黃青昕，劉 婷，胡淇睿，章 旭，潘 瑤，俞燕芳，馮建高，黎小萍，鄧澤元，陳 芳

基于體外模擬消化、發(fā)酵和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桑葉酚類物質(zhì)的潛在生物學(xué)活性

黃青昕1，劉 婷1，胡淇睿2，章 旭1，潘 瑤1，俞燕芳3，馮建高1，黎小萍3，鄧澤元2，陳 芳1

1. 南昌大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院 江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330006 2. 南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西 南昌 330029 3. 江西省經(jīng)濟(jì)作物研究所，江西 南昌 330202

基于體外模擬消化、發(fā)酵和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桑葉酚類物質(zhì)對(duì)于阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）、癌癥和糖尿病3種疾病的潛在共同作用靶點(diǎn)，為研究桑葉治療多種疾病提供理論基礎(chǔ)。新鮮桑葉冷凍干燥粉碎后模擬體外消化及腸道微生物發(fā)酵過程，取不同消化（或發(fā)酵）階段產(chǎn)物，利用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術(shù)分析其中的特征酚類物質(zhì)，結(jié)合Swiss Target Prediction和Genecards數(shù)據(jù)庫篩選特征酚類物質(zhì)治療AD、癌癥和糖尿病3種疾病的潛在作用靶點(diǎn)，采用String平臺(tái)構(gòu)建蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，再用Cytoscape軟件分析特征酚類物質(zhì)與以上3種疾病作用的共同核心靶點(diǎn)，并篩選出其中的主要活性組分；通過David數(shù)據(jù)庫對(duì)共同核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信號(hào)通路富集分析；使用Autodock vina和PyMol軟件對(duì)主要活性組分和共同核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。桑葉體外消化（或發(fā)酵）各階段共檢測(cè)到19種特征酚類物質(zhì)，其中主要活性組分為咖啡酸、槲皮素和山柰酚。特征酚類物質(zhì)與3種疾病交集靶點(diǎn)的共同靶點(diǎn)有48種。PPI得出特征酚類物質(zhì)對(duì)3種疾病作用的10個(gè)共同核心靶點(diǎn)（AKT1、TNF、EGFR、PTGS2、SRC、TLR4、CASP3、ESR1、STAT3和MMP9）。對(duì)核心靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，得到120個(gè)生物過程、11個(gè)細(xì)胞組分、14個(gè)分子功能和35條信號(hào)通路，其中炎癥相關(guān)通路占比最高。主要活性組分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接模擬后，結(jié)合能均小于?5 kcal/mol。桑葉不同體外消化（發(fā)酵）過程中產(chǎn)生的特征酚類物質(zhì)可能通過抑制慢性炎癥反應(yīng)對(duì)AD、癌癥和糖尿病3種疾病起到治療效應(yīng)。

桑葉；阿爾茨海默?。惶悄虿?；癌癥；體外消化；腸道微生物發(fā)酵；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；咖啡酸；槲皮素；山柰酚

桑樹L.為?？粕僦参?，在我國(guó)有5000多年栽培史，分布廣泛，遍及全國(guó)，桑葉為桑樹的干燥葉，屬藥食同源植物[1]。作為一種重要的中藥材，桑葉的藥用價(jià)值在《神農(nóng)百草經(jīng)》《本草綱目》和《唐本草》等醫(yī)學(xué)古籍中均有記載?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，桑葉中含有多種化合物，包括酚類、生物堿、植物甾醇等[2]。酚類物質(zhì)為桑葉主要活性物質(zhì)，是一種天然抗氧化劑，可降低自由基對(duì)機(jī)體的毒性[3]。桑葉具有降血糖、調(diào)血脂、抗氧化、抗炎、抗衰老以及抗癌等作用[2]。

