◎ 蘇妙貞，楊丹婷，丁清龍，周 露

（廣東省食品檢驗(yàn)所，廣東 廣州 510435）

肉類是動(dòng)物的皮下組織及肌肉，肉類食品含有豐富的蛋白質(zhì)，通常是人們飲食中的重要組成部分[1]。近年，社會(huì)接連出現(xiàn)肉類食品摻假或以次充好的問題，如2013 年歐洲的“馬肉風(fēng)波”，在多款冷凍牛肉食品中檢出馬肉成分[2]。另外，還有個(gè)別不法商人低價(jià)購(gòu)入豬肉摻入價(jià)格更高的牛肉[3]或羊肉中、將低價(jià)風(fēng)干鴨肉干冒充為牦牛干等。為保障消費(fèi)者的利益及食品質(zhì)量安全，動(dòng)物源性成分檢測(cè)具有重要的社會(huì)意義。

中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院測(cè)試評(píng)價(jià)中心（ACAS）是中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì)認(rèn)可的能力驗(yàn)證提供者，能對(duì)參加者的結(jié)果進(jìn)行評(píng)價(jià)[4]。能力驗(yàn)證是檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室能力的重要手段之一，參加能力驗(yàn)證對(duì)于持續(xù)提高實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)水平和質(zhì)量控制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)室于2022 年5 月參加了ACAS 組織的食品中牛、羊、豬、馬源性成分檢測(cè)能力驗(yàn)證ACAS-PT1397（2022）。選用SN/T 2051—2008[5]進(jìn)行牛、羊源性成分檢測(cè)；SN/T 3730.5—2013[6]進(jìn)行馬源性成分檢測(cè)；SN/T 3730.8—2013[7]進(jìn)行豬源性成分檢測(cè)，并用BJS 201904[8]對(duì)豬源性成分檢測(cè)結(jié)果再確認(rèn)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2 個(gè)樣品由ACAS 提供，為肉類產(chǎn)品，呈肉糜狀，鋁箔袋真空包裝，重約10 g，編號(hào)為22-K950、22-W704；陰性樣品為市場(chǎng)購(gòu)買的雞肉樣品；陽性樣品為市場(chǎng)購(gòu)買的牛肉、羊肉、豬肉、馬肉樣品；實(shí)驗(yàn)用水為無菌ddH2O。

1.2 儀器與試劑

ME203 天平（美國(guó)梅特勒-托利多科技有限公司）；AB2-3S1 生物安全柜（新加坡ESCO 公司）；Nano 核酸蛋白分析儀（日本島津企業(yè)管理有限公司）；CFX-96 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀（美國(guó)伯樂公司）；Quant Studio 6 Flex 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；Centrifuge 5430 離心機(jī)（德國(guó)艾本德公司）

DNA 提 取 試 劑 盒（ 德 國(guó)QIAGEN 公 司）；Premix Ex TaqTM（Probe qPCR）（ 日 本TaKaRa 公司）；Real Time PCR Bovine DNA Detection Kit（日本TaKaRa 公司）；Real Time PCR Ovine DNA Detection Kit（日本TaKaRa 公司）；內(nèi)參照、豬源性成分的正向引物、反向引物、探針按照SN/T 3730.8—2013 和BJS 201904，馬源性成分的正向引物、反向引物、探針按照SN/T 3730.5—2013 提供的序列信息由生工生物工程上海股份有限公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

參照組織方提供的參試指導(dǎo)書、SN/T 2051—2008、SN/T 3730.8—2013、SN/T 3730.5—2013 和BJS 201904進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.3.1 樣品DNA 提取

分別取樣品約200 mg，取樣盡量均勻。根據(jù)DNA 提取試劑盒說明書步驟提取樣品DNA，每個(gè)樣品提取3 個(gè)平行樣。提取過程同時(shí)取200 μL 水作為提取空白對(duì)照，與樣品同時(shí)進(jìn)行DNA 提取。用核酸蛋白分析儀測(cè)定DNA 濃度、A260及A280的比值，將DNA 濃度統(tǒng)一用水稀釋至50 ng·μL-1進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 牛、羊源性成分PCR 擴(kuò)增

