潘曉薇,王 予,歐陽(yáng)璐斯,陶 紅,周 瑢,彭 琛

(廣東中煙工業(yè)有限責(zé)任公司 技術(shù)中心,廣東 廣州 510385)

煙草是以收獲葉片為主的重要經(jīng)濟(jì)作物,煙葉在儲(chǔ)存期經(jīng)過(guò)自然醇化或人工發(fā)酵,可以提高煙葉燃吸品質(zhì)和可用性[1].煙葉自然醇化的貯藏周期長(zhǎng),由于煙葉吸濕性強(qiáng)[2],而煙葉中又含有微生物生長(zhǎng)所需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3],因此一旦條件適宜[4],煙葉在貯藏過(guò)程中極易滋生各種微生物而發(fā)生霉變.隨著霉菌的滋生,煙葉正常的組織結(jié)構(gòu)被破壞,外觀色澤發(fā)暗,原有的香氣消失,散發(fā)出難聞的酸臭氣味,刺激性增大,吃味苦澀,煙絲原有的韌性和彈性消失[5].此外,因生霉而產(chǎn)生的氣味會(huì)遺留在煙包內(nèi),使未霉的煙葉也產(chǎn)生霉味[6],嚴(yán)重影響整批煙葉的質(zhì)量.有些種類(lèi)的霉菌甚至?xí)诖x過(guò)程中產(chǎn)生致癌物質(zhì),如黃曲霉毒素[7],影響吸煙者的健康.因此,積極做好貯藏?zé)熑~的霉變防治工作,為卷煙產(chǎn)品提供優(yōu)質(zhì)原料就顯得十分必要[8].而建立快速的微生物污染檢測(cè)方法是做好霉變防治工作的關(guān)鍵.

目前國(guó)內(nèi)外檢測(cè)霉菌的方法很多,例如傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法、代謝產(chǎn)物檢測(cè)法、鑒定用培養(yǎng)基法、免疫測(cè)定法及分子生物學(xué)方法等[9-12].而在煙草行業(yè)中,最常見(jiàn)的檢測(cè)煙葉霉變的方法是通過(guò)感官檢驗(yàn)煙葉是否霉變,如眼看、手捏、鼻聞等[13],這就需要檢驗(yàn)人員具有非常豐富的經(jīng)驗(yàn).也可以通過(guò)傳統(tǒng)的培養(yǎng)鑒定法檢測(cè)菌落密度來(lái)進(jìn)行判定[14],如煙葉中霉菌數(shù)量處于2.5×103～3.0×103CFU·g-1,則認(rèn)為其已經(jīng)發(fā)生霉變[15].由于傳統(tǒng)培養(yǎng)鑒定法操作煩瑣,耗時(shí)長(zhǎng),近年來(lái)逐步被麥角甾醇測(cè)定法取代[16],麥角甾醇測(cè)定法更為快速、客觀,但是由于其靈敏度有限,往往只能用于霉變已經(jīng)發(fā)生后的判定而無(wú)法實(shí)現(xiàn)預(yù)警.熒光定量PCR檢測(cè)方法與目前常用方法相比,具有更準(zhǔn)確、靈敏度更高等優(yōu)點(diǎn),因此具有更加廣泛的應(yīng)用前景[17].

研究發(fā)現(xiàn),霉變煙葉中含有的微生物包括:曲霉屬(Aspergillus)、青霉屬(Penicillium)、根霉屬(Rhizopus)、木霉屬(Trichoderma)、毛霉屬(Mucor)、腐霉屬(Pythium)、芽孢桿菌屬(Bucillus)、葡萄狀穗霉屬(Stachybotrys)、輪枝孢霉屬(Verticillium)、酵母菌屬(Lactobacillus)等[18],但其發(fā)育繁殖的最適溫度各不相同,在某種生長(zhǎng)環(huán)境下往往以其中一種為主[19].其中,曲霉菌在霉變煙葉分離出的微生物中含量最高,分布最廣[20],且其中的部分種類(lèi)可以產(chǎn)生危害人體健康的毒素.在高溫高濕的環(huán)境中,曲霉菌更是絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)菌群,對(duì)曲霉菌的有效監(jiān)控就變得更有意義.因此,筆者選擇曲霉菌(Aspergillus)為研究對(duì)象,利用熒光定量PCR(fluorescence quantitative PCR,簡(jiǎn)稱(chēng)qPCR)技術(shù)建立一種快速、準(zhǔn)確、靈敏度高的煙葉霉變檢測(cè)方法并利用該方法對(duì)倉(cāng)儲(chǔ)煙葉中的曲霉菌含量變化情況進(jìn)行分析.