糖尿病、癌癥和阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）等慢性疾病是老年人健康受損的主要原因，研究表明，這些慢性疾病之間存在諸多關(guān)聯(lián)。糖尿病等代謝性疾病對(duì)于AD具有深刻的影響，可通過多種途徑導(dǎo)致淀粉樣斑塊、神經(jīng)纖維纏結(jié)和AD其他癥狀的積聚[4]。同時(shí)，糖尿病患者較一般人群具有更高的癌癥發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)[5]，Meta分析研究表明用于治療2型糖尿病的一線藥物二甲雙胍能降低多種癌癥發(fā)病率和死亡率[6]。而癌癥與AD之間的關(guān)系則更具復(fù)雜性，一方面，大量流行病學(xué)研究表明，癌癥與AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)；另一方面，癌癥與AD的危險(xiǎn)因素中又存在大量重疊，如年齡和慢性炎癥等[7]。已有研究表明桑葉對(duì)于人體肥胖和糖尿病具有防治作用[8-9]，而桑葉對(duì)于AD和癌癥的作用及其機(jī)制的研究尚不完善。

本研究基于體外模擬消化、發(fā)酵和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討桑葉酚類物質(zhì)對(duì)AD、癌癥和糖尿病3種疾病的潛在治療作用，探尋桑葉特征酚類物質(zhì)作用于3種疾病的共同靶點(diǎn)和作用機(jī)制，從而為實(shí)現(xiàn)桑葉治療多種疾病提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

液相色譜-G6500系列四極桿-飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；YQX-Ⅱ厭氧培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司）；α-淀粉酶（A298990）、胃蛋白酶（P110928）、阿拉伯半乳聚糖（A304929）、酪蛋白（C288596）、瓜爾豆膠（G109238）、木聚糖（X140487）、-半胱氨酸（C108237）等購于上海阿拉丁公司；胰酶（T8151）和豬膽鹽（G8310）購于北京索萊寶科技有限公司；色譜純乙腈、乙酸和甲酸購于德國(guó)Merck公司；新鮮桑葉采自江西省蠶桑茶葉研究所桑樹品種園，經(jīng)南昌大學(xué)陳芳副教授鑒定為桑L. 的干燥葉，經(jīng)冷凍干燥后粉碎過60目篩得凍干桑葉粉。

1.2 體外模擬口腔-胃-腸道消化

參照Hu等[10]的方法進(jìn)行體外模擬消化。取1 g凍干桑葉粉，依次加模擬口腔消化工作液、α-淀粉酶和氯化鈣進(jìn)行模擬口腔消化，5 min后模擬口腔消化結(jié)束；再加入模擬胃消化工作液、胃蛋白酶和氯化鈣并調(diào)節(jié)pH 3.0進(jìn)行模擬胃消化，2 h后模擬胃消化結(jié)束；加入小腸消化工作液、胰蛋白酶、豬膽鹽和氯化鈣并調(diào)節(jié)pH 7.0進(jìn)行2 h模擬小腸消化。將各階段得到的模擬消化產(chǎn)物4000 r/min離心10 min，上清液為各階段消化液，沉淀為消化渣。分別取2 mL各階段消化液，加入同等體積的無水乙醇，0.22 μm濾膜濾過后測(cè)定酚類化合物。

1.3 體外腸道微生物發(fā)酵

參考Hu等[10]的方法進(jìn)行體外腸道微生物發(fā)酵。取上述模擬小腸消化渣0.2 g，加入生長(zhǎng)培養(yǎng)基和糞便菌懸液后37 ℃厭氧培養(yǎng)，分別于發(fā)酵0、1、3、6、12和24 h時(shí)收集2 mL發(fā)酵液，加入乙腈終止反應(yīng)后加入等體積70%乙醇，超聲后4500 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm濾膜濾過后測(cè)定酚類化合物。