用CFX-96 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀，按照SN/T 2051—2008 進(jìn)行牛、羊源性成分檢測(cè)。反應(yīng)體系：總體積為25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）混合 液1 μL，探 針（10 μmol·L-1）1 μL，模 板DNA 2 μL，水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 s，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性5 s，60 ℃退火延伸30 s，40 個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光。

1.3.3 豬源性成分PCR 擴(kuò)增

用Quant Studio 6 Flex 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀，先按照SN/T 3730.8—2013 進(jìn)行豬源性成分檢測(cè)。反應(yīng)體系：總體積為25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，探 針（10 μmol·L-1）1 μL，模板DNA 2 μL，水7.5 μL。反應(yīng)條件：50 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃預(yù)變性10 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，58 ℃退火延伸1 min，45 個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光。

對(duì)需要再確認(rèn)的樣品，用Quant Studio 6 Flex 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀按照BJS 201904 進(jìn)行豬源性成分檢測(cè)。反應(yīng)體系：總體積為20 μL，其中包括2×premix 10 μL，引物（10 μmol·L-1）各0.2 μL，探針（10 μmol·L-1）0.1 μL，模板DNA 1 μL，水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，1 個(gè)循環(huán)；95 ℃變性15 s，58 ℃退火延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光。

1.3.4 馬源性成分PCR 擴(kuò)增

用CFX-96 實(shí)時(shí)熒光PCR 儀，按照SN/T 3730.5—2013 進(jìn)行馬源性成分檢測(cè)。反應(yīng)體系：總體積為25 μL，其中包括2×premix 12.5 μL，引物（10 μmol·L-1）各1 μL，探針（10 μmol·L-1）1 μL，模板DNA 2 μL，水7.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性1 min，1 個(gè)循環(huán)；94 ℃變性34 s，60 ℃退火延伸45 s，40 個(gè)循環(huán)，在每次循環(huán)的退火時(shí)收集熒光。

1.3.5 質(zhì)量控制

每個(gè)實(shí)驗(yàn)過程均設(shè)置陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、試劑空白對(duì)照及提取空白對(duì)照。試劑空白對(duì)照即用水代替模板；提取空白對(duì)照即在樣品DNA 提取過程中，用水代替樣品與樣品同時(shí)進(jìn)行DNA 提??；熒光PCR 實(shí)驗(yàn)的每個(gè)樣品各加2 個(gè)平行孔。結(jié)果根據(jù)SN/T 2051—2008、SN/T 3730.8—2013、SN/T 3730.5—2013、BJS 201904 要求進(jìn)行判定。

2 結(jié)果與分析

2 個(gè)樣品各提取3 個(gè)平行樣的A260和A280比值均在1.8 ～2.0，說明DNA 濃度較高，提取效果較好[9]。在豬源性成分PCR 擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)中，按照SN/T 3730.8—2013 要求做的樣品內(nèi)參照（18S rRNA 基因）均有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，且熒光通道出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，Ct 值均＜30，證明有提取到動(dòng)物源性DNA，符合實(shí)驗(yàn)要求。

本次實(shí)驗(yàn)設(shè)置的陽性對(duì)照、陰性對(duì)照、試劑空白對(duì)照及提取空白對(duì)照均符合要求，實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。兩個(gè)樣品的牛、羊、豬、馬成分檢測(cè)結(jié)果根據(jù)相應(yīng)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)判定。各樣品的檢測(cè)結(jié)果詳見表1。

表1 各樣品的檢測(cè)結(jié)果表

樣品22-W704 的3 個(gè)平行樣的4 個(gè)檢測(cè)檢測(cè)項(xiàng)目結(jié)果基本一致，可得出相同結(jié)論。樣品22-K950 的3個(gè)平行樣品的牛、羊、馬源性成分結(jié)果也基本一致，可得出相同結(jié)論。用SN/T 3730.8—2013 檢測(cè)的豬源性成分判定結(jié)果出現(xiàn)不一致的情況：兩份樣品未檢出豬源性成分，一份樣品檢出豬源性成分但Ct 值（36.951、39.309）較大。將相同3 個(gè)平行樣用BJS 201904 進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，按BJS 201904 檢驗(yàn)和判定均未檢出豬源性成分（表2），增強(qiáng)了22-K950 的豬源性成分檢測(cè)結(jié)果為未檢出的信心。

