李建超，鐘 穎，李榮榮，宋緒鈺，黃娜娜，孫 蓉, 3*

基于肝脂調(diào)控為核心的中藥調(diào)血脂活性和評(píng)價(jià)方法研究

李建超1, 2，鐘 穎2，李榮榮1, 2，宋緒鈺2，黃娜娜2，孫 蓉2, 3*

1. 山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟(jì)南 250355 2. 山東大學(xué)第二醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250033 3. 山東大學(xué)高等醫(yī)學(xué)研究院，山東 濟(jì)南 250012

構(gòu)建適宜于評(píng)價(jià)中藥以“肝脂調(diào)控”為核心的調(diào)血脂活性和評(píng)價(jià)的“多細(xì)胞來源”“穩(wěn)定性好”的非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）體外細(xì)胞模型，以利于精準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)中藥脂代謝調(diào)控活性物質(zhì)并評(píng)價(jià)其調(diào)血脂藥理學(xué)作用特征。選擇人肝癌HepG2細(xì)胞系及小鼠肝實(shí)質(zhì)AML12細(xì)胞系，對(duì)造模試劑（油酸及棕櫚酸）、造模方法、作用濃度以及作用時(shí)間和溶媒選擇進(jìn)行文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)研究，并以CCK-8及油紅O實(shí)驗(yàn)確定最佳造模濃度，進(jìn)而循形人體肝脂代謝輪廓，采用Western blotting法檢測(cè)細(xì)胞中脂代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，作為模型評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)。經(jīng)文獻(xiàn)和實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，10%無脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid free bovine serum albumin，BSA）為油酸溶媒，20% BSA為棕櫚酸溶媒穩(wěn)定性好；500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸（體積比2∶1）造模，作用24 h，可顯著增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累（＜0.001），且不影響細(xì)胞活性，證明造模成功；單獨(dú)使用棕櫚酸造模，對(duì)2種細(xì)胞損傷都較大，模型不適宜于調(diào)血脂物質(zhì)發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)；500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸造模后，脂肪從頭合成相關(guān)蛋白固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP-1）、乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）及脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）的表達(dá)無顯著變化，脂肪分解相關(guān)蛋白三酰甘油脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）的表達(dá)顯著升高（＜0.05、0.001），激素敏感脂肪酶（hormone sensitive lipase，HSL）的磷酸化顯著降低（＜0.05、0.01），脂肪酸氧化相關(guān)蛋白過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）的表達(dá)無顯著差異，肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A）的表達(dá)顯著增加（＜0.05）。500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸（體積比2∶1）造模24 h，均可顯著增加HepG2、AML12細(xì)胞中的脂質(zhì)積累，成功構(gòu)建NAFLD體外細(xì)胞模型，且具有穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、高效的特點(diǎn)。

肝脂代謝；體外模型；非酒精性脂肪性肝?。挥坞x脂肪酸；油酸；棕櫚酸

脂代謝功能紊亂是指長(zhǎng)期能量攝入與代謝失衡導(dǎo)致大量脂質(zhì)堆積，引起內(nèi)分泌環(huán)境紊亂和異位脂質(zhì)積累，導(dǎo)致脂毒性代謝應(yīng)激，進(jìn)而促進(jìn)肝臟、脂肪組織和骨骼肌等靶器官的代謝功能失調(diào)與慢性炎癥[1]。肝臟是參與脂肪代謝的主要器官，作為脂質(zhì)平衡的中心調(diào)節(jié)器，是脂蛋白攝取、形成、輸出和循環(huán)的主要加工中心[2-3]。非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver diseases，NAFLD）是指5%～10%的肝細(xì)胞出現(xiàn)大泡狀脂肪變性，或肝內(nèi)三酰甘油（triglyceride，TG）質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過5.5%[4]。NAFLD已經(jīng)發(fā)展成為全球最常見的慢性肝病，且增長(zhǎng)迅速，約25%的人口患有NAFLD[5-6]。近年來，我國(guó)的NAFLD發(fā)病率明顯上升，已成為僅次于病毒性肝炎的第二大肝病。高發(fā)病率的NAFLD嚴(yán)重影響了人類的生活健康，給社會(huì)造成沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。因此，有效調(diào)控肝脂代謝穩(wěn)態(tài)的治療手段在當(dāng)下社會(huì)顯得愈發(fā)重要[6]。