1.4 各消化（或發(fā)酵）階段桑葉酚類物質(zhì)的定性分析

采用UPLC-QTOF-MS/MS對(duì)桑葉體外模擬消化（或發(fā)酵）各階段產(chǎn)生的酚類物質(zhì)進(jìn)行定性分析。

1.4.1 色譜條件 Eclipse Plus C18色譜柱（100 mm×1.8 mm，3 μm）；流動(dòng)相為0.1%甲酸水溶液（A）和乙腈（B），洗脫梯度：0～8 min，10%～15% B；8～20 min，15%～35% B；20～24 min，35%～50% B；24～28 min，50%～70% B；28～33 min，70%～10% B；進(jìn)樣量5 μL；體積流量0.34 mL/min。

1.4.2 質(zhì)譜條件 一級(jí)質(zhì)譜（MS）參數(shù)：電噴霧離子源，氣簾氣275.8 kPa，霧化氣和輔助氣344.7 kPa，離子源溫度550 ℃，噴霧電壓?4500 V，去簇電壓80 V，碰撞能10 eV，負(fù)離子IDA模式掃描（/100～1700）采集數(shù)據(jù)；二級(jí)質(zhì)譜（MS2）參數(shù)：去簇電壓80 V，碰撞能（30±15）eV，負(fù)離子模式掃描（/50～1000）采集碎片離子[11]。

分析各消化液（或發(fā)酵液）的總離子流圖，利用高分辨質(zhì)譜的精確相對(duì)分子質(zhì)量信息推測(cè)化合物的分子式，參照文獻(xiàn)報(bào)道的各類化合物裂解規(guī)律與碎片信息，與二級(jí)質(zhì)譜的碎片信息進(jìn)行比對(duì)，鑒定出桑葉體外模擬消化（或發(fā)酵）各階段產(chǎn)生的酚類物質(zhì)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

根據(jù)質(zhì)譜化合物成分分析，鑒定桑葉體外消化及腸道微生物發(fā)酵過程中各階段的特征酚類物質(zhì)。通過PubChem數(shù)據(jù)庫[12]（https://pubchem.i.nlm.nih. gov/）和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫[13]（http:// www.swisstargetprediction.ch/）篩選后（probability＞0）獲得化合物靶點(diǎn)。通過Genecards數(shù)據(jù)庫[14]（https://www.genecards.org/）搜索“cancer”“Alzheimer’s disease”和“diabetes mellitus”，篩選后（score≥7）獲得疾病靶點(diǎn)。

將特征酚類物質(zhì)靶點(diǎn)分別與癌癥、AD和糖尿病靶點(diǎn)利用Venny2.1（https://bioinfogp.cnb.csic.es/ tools/venny/）取交集，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，分析構(gòu)建“酚類物質(zhì)-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)，鑒定出主要活性酚類物質(zhì)。

將特征酚類物質(zhì)靶點(diǎn)與3種疾病的交集靶點(diǎn)，輸入至String數(shù)據(jù)庫中，設(shè)定物種為“HOMO sapiens”，導(dǎo)出蛋白互作文件并將其導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0軟件，構(gòu)建特征酚類物質(zhì)與疾病交集靶點(diǎn)的蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction，PPI），按照度（degree）≥2倍中位數(shù)篩選核心靶點(diǎn)。

利用DAVID數(shù)據(jù)庫[15]對(duì)特征酚類物質(zhì)與癌癥、AD和糖尿病3種疾病的核心靶點(diǎn)中重合部分進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）功能富集和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。

1.6 分子對(duì)接

將上述主要活性酚類物質(zhì)分別與共同核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接。在PubChem數(shù)據(jù)庫（https://pubchem. ncbi.nlm.nih.gov）下載主要活性酚類物質(zhì)2D結(jié)構(gòu)，并將其導(dǎo)入Chem3D轉(zhuǎn)為最小鍵能的3D結(jié)構(gòu)，同時(shí)在RCSB數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org）獲取核心靶點(diǎn)蛋白3D結(jié)構(gòu)，使用Autodock Tools 1.5.7和Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，得到結(jié)合能數(shù)據(jù)，并與靶點(diǎn)和其自身配體的結(jié)合能數(shù)據(jù)進(jìn)行比較后進(jìn)行評(píng)價(jià)；使用Pymol 2.3.4對(duì)對(duì)接結(jié)果進(jìn)行可視化。