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

1.1.1 材 料

實(shí)驗(yàn)用真菌標(biāo)準(zhǔn)株:煙曲霉Aspergillusfumigatus(CICC40537)、黑曲霉Aspergillusniger(CICC2039)、米曲霉Aspergillusoryzae(CICC2002)購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC).

1.1.2 試 劑

察氏培養(yǎng)基購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;Taq酶、PMD18-T載體、質(zhì)粒純化試劑盒及DNA marker均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司;熒光定量PCR試劑及基因組提取試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司;引物合成和基因測(cè)序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成.

1.2 方 法

1.2.1 霉菌接種與培養(yǎng)

用一次性無(wú)菌塑料接種環(huán)分別蘸取安瓿瓶中的菌種以三點(diǎn)式點(diǎn)種于察氏平板培養(yǎng)基上,用封口膜封住并將培養(yǎng)基倒置于30 ℃霉菌培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4～7 d.用接種環(huán)蘸取少量霉菌孢子,接種于100 mL察氏液體培養(yǎng)基中,30 ℃振蕩培養(yǎng)2～3 d,用移液器吸取含有霉菌孢子的培養(yǎng)基于1.5 mL EP管中,加入20%甘油,-80 ℃凍存.用生理鹽水沖洗培養(yǎng)3～4 d后的霉菌培養(yǎng)皿,收集孢子,制成混懸液,用于提取基因組.

1.2.2 霉菌基因組提取及ITS序列擴(kuò)增

使用真菌基因組DNA提取試劑盒分別提取煙曲霉、米曲霉、黑曲霉的基因組,通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳確定提取出基因組DNA后,使用真菌ITS區(qū)通用引物ITS-1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3’)和ITS-4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’),以提取的基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,反應(yīng)體系為50 μL:Buffer,5 μL;dNTP,4 μL;Taq酶,0.5 μL;引物各1 μL;模板DNA,2 μL;H2O,36.5 μL.PCR程序?yàn)?94 ℃預(yù)變性3 min后進(jìn)入循環(huán),每個(gè)循環(huán)為94 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s,共30個(gè)循環(huán)后,72 ℃延伸10 min.通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增情況,得到的PCR產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序,通過(guò)BLAST和MEGA軟件分析獲得基因序列.

1.2.3 引物探針設(shè)計(jì)

找出3種曲霉菌基因序列中相對(duì)保守的部分,通過(guò)在NCBI基因庫(kù)中進(jìn)行BLAST分析,確定所選取的區(qū)域高度保守且屬間特異,與其他細(xì)菌、真菌及煙草基因的核酸序列之間無(wú)較高同源性.利用 Primer Premier 5.0軟件針對(duì)所選取的基因片段設(shè)計(jì)曲霉菌的引物及探針,其DNA序列分別為:上游引物,5’-GTC TTT GAA CGC ACA TTG CGC-3;下游引物,5’-ATA CGC TCG AGG ACC GGA C-3’;探針,5’-FAM-CCT GTC CGA GCG TCA TTG CTG CCC TCA-BHQ1-3’.

1.2.4 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品制備

將煙曲霉ITS區(qū)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過(guò)切膠回收純化后,與pMD18-T載體進(jìn)行連接,并轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)培養(yǎng)后用PCR及限制性?xún)?nèi)切酶鑒定出陽(yáng)性菌株,純化質(zhì)粒后送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序.測(cè)序正確的質(zhì)粒作為筆者研究中熒光定量PCR法的標(biāo)準(zhǔn)品.

1.2.5 熒光定量PCR方法

反應(yīng)總體系為20 μL:其中Taqman Master Mix 10 μL;上下游引物及探針各0.4 μL;模板DNA 0.1 μL;ddH2O 8.7 μL.擴(kuò)增程序?yàn)?50 ℃保持2 min,然后95 ℃預(yù)變性10 min后進(jìn)入循環(huán),每個(gè)循環(huán)為95 ℃變性15 s、60 ℃退火及延伸1 min,共40個(gè)循環(huán)后,60 ℃延伸1 min.在每個(gè)循環(huán)末收集熒光信號(hào).