中醫(yī)本無NAFLD的病名，其最早記載于《難經(jīng)》中，屬于中醫(yī)“肝癖”“痰證”“脅痛”“積聚”等范疇，調(diào)肝化濁、健脾利濕、養(yǎng)血柔肝等是其有效治法[7-10]。鑒于目前西醫(yī)臨床針對(duì)NAFLD尚缺乏特效治療策略，亟需在中醫(yī)藥臨床豐富的有效經(jīng)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)并開發(fā)創(chuàng)新中藥。目前NAFLD動(dòng)物模型制備存在造模時(shí)間長(zhǎng)、價(jià)格昂貴現(xiàn)象，不適宜于中藥調(diào)控肝脂代謝的活性成分高效篩選，體外細(xì)胞模型構(gòu)建方法統(tǒng)一性較差，如細(xì)胞系選擇、油酸及棕櫚酸造模濃度、單用還是合用、溶媒選擇、造模時(shí)間及評(píng)價(jià)指標(biāo)等方面，文獻(xiàn)各不相同，差異較大。因此，亟需建立與臨床發(fā)病機(jī)制相吻合、適宜于以“肝脂調(diào)控”為核心的中藥調(diào)血脂活性和評(píng)價(jià)方法研究，且不同細(xì)胞來源的穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)、高效的NAFLD體外細(xì)胞模型，以更好地適應(yīng)創(chuàng)新中藥發(fā)現(xiàn)、不同藥理學(xué)特征的評(píng)價(jià)研究，也為建立統(tǒng)一的模型標(biāo)準(zhǔn)提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 細(xì)胞系

小鼠肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞AML12細(xì)胞系購自中國(guó)科學(xué)院干細(xì)胞庫，人肝癌HepG2細(xì)胞系購自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 藥品與試劑

油酸（批號(hào)30138518）、棕櫚酸（批號(hào)30139518）購自上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；青霉素-鏈霉素（批號(hào)S110JV）、DMEM/F12（1∶1）培養(yǎng)基（批號(hào)L310KJ）、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑（批號(hào)S450J7）購自上海源培生物科技股份有限公司；DMEM培養(yǎng)基（批號(hào)C11995500BT）、胎牛血清（批號(hào)A3160801）購自美國(guó)Gibco公司；地塞米松（批號(hào)D1756）、油紅O（批號(hào)O0625）購自美國(guó)Sigma公司；無脂肪酸牛血清白蛋白（fatty acid free bovine serum albumin，BSA，批號(hào)ST025）、蛋白酶抑制劑混合物（批號(hào)P1050-1）、磷酸酶抑制劑混合物（批號(hào)P1050-2）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；CCK-8試劑盒（A311-02）、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒（批號(hào)E112-01）、高敏型ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒（批號(hào)E412-01）購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；TG測(cè)定試劑盒（批號(hào)A110-1-1）購自南京建成生物工程研究所；酮體含量檢測(cè)試劑盒（批號(hào)BC5065）購自北京索萊寶科技有限公司；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1（sterol regulatory element-binding protein-1，SREBP-1）一抗（批號(hào)ab28481）、過氧化物酶體增殖物激活受體α（peroxisome proliferator-activated receptor alpha，PPARα）一抗（批號(hào)ab126285）、肉堿棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶1A（carnitine palmitoyl transferase 1A，CPT1A）一抗（批號(hào)ab234111）購自英國(guó)Abcam公司；乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）一抗（批號(hào)3676S）、脂肪酸合酶（fatty acid synthase，F(xiàn)ASN）一抗（批號(hào)3180S）、三酰甘油脂肪酶（adipose triglyceride lipase，ATGL）一抗（批號(hào)2138S）、激素敏感脂肪酶（hormone sensitive lipase，HSL）一抗（批號(hào)4107S）、磷酸化HSL（phosphorylated HSL，p-HSL）一抗（批號(hào)45804S）購自美國(guó)CST公司；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）一抗（批號(hào)20536-1-AP）購自美國(guó)Proteintech公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（批號(hào)GB23303）購自武漢賽維爾生物科技有限公司。

1.3 儀器

精密電子天平（瑞士梅特勒-托利多有限公司）；CKX53型倒置生物顯微鏡（日本Olympus公司）；HH-S型恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器廠）；5200型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（上海天能科技有限公司）；Multiskan Go-1510型全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀、3111型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；SDS PAGE凝膠電泳及轉(zhuǎn)膜電泳儀（美國(guó)Bio-Rad公司）。

2 方法

2.1 文獻(xiàn)檢索

檢索中國(guó)知網(wǎng)（CNKI）中以HepG2為細(xì)胞模型，研究中藥調(diào)血脂活性的期刊文獻(xiàn)，以“NAFLD”“HepG2”為主題詞，時(shí)間為2018年1月1日至2023年2月4日；以“NAFLD”“HepG2”“Traditional Chinese Medicine”為主題詞在PubMed數(shù)據(jù)庫中搜索近5年文獻(xiàn)，通過閱讀標(biāo)題與摘要首先排除與中藥、中藥方劑及中藥活性成分研究無關(guān)的文獻(xiàn)；然后進(jìn)行全文閱讀，篩選出明確標(biāo)識(shí)造模方法的文獻(xiàn)納入統(tǒng)計(jì)。

2.2 油酸、棕櫚酸儲(chǔ)存液的配制

將油酸加入到0.1 mol/L NaOH溶液中，置于75 ℃水浴鍋中皂化30 min，得20 mmol/L油酸溶液，之后加入到等體積的20% BSA溶液中充分混勻，得10 mmol/L油酸儲(chǔ)存液（含10% BSA）。