2 結(jié)果

2.1 桑葉在體外模擬消化和腸道微生物發(fā)酵過程中特征酚類物質(zhì)的鑒定

由于模擬口腔消化時(shí)間較短（僅為5 min），前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模擬口腔消化后的酚類物質(zhì)與消化前幾乎沒有變化，主要的變化均在模擬胃、腸消化及體外微生物發(fā)酵過程發(fā)生，因此沒有檢測(cè)模擬口腔消化上清液中的酚類物質(zhì)。在相同色譜、質(zhì)譜條件下，根據(jù)保留時(shí)間、精確相對(duì)分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜裂解碎片來鑒定和推測(cè)特征酚類物質(zhì)。正、負(fù)離子模式掃描下，共鑒定出19種特征酚類物質(zhì)，如表1所示。其中，咖啡醌、槲皮素和山柰酚在體外發(fā)酵階段才出現(xiàn)，由綠原酸、蘆丁、異槲皮素及紫云英苷等分解而來。

2.2 藥物-疾病交集靶點(diǎn)

通過PubChem數(shù)據(jù)庫和Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫獲取特征酚類物質(zhì)的靶點(diǎn)（probability＞0），除重后共計(jì)221個(gè)。通過Genecards數(shù)據(jù)庫搜索疾病靶點(diǎn)，設(shè)置篩選條件為score≥7，獲得癌癥、AD和糖尿病的相關(guān)靶點(diǎn)分別為1862、2307和1081個(gè)。

將特征酚類物質(zhì)靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny網(wǎng)站取交集，如圖1-A～C所示，獲得特征酚類物質(zhì)與AD、癌癥和糖尿病的交集靶點(diǎn)分別為113、102和77個(gè)。如圖1-D所示，將特征酚類物質(zhì)與3種疾病的交集靶點(diǎn)再取交集，得到特征酚類物質(zhì)對(duì)3種疾病的共同作用靶點(diǎn)，共計(jì)48個(gè)。

表1 桑葉在體外模擬消化和腸道微生物發(fā)酵過程中主要酚類成分的鑒定

G-模擬胃消化上清液 I-模擬腸消化上清液 F-體外腸道微生物發(fā)酵液（發(fā)酵液所有取樣時(shí)段中只要有一個(gè)時(shí)段檢測(cè)到即視為含有）

G-simulated gastric digestion supernatant I-simulated intestinal digestion supernatant F-intestinal microbial fermentation broth (considered to be contained if detected in one of all sampling periods)

A～C-特征酚類物質(zhì)分別與AD、癌癥和糖尿病的交集靶點(diǎn) D-特征酚類物質(zhì)對(duì)3種疾病的共同作用靶點(diǎn)

2.3 藥物-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)

將特征酚類物質(zhì)與疾病預(yù)測(cè)靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape繪制特征酚類物質(zhì)-預(yù)測(cè)靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，如圖2-A～C所示。按度值≥2倍中位數(shù)篩選出主要活性成分：咖啡酸（SY3）、槲皮素（SY18）和山柰酚（SY19）。

2.4 藥物-疾病交集靶點(diǎn)PPI網(wǎng)絡(luò)