1.2.6 特異性實(shí)驗(yàn)

為了驗(yàn)證引物、探針的特異性,確定其與其他真菌及煙葉基因組無(wú)同源性,分別提取酵母、煙葉及米曲霉的基因組DNA作為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),以是否出現(xiàn)擴(kuò)增曲線來(lái)檢測(cè)該方法的特異性.

1.2.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

重復(fù)性實(shí)驗(yàn)包括了批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn),批內(nèi)重復(fù)性實(shí)驗(yàn)是對(duì)同一模板、同一反應(yīng)體系同時(shí)進(jìn)行測(cè)定,批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)是對(duì)同一樣本在反應(yīng)體系相同的條件下進(jìn)行連續(xù)5 d重復(fù)測(cè)定.該實(shí)驗(yàn)采取濃度為1.00,0.05,0.01 μg·mL-1的3 個(gè)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA稀釋液進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性實(shí)驗(yàn),每個(gè)樣本重復(fù)測(cè)定20 次,利用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件計(jì)算批內(nèi)及批間循環(huán)閾值(cycle threshold,簡(jiǎn)稱(chēng)Ct)的變異系數(shù)(coefficient of variation,簡(jiǎn)稱(chēng)CV).CV=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值×100%.

1.2.8 靈敏度實(shí)驗(yàn)

質(zhì)粒DNA溶液使用蛋白核酸分析儀進(jìn)行定量,取測(cè)定好濃度的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒DNA溶液,使用倍比稀釋法,按照1∶5倍比稀釋待測(cè)樣本,以這些待測(cè)樣本為模板進(jìn)行熒光定量PCR分析,找出檢測(cè)為陽(yáng)性時(shí)的最低濃度,即為該方法的檢測(cè)靈敏度.

1.2.9 標(biāo)準(zhǔn)曲線

將已知拷貝數(shù)的陽(yáng)性質(zhì)粒倍比稀釋作為模板,進(jìn)行熒光定量PCR 擴(kuò)增,得到相應(yīng)的擴(kuò)增曲線,并計(jì)算Ct 值與陽(yáng)性質(zhì)粒拷貝數(shù)的線性對(duì)應(yīng)關(guān)系,產(chǎn)生相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線.

1.3 模擬霉變實(shí)驗(yàn)

將1 kg煙葉混勻后置于霉菌培養(yǎng)箱中,在25 ℃,80%濕度的條件下放置30 d,觀察其從未霉變狀態(tài),經(jīng)過(guò)臨近霉變狀態(tài)和霉變初期狀態(tài)直至重度霉變狀態(tài)的過(guò)程.整個(gè)過(guò)程中每隔24 h從中取出10～20 g煙葉,經(jīng)過(guò)處理后分別用熒光定量PCR及3M測(cè)試片計(jì)數(shù)的方法對(duì)霉菌含量進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)兩種方法的檢測(cè)情況進(jìn)行比較.

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光定量PCR方法建立

2.1.1 熒光定量PCR方法特異性檢測(cè)

特異性檢測(cè)結(jié)果如圖1所示.

1:米曲霉;2:酵母;3:煙草.圖1 特異性檢測(cè)擴(kuò)增曲線

圖1顯示,以質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)檢測(cè)到明顯的S形曲線,而以酵母基因組和煙草基因組為模板進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)在40個(gè)循環(huán)內(nèi)均未出現(xiàn)S形曲線,說(shuō)明未有特異性擴(kuò)增.由此可見(jiàn),引物探針特異性良好,與其他真菌及煙葉基因無(wú)交叉反應(yīng).

2.1.2 熒光定量PCR方法重復(fù)性檢測(cè)

日內(nèi)及日間重復(fù)性的結(jié)果如表1所示.

表1 以質(zhì)粒為模板的重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

表1顯示,日內(nèi)、日間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)的高、中、低濃度反應(yīng)均有擴(kuò)增,且同一濃度的擴(kuò)增曲線都基本重合,計(jì)算日內(nèi)、日間重復(fù)性實(shí)驗(yàn)擴(kuò)增曲線的Ct值變異系數(shù),結(jié)果均小于5%(在0.09%至2.02%之間),表明該方法有較好的穩(wěn)定性和重復(fù)性.

2.1.3 熒光定量PCR方法的靈敏度檢測(cè)

按照1∶5的稀釋倍數(shù)對(duì)定量后的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品溶液進(jìn)行倍比稀釋,共稀釋18管(T1～T18).每管濃度如表2所示.