表2 22-K950 豬源性成分用BJS 201904 檢測(cè)結(jié)果表

最終結(jié)果為樣品22-K950 檢出羊源性成分，未檢出牛、豬、馬成分；樣品22-W704 檢出牛、羊、豬源性成分，未檢出馬源性成分（表3）。

表3 能力驗(yàn)證上報(bào)結(jié)果表

3 結(jié)論與討論

將最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果上報(bào)至ACAS，結(jié)果均為滿意。證明本實(shí)驗(yàn)室有能力進(jìn)行動(dòng)物源性成分的檢測(cè)，也是對(duì)本實(shí)驗(yàn)室的充分肯定。本次能力驗(yàn)證，開闊了檢測(cè)人員的思路并積累了經(jīng)驗(yàn)，促進(jìn)了本實(shí)驗(yàn)室能力的提升。

本實(shí)驗(yàn)用了兩種方法確認(rèn)樣品22-K950 的豬源性成分檢測(cè)結(jié)果。方法比較能提高結(jié)果準(zhǔn)確性和檢測(cè)能力，為實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證結(jié)果填報(bào)提供了參考，提高實(shí)驗(yàn)室報(bào)出結(jié)果的把握[10]。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，在結(jié)果判定時(shí)，需結(jié)合Ct 值和擴(kuò)增曲線進(jìn)行綜合判定[11]。分析本實(shí)驗(yàn)樣品22-K950 用SN/T 3730.8—2013 檢測(cè)，有一份Ct 值（36.951、39.309）較大的情況，其擴(kuò)增曲線并不十分典型，考慮為假陽性。結(jié)合BJS 201904 判定結(jié)果，得出該樣品未檢出豬源性成分的結(jié)論。對(duì)該樣品，雖然BJS 201904 的Ct 值大于35 判定未檢出，仍未達(dá)到SN/T 3730.8—2013 檢測(cè)的Ct 值36.951 和39.309，但用SN/T 3730.8—2013 檢測(cè)豬源性成分上報(bào)結(jié)果為未檢出的能力驗(yàn)證結(jié)果評(píng)價(jià)為滿意，則說明SN/T 3730.8—2013 和BJS 201904 得出的未檢出豬源性成分實(shí)驗(yàn)結(jié)果均可靠。

熒光PCR 結(jié)果出現(xiàn)假陽性的可能原因有實(shí)驗(yàn)耗材污染、陽性樣本和陽性對(duì)照造成的污染[12]、樣品制作過程環(huán)境交叉污染等。由于本實(shí)驗(yàn)的空白對(duì)照、提取對(duì)照結(jié)果均符合要求，則認(rèn)為本實(shí)驗(yàn)豬源性成分檢測(cè)所出現(xiàn)的情況很可能是樣品在制樣過程交叉污染導(dǎo)致的。

熒光PCR 技術(shù)有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于肉制品中物質(zhì)的定性和定量分析[13]。由于該技術(shù)的極高敏感性，樣品采集、提取過程的污染及環(huán)境氣溶膠污染容易導(dǎo)致結(jié)果假陽性。為預(yù)防以上情況出現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)室應(yīng)區(qū)分試劑準(zhǔn)備區(qū)、核酸提取區(qū)、產(chǎn)物擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)；實(shí)驗(yàn)人員應(yīng)嚴(yán)格按照檢測(cè)方法操作；使用的耗材如PCR 管應(yīng)無菌無酶等[14]。對(duì)肉類檢測(cè)，基于DNA 生物學(xué)層面的分析技術(shù)除了熒光PCR 法外，還有常規(guī)PCR、數(shù)字PCR、等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)、DNA 條形碼和下一代測(cè)序等技術(shù)[15]。