如圖3-A所示，AD與特征酚類物質(zhì)的交集蛋白共113個(gè)，通過String數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件分析得到核心靶點(diǎn)（度值≥2倍中位數(shù)）：絲氨酸/蘇氨酸激酶1（serine/threonine-protein kinase 1，AKT1）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、酪氨酸蛋白激酶（non-receptor tyrosine kinase，SRC）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、胱天蛋白酶3（caspase-3，CASP3）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、雌激素受體α（estrogen receptor 1，ESR1）、PTGS2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，前列腺素內(nèi)過氧化物合酶 2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen-activated protein kinase 1，MAPK1）、Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，ERBB2）、磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸3-激酶催化亞基α（phosphatidylinositol- 4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha，PIK3CA）。如圖3-B所示，癌癥與特征酚類物質(zhì)的交集靶點(diǎn)共102個(gè)，核心靶點(diǎn)為AKT1、TNF、EGFR、CASP3、ESR1、SRC、STAT3、ERBB2、PTGS2、MMP9、MAPK1、PIK3CA、TLR4。如圖3-C所示，糖尿病與特征酚類物質(zhì)的交集靶點(diǎn)共77個(gè)，核心靶點(diǎn)為AKT1、TNF、EGFR、PTGS2、SRC、TLR4、CASP3、ESR1、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor α，PPARA）、STAT3、MMP9。特征酚類物質(zhì)可能作用于3種疾病的共同核心靶點(diǎn)（后稱共同核心靶點(diǎn)）：AKT1、TNF、EGFR、PTGS2、SRC、TLR4、CASP3、ESR1、STAT3、MMP9。

A～C-特征酚類物質(zhì)分別與AD、癌癥和糖尿病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

A～C-特征酚類物質(zhì)分別與AD、癌癥和糖尿病的交集靶點(diǎn)PPI

2.5 GO功能與KEGG信號(hào)通路富集分析

利用DAVID對(duì)共同核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，以＜0.05為篩選條件獲得生物過程（biological process，BP）、細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）分別為120、11、14條。由圖4可知，特征酚類物質(zhì)對(duì)共同核心靶點(diǎn)的BP多富集在一氧化氮生物合成過程的正調(diào)節(jié)（positive regulation of nitric oxide biosynthetic process）、凋亡過程的調(diào)節(jié)（regulation of apoptotic process）、活性氧的細(xì)胞反應(yīng)（cellular response to reactive oxygen species）等；CC主要為膜筏（membrane raft）、大分子復(fù)合物（macromolecular complex）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、質(zhì)膜（plasma membrane）等；MF主要為一氧化氮合酶調(diào)節(jié)器活性（nitric-oxide synthase regulator activity）、酶結(jié)合（enzyme binding）、蛋白質(zhì)結(jié)合（protein binding）等。

圖4 桑葉酚類物質(zhì)對(duì)3種疾病作用的共同核心靶點(diǎn)GO分析

利用DAVID對(duì)共同核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號(hào)通路富集，以＜0.05為篩選條件，得到35條信號(hào)通路，主要與癌癥、炎癥、感染、糖尿病、AD等有關(guān)。由圖5可知，共同核心靶點(diǎn)的主要信號(hào)通路顯著富集在TNF信號(hào)通路（TNF signaling pathway）、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路（interleukin-17 signaling pathway）、核因子-κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）信號(hào)通路（NF-kappa B signaling pathway）和Toll樣受體信號(hào)通路（Toll-like receptor signaling pathway）等炎癥相關(guān)通路。

2.6 分子對(duì)接

將主要活性組分咖啡酸、槲皮素和山柰酚分別與共同核心靶點(diǎn)AKT1（7NH5）、TNF-α（6X85）、EGFR（1IVO）、PTGS2（5F1A）、SRC（1FMK）、TLR4（2Z62）、CASP3（1GFW）、ESR1（1ERE）、STAT3（6TLC）、MMP9（1L6J）進(jìn)行分子對(duì)接。共30組對(duì)接結(jié)果，所有組合對(duì)接結(jié)合能均小于?5 kcal/mol（1 kcal＝4.2 kJ），小于?7 kcal/mol的對(duì)接組合有23組，占所有對(duì)接組合的76.7%，其中結(jié)合能最低的是AKT1-槲皮素（?10.4 kcal/mol），結(jié)合能最高的是CASP3-咖啡酸（?5.8 kcal/mol）；所有組合平均結(jié)合能為?7.78 kcal/mol。對(duì)接評(píng)分結(jié)果如圖6所示，與相應(yīng)靶點(diǎn)自身配體結(jié)合能相比，咖啡酸、槲皮素和山柰酚與10個(gè)共同核心靶點(diǎn)都具有較好結(jié)合活性，可為進(jìn)一步研究提供數(shù)據(jù)支撐。選取每種酚類物質(zhì)與靶點(diǎn)自身配體結(jié)合能之比最高的蛋白展示其對(duì)接位點(diǎn)，分別是咖啡酸與MMP9、山柰酚與AKT1和槲皮素與AKT1，見圖7?？Х人崤cMMP9通過其殘基TYR-420、THR-426、PRO-430相互作用；山柰酚與AKT1通過其殘基ASN-204、SER-205、THR-291相互作用；槲皮素與AKT1通過其殘基ASN-204、SER-205、THR-211及ILE-290相互作用。