表2 不同稀釋點(diǎn)模板濃度 copies·mL-1

進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng),每個(gè)濃度做3個(gè)平行,所得結(jié)果如圖2所示.

圖2 不同濃度模板擴(kuò)增曲線

圖2顯示,T16即濃度為9.42 copies·mL-1時(shí),仍能夠看到擴(kuò)增曲線,因此該熒光定量PCR反應(yīng)體系的檢測(cè)靈敏度可達(dá)約10 copies·mL-1.

2.1.4 熒光定量PCR方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

以陽(yáng)性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品按照倍比稀釋后作為模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增,以陽(yáng)性質(zhì)粒的基因拷貝數(shù)為x軸,以Ct值為y軸,建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:y=-3.727x+39.82.相關(guān)系數(shù)R2=0.999,說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合程度良好.

2.2 模擬霉變實(shí)驗(yàn)

2.2.1 煙葉外觀變化

在25 ℃,80%濕度的培養(yǎng)箱中放置的煙葉大約在第19天,邊緣的部分煙葉開(kāi)始出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的白色絮狀物,之后開(kāi)始不斷增加,到第25天已經(jīng)可以觀察到大量的白色發(fā)霉物,有些煙葉開(kāi)始逐漸顯現(xiàn)出青灰色,打開(kāi)霉菌培養(yǎng)箱時(shí)可以聞到一些濕腐的氣味.到第30天霉變已經(jīng)非常嚴(yán)重,整盤(pán)煙葉都覆蓋有絮狀白毛,有些地方已經(jīng)出現(xiàn)綠色甚至黑褐色霉斑,已有較為明顯的霉味.

2.2.2 測(cè)試片法檢測(cè)霉菌含量隨時(shí)間變化結(jié)果

對(duì)每天抽取的煙葉樣品使用3M快速霉菌酵母測(cè)試片進(jìn)行霉菌菌落數(shù)的檢測(cè),所得結(jié)果列于表3.

表3 3M測(cè)試片法檢測(cè)霉菌含量隨存放時(shí)間變化情況 CFU·g-1

楊蕾[21]的研究結(jié)果表明,霉菌數(shù)達(dá)到一定量(104CFU·g-1左右)時(shí),會(huì)開(kāi)始快速增長(zhǎng),并以霉菌量=104CFU·g-1為分界點(diǎn),將霉菌計(jì)數(shù)<104CFU·g-1判為未霉變樣品.根據(jù)表3中的檢測(cè)結(jié)果,在第22天的時(shí)候煙葉中的霉菌數(shù)量超過(guò)104CFU·g-1,已經(jīng)達(dá)到霉變樣品,在第21天,霉菌數(shù)量在103～104CFU·g-1之間,屬于臨近霉變的狀態(tài),20 d之前(包括第20天)均屬于未霉變狀態(tài).

2.2.3 熒光定量PCR法檢測(cè)霉菌含量隨時(shí)間變化結(jié)果

對(duì)每天抽取的煙葉樣品使用熒光定量PCR法進(jìn)行曲霉菌含量的檢測(cè),所得結(jié)果列于表4.

表4 熒光定量PCR法檢測(cè)曲霉菌基因拷貝數(shù)隨存放時(shí)間變化情況 copies·g-1

結(jié)合煙葉外觀觀察及3M測(cè)試片檢測(cè)的結(jié)果,以及文獻(xiàn)中霉變的判定標(biāo)準(zhǔn),筆者認(rèn)為,當(dāng)煙葉中曲霉菌基因拷貝數(shù)達(dá)到109～1011copies·g-1之間時(shí),煙葉處于臨近霉變的狀態(tài),基因拷貝數(shù)超過(guò)1011copies·g-1,煙葉已經(jīng)達(dá)到霉變狀態(tài),而基因拷貝數(shù)<109copies·g-1時(shí)則認(rèn)為煙葉處于未霉變狀態(tài).

