶解量為1 276.75 mg·L-1,對磷酸鋁和磷酸鐵有較好的溶解能力,最高溶磷量為96.02,15.34 mg·L-1.筆者篩選出的高效溶磷真菌斜臥青霉X1對磷酸鈣最高溶解量為2 003.95 mg·L-1,對磷酸鋁和磷酸鐵的溶解量可達(dá)387.88,30.76 mg·L-1,在溶解磷酸鈣方面,斜臥青霉X1的溶磷效果優(yōu)于日本曲霉M1以及繩狀青霉P1,且對于磷酸鋁和磷酸鐵的溶解效果也優(yōu)于繩狀青霉P1,這為制備微生物菌肥提供了重要的理論支持.

ACC脫氨酶和IAA均有助于植物的生長.筆者的平板驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明,斜臥青霉X1可以產(chǎn)生ACC脫氨酶和IAA來促進(jìn)植物的生長.此外,氮是葉綠素的主要成分,與光合作用有密切關(guān)系.因此斜臥青霉X1的固氮作用可以更好地促進(jìn)植物的光合作用,為植物的生長發(fā)育提供更多的氮源.纖維素類物質(zhì)是自然界中最廉價(jià)、含量最豐富的可再生資源.微生物是纖維素酶的主要來源,利用酶解法使纖維素類物質(zhì)糖化,由于其能耗低,反應(yīng)溫和,是提高纖維素利用的重要手段之一.筆者所研究的臥青霉X1可以產(chǎn)生纖維素酶,酶活性為34.41 U·mL-1,對纖維素具有一定的降解能力,因此斜臥青霉X1可以與秸稈等有機(jī)肥結(jié)合,制備成微生物菌劑,應(yīng)用于農(nóng)業(yè)種植.該研究結(jié)果可為生物肥料的研制提供有效的技術(shù)支持.

4 結(jié)束語

筆者從胡枝子根際土壤中篩選出了1株溶磷真菌斜臥青霉X1,對不同磷源均具有溶解能力,其中對磷酸鈣最高溶解量可達(dá)2 003.95 mg·L-1,且斜臥青霉X1還可以分泌IAA來促進(jìn)植物生長,具有一定產(chǎn)氨及固氮能力,為微生物菌劑的研制提供了較好的菌種資源,以期為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展提供重要的科學(xué)依據(jù)和理論支持.