圖5 桑葉酚類物質(zhì)對(duì)3種疾病作用的共同核心靶點(diǎn)KEGG分析

3 討論

AD、癌癥和糖尿病作為衰老相關(guān)性疾病，對(duì)人類健康造成了極大威脅，面對(duì)日益加重的人口老齡化社會(huì)問題，衰老相關(guān)性疾病的疾病負(fù)擔(dān)將越來越沉重。許多研究表明，慢性炎癥與AD、癌癥和糖尿病之間存在正相關(guān)關(guān)系。慢性炎癥對(duì)癌癥的發(fā)展起促進(jìn)作用，同時(shí)慢性炎癥在AD中能增強(qiáng)神經(jīng)元細(xì)胞死亡和腦組織變性[7]，低等程度慢性炎癥能誘導(dǎo)胰島素抵抗從而引發(fā)2型糖尿病[16]。而現(xiàn)有大量研究表明，桑葉具有抗炎、抗衰老作用，同時(shí)對(duì)糖尿病和AD等疾病具有治療效應(yīng)。為了探索桑葉對(duì)于AD、癌癥和糖尿病3種疾病的可能作用機(jī)制，本研究利用模擬體外消化、腸道微生物發(fā)酵和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析進(jìn)行了探究。

經(jīng)分析，在桑葉各消化（或發(fā)酵）階段檢測(cè)到的特征酚類物質(zhì)有19種，其中主要活性組分為槲皮素、山柰酚和咖啡酸。特征酚類物質(zhì)對(duì)3種疾病作用的共同核心靶點(diǎn)共10個(gè)：AKT1、TNF、EGFR、PTGS2、SRC、TLR4、CASP3、ESR1、STAT3、MMP9，其中除STAT3和ESR1外，其他靶點(diǎn)都是為人熟知的炎癥相關(guān)靶點(diǎn)，而STAT3也被報(bào)道與NF-κB信號(hào)通路一起將炎癥與癌癥聯(lián)系起來[17]。共同核心靶點(diǎn)KEGG分析結(jié)果中炎癥相關(guān)通路占比較大，如TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路和Toll樣受體信號(hào)通路等，同時(shí)大量研究報(bào)道桑葉具有抗炎作用，這可能是桑葉治療3種疾病的關(guān)鍵。