2.2.4 兩種方法檢測(cè)結(jié)果的比較

將3M測(cè)試片法的檢測(cè)結(jié)果及熒光定量PCR法的檢測(cè)結(jié)果分別作為縱坐標(biāo),方便對(duì)兩種方法的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較.如圖3所示:(a)圖為整個(gè)30 d霉變過(guò)程的折線圖,兩種方法均呈現(xiàn)同樣的趨勢(shì),即開(kāi)始十幾天時(shí)霉菌的數(shù)量維持在極低的范圍無(wú)太大變化,在出現(xiàn)拐點(diǎn)之后隨即進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期代表曲霉菌在這個(gè)時(shí)期大量增殖,從而導(dǎo)致霉變產(chǎn)生.而兩種方法的檢測(cè)結(jié)果的“拐點(diǎn)”有較為明顯的差異.將第14天～第22天的數(shù)據(jù)放大得到(b)圖,可以看出,3M測(cè)試片法在第20天～第21天時(shí)出現(xiàn)數(shù)量的增殖拐點(diǎn),而熒光定量PCR法的檢測(cè)結(jié)果則是在第14天～第15天時(shí)已經(jīng)開(kāi)始出現(xiàn)上升趨勢(shì),到第17天時(shí)出現(xiàn)明顯的大幅度增加.

(a) 第1天～第30天;(b) 第14天～第22天.圖3 以霉變天數(shù)為橫坐標(biāo),分別以測(cè)試片(左側(cè)縱坐標(biāo))及qPCR(右側(cè)縱坐標(biāo))檢測(cè)結(jié)果為縱坐標(biāo)做曲線兩種方法的檢測(cè)結(jié)果比較

結(jié)合霉變實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)煙葉外觀的觀察結(jié)果,第17天時(shí)尚未觀察到煙葉有霉變反應(yīng),第19天時(shí)煙葉邊緣已出現(xiàn)霉變跡象.因此,可以認(rèn)為,3M測(cè)試片法可用于對(duì)煙葉霉變的判別,而qPCR法則可以更早地提示霉變的發(fā)生,這可能是由于,細(xì)胞的分裂過(guò)程是由染色體的復(fù)制開(kāi)始的,因此基因拷貝數(shù)的增加優(yōu)先于菌落數(shù)的增加.實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),第15天～第17天時(shí),熒光定量PCR方法已經(jīng)可以檢測(cè)到曲霉菌基因數(shù)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì),但是用3M測(cè)試片并未檢測(cè)到霉菌數(shù)量的明顯增加,從外觀及氣味上未出現(xiàn)霉變的情況,與普通煙葉無(wú)外觀上的差異.由于該研究中的模擬煙葉霉變過(guò)程是在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行,為促進(jìn)霉變的發(fā)生,采用的溫度、濕度條件都是非常適宜霉菌繁殖的條件,因此大大加快了整個(gè)霉變反應(yīng)的進(jìn)程.而在實(shí)際倉(cāng)儲(chǔ)條件中,霉變的過(guò)程會(huì)相對(duì)緩慢,這個(gè)臨界期也會(huì)相對(duì)變長(zhǎng),因此可以利用熒光定量PCR檢測(cè)方法對(duì)煙葉的臨界霉變狀態(tài)進(jìn)行預(yù)警,從而在霉變發(fā)生之前及時(shí)對(duì)即將產(chǎn)生霉變的煙葉進(jìn)行處理.

3 結(jié)束語(yǔ)

曲霉菌熒光定量PCR檢測(cè)體系的建立,一個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)在于引物探針的特異性[5-6].筆者根據(jù)ITS區(qū)序列設(shè)計(jì)引物探針,然后在3種曲霉菌ITS1區(qū)的保守序列設(shè)計(jì)引物并與其他霉菌序列進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證,確保其具有遺傳保守性.通過(guò)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了該熒光定量PCR檢測(cè)曲霉菌的方法具有較好的特異性、靈敏度和重復(fù)性,說(shuō)明該方法可以對(duì)煙葉中的曲霉菌含量進(jìn)行高效靈敏的檢測(cè).通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)室模擬霉變的煙葉進(jìn)行檢測(cè),認(rèn)為當(dāng)煙葉中曲霉菌基因拷貝數(shù)達(dá)到109～1011copies·g-1之間時(shí),煙葉處于臨近霉變的狀態(tài),基因拷貝數(shù)>1011copies·g-1時(shí)煙葉為霉變狀態(tài),基因拷貝數(shù)<109copies·g-1時(shí)煙葉則為未霉變狀態(tài).通過(guò)與其他測(cè)試方法的比較發(fā)現(xiàn),利用熒光定量PCR檢測(cè)方法可以更早地發(fā)現(xiàn)煙葉即將發(fā)生霉變的前兆,從而有利于提前對(duì)其進(jìn)行處理.