圖6 主要酚類物質(zhì)與核心靶點(diǎn)分子對(duì)接熱圖

研究表明，咖啡酸可能通過AKT1、MMP9、TLR4、ESR1、STAT3、PTGS2和EGFR等靶點(diǎn)作用于AD、癌癥和糖尿病，如圖6所示，咖啡酸與這些蛋白結(jié)合良好。已有研究表明，咖啡酸及其衍生物對(duì)于炎癥具有良好的治療效應(yīng)，其機(jī)制包括靶向NF-κB、COX-2（PTGS2）等靶點(diǎn)[18-19]。此外，咖啡酸及其衍生物還能通過解聚成熟纖維而抑制AD[20]，可通過提高活性氧水平（BP富集結(jié)果之一）和損害線粒體功能誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[21]，以及通過抑制MMP9和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）（KEGG信號(hào)通路富集結(jié)果之一）的表達(dá)抑制癌細(xì)胞的上皮細(xì)胞間充質(zhì)化以及癌癥新生血管生成[22-23]，從而有利于抑制腫瘤的侵襲。同時(shí)咖啡酸還可以通過作用于AKT1，調(diào)節(jié)改善2型糖尿病及其并發(fā)癥癥狀[24-25]。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析得知槲皮素可能通過SRC、EGFR、CASP3、MMP9、PTGS2和AKT1等靶點(diǎn)作用于AD、癌癥和糖尿病，分子對(duì)接結(jié)果也顯示槲皮素與這些靶點(diǎn)具有較低的結(jié)合能。現(xiàn)有研究表明，槲皮素具有強(qiáng)大的抗炎、抗癌作用，主要通過靶向CASP3、MMPs、AKT等靶點(diǎn)，減少細(xì)胞內(nèi)活性氧、促進(jìn)凋亡、誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的M2極化、抑制細(xì)胞侵襲遷移和血管生成等機(jī)制發(fā)揮作用[26-28]。槲皮素也具有抗AD作用，主要通過抑制淀粉樣β蛋白原纖維形成，對(duì)抗細(xì)胞裂解和炎癥級(jí)聯(lián)途徑實(shí)現(xiàn)[29]。槲皮素還可以通過降低COX2（PTGS2）等炎癥相關(guān)蛋白表達(dá)改善2型糖尿病及其并發(fā)癥癥狀[30]。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析結(jié)果顯示，山柰酚可能通過AKT1、MMP9、EGFR等靶點(diǎn)作用于3種疾病，其與這些蛋白分子對(duì)接結(jié)果也顯示親和性良好。山柰酚在體內(nèi)外均表現(xiàn)出了活躍的抗炎特性[31]，同時(shí)還具有強(qiáng)大的抗癌能力[32]，能夠抑制AKT1磷酸化介導(dǎo)的上皮-間質(zhì)化轉(zhuǎn)換（epithelial-mesenchymal transition，EMT），從而抑制肺癌細(xì)胞遷移和侵襲[33]。山柰酚還能提高谷氨酸能和膽堿能神經(jīng)元的存活率和功能性，消除淀粉樣β和tau蛋白異常，治療AD[34]，也可以促進(jìn)胰高糖素樣肽-1（glucagon-like peptide-1，GLP-1）和胰島素釋放以治療小鼠糖尿病[35]。

桑葉特征酚類物質(zhì)中的3種主要活性組分都具有較強(qiáng)抗炎作用，本研究的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)結(jié)果與現(xiàn)有研究均證明這3種物質(zhì)均具有抗AD、癌癥和糖尿病的作用。桑葉特征酚類物質(zhì)作用于3種疾病的共同核心靶點(diǎn)與部分KEGG富集通路之間的關(guān)系見圖8，絕大多數(shù)共同核心靶點(diǎn)都與炎癥通路相關(guān)，而這些靶點(diǎn)也分別參與3種疾病的調(diào)控。而大量研究表明，慢性炎癥與AD、癌癥和糖尿病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[36]，因此，桑葉特征酚類物質(zhì)可能是通過抑制慢性炎癥來抑制AD、癌癥及糖尿病的發(fā)生發(fā)展。

圖8 特征酚類物質(zhì)對(duì)AD、癌癥和糖尿病的可能作用機(jī)制

目前，桑葉治療糖尿病的作用較多，而桑葉對(duì)于AD和癌癥的研究較少，本研究提示桑葉對(duì)于AD和癌癥的作用及機(jī)制值得探究。同時(shí)3種疾病中出現(xiàn)的大量重合靶點(diǎn)，提示同一機(jī)制在3種疾病中可能存在不同作用，這也值得進(jìn)一步探究。

4 結(jié)論

本研究通過體外模擬消化及腸道微生物發(fā)酵及網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析發(fā)現(xiàn)桑葉體外消化（發(fā)酵）過程中產(chǎn)生的特征酚類物質(zhì)包括咖啡酸、槲皮素和山柰酚等，對(duì)AD、癌癥和糖尿病這3種疾病均可能具有治療效應(yīng)，這可能是通過作用于AKT1、TNF、EGFR、PTGS2、SRC、TLR4、CASP3、ESR1、STAT3、MMP9等靶點(diǎn)抑制炎癥反應(yīng)達(dá)到的，為實(shí)現(xiàn)桑葉治療多種疾病提供了理論依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Investigation of potential biological activity of phenols frombased onsimulated digestion, fermentation and network pharmacology

HUANG Qing-xin1, LIU Ting1, HU Qi-rui2, ZHANG Xu1, PAN Yao1, YU Yan-fang3, FENG Jian-gao1, LI Xiao-ping3, DENG Ze-yuan2, CHEN Fang1

1. Jiangxi Provincial Key Laboratory of Preventive Medicine, School of Public Health, Nanchang University, Nanchang 330006, China 2. State Key Laboratory of Food Science and Technology, Nanchang University, Nanchang 330029, China 3. Economic Crops Research Institute of Jiangxi Province, Nanchang 330202, China

To explore the potential synergistic targets of phenolsfrom Sangye () for Alzheimer’s disease (AD), cancer and diabetes mellitus based on thesimulated digestion, fermentation and network pharmacology, to provid the theoretical basis in the treatment of various diseases with.After freeze-dried and pulverized, the freshwere used fordigestion and intestinal microbial fermentation process. Different products from digestion (or fermentation) stage were analyzed to screen out the characteristic phenolic substances by UPLC-Q-TOF-MS/MS. The Swiss Target Prediction and Genecards database were used to screen the potential targets of characteristic phenolic substances in the treatment of AD, cancer and diabetes mellitus. The String platform was used to establish a protein-protein interaction (PPI) network diagram. Then the common key targets between the characteristic phenolic substances and the three diseases were analyzed by Cytoscape, and the main active components were screened out. The gene ontology (GO) function and Kyoto encyclopedia of genes and genomes (KEGG) signaling pathway enrichment analysis of the common core targets were performed on the David database. Finally, the molecular docking of the main active components and common core targets was performed via Autodock vina and PyMol.A total of 19 characteristic phenolic substances were detected indigestion (or fermentation) stage of, and the main active components were caffeic acid, quercetin and kaempferol. There were 48 common targets among the characteristic phenolic substances and the three diseases. Ten common core targets (AKT1, TNF, EGFR, PTGS2, SRC, TLR4, CASP3, ESR1, STAT3 and MMP9) between the characteristic phenolic substances and the three diseases were obtained from PPI analysis. After enrichment analysis of common core targets were performed, then 120 biological processes, 11 cell components, 14 molecular functions and 35 signaling pathways were screened out, in which inflammation-related pathways accounted for the highest proportion. The binding energy between the main active components and common core targets were lower than ?5 kcal/mol during the molecular docking.The characteristic phenolic substances produced during differentdigestion (fermentation) ofmay exert therapeutic effects on AD, cancer and diabetes, which may be mediated by inhibiting chronic inflammation.

; Alzheimer’s disease; diabetes mellitus; cancer;digestion; fermentation of intestinal microorganisms; network pharmacology; caffeic acid; quercetin; kaempferol

R284；R285

A

0253 - 2670(2023)10 - 3205 - 11

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.018

2022-12-19

江西省技術(shù)創(chuàng)新引導(dǎo)類計(jì)劃項(xiàng)目（20212BDH81028）

黃青昕，女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹参锘瘜W(xué)物的生物活性及其作用機(jī)制。E-mail: xluo45@qq.com

陳 芳，女，博士，副教授，主要研究方向?yàn)槭称窢I(yíng)養(yǎng)與健康、植物化學(xué)物的生物活性及其作用機(jī)制。E-mail: xinganchenfang@163.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]