將棕櫚酸加入到0.1 mol/L NaOH溶液中，置于75 ℃水浴鍋中皂化30 min，得40 mmol/L棕櫚酸溶液，之后加入到等體積的40% BSA溶液中充分混勻，得20 mmol/L棕櫚酸儲(chǔ)存液（含20% BSA）。

將儲(chǔ)存液于超凈臺(tái)中過0.22 μm微孔濾膜，置于4 ℃冰箱保存。使用時(shí)用相應(yīng)的細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋至所需濃度，油酸＋棕櫚酸組為油酸與棕櫚酸體積比2∶1配制。

2.3 細(xì)胞培養(yǎng)

AML12細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-硒添加劑、1%青霉素-鏈霉素、40 ng/mL地塞米松的DMEM/F12培養(yǎng)基培養(yǎng)；HepG2細(xì)胞用含10%胎牛血清、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。細(xì)胞于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.4 CCK-8實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于96孔板中，貼壁生長(zhǎng)24 h，設(shè)置對(duì)照組、油酸組、棕櫚酸組和油酸＋棕櫚酸組，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組分別加入125、250、500、800、1000 μmol/L相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用CCK-8試劑盒測(cè)定細(xì)胞活力。

2.5 油紅O實(shí)驗(yàn)

細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于12孔板中，貼壁生長(zhǎng)24 h，設(shè)置對(duì)照組、油酸組和油酸＋棕櫚酸組，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組分別加入125、250、500、800、1000 μmol/L相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。用4%多聚甲醛固定30 min，在60%異丙醇中孵育2 min。然后在37 ℃下用60%油紅O染色20 min，60%異丙醇脫色15 s后，在磷酸鹽緩沖液中漂洗3次。采用倒置生物顯微鏡拍攝圖片。染色后的樣品在100%異丙醇中室溫?fù)u晃30 min，提取油紅O，在510 nm處測(cè)定吸光度（）值。

2.6 TG及酮體含量檢測(cè)

細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于6孔板中，貼壁生長(zhǎng)24 h，設(shè)置對(duì)照組、油酸組和油酸＋棕櫚酸組，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組分別加入500 μmol/L相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。按說明書要求，收取培養(yǎng)基上清液檢測(cè)酮體含量，收集細(xì)胞勻漿檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)TG含量。

2.7 Western blotting檢測(cè)脂代謝相關(guān)蛋白表達(dá)

細(xì)胞以1×106個(gè)/mL接種于6孔板中，貼壁生長(zhǎng)24 h，設(shè)置對(duì)照組、油酸組和油酸＋棕櫚酸組，對(duì)照組僅加入培養(yǎng)基，其余各組分別加入500 μmol/L相應(yīng)藥物，繼續(xù)培養(yǎng)24 h。收集細(xì)胞，加入RIPA緩沖液裂解，使用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂奶粉，封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜；加入二抗，4 ℃孵育1.5 h；最后使用ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒，在全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)中顯影[11]。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

3 結(jié)果

3.1 利用HepG2細(xì)胞建立NAFLD模型的應(yīng)用現(xiàn)狀

HepG2細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞，保留了正常肝細(xì)胞的糖脂代謝功能，是應(yīng)用最廣泛的NAFLD體外模型之一[12]。利用CNKI數(shù)據(jù)庫，以“NAFLD”“HepG2”為主題詞搜索最近5年期刊文獻(xiàn)106條，篩選出與中藥脂代謝研究相關(guān)且明確標(biāo)識(shí)造模方法的文章49篇，利用PubMed數(shù)據(jù)庫，搜索最近5年期刊文獻(xiàn)64條，篩選出有效文章38篇。其中單獨(dú)使用油酸造模的24篇，占28%；單獨(dú)使用棕櫚酸造模的20篇，占23%；使用油酸＋棕櫚酸造模的43篇，占49%。造模所用濃度從100～1000 μmol/L不等。造?；蛟炷Ｍ瑫r(shí)給藥作用時(shí)間多為24 h，約占91%。

3.2 不同濃度脂肪酸對(duì)肝細(xì)胞活性的影響

3.2.1 對(duì)HepG2細(xì)胞活性的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、棕櫚酸、油酸＋棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞，作用24 h，可見不同濃度的脂肪酸均可濃度相關(guān)性地降低HepG2細(xì)胞活力。油酸濃度達(dá)到800 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性顯著降低（＜0.001）。棕櫚酸濃度達(dá)到125 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性顯著降低（＜0.01），說明棕櫚酸對(duì)細(xì)胞的損傷更大。油酸＋棕櫚酸濃度達(dá)到1000 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性才出現(xiàn)顯著降低（＜0.001），說明油酸可一定程度抑制棕櫚酸對(duì)細(xì)胞的傷害（圖1-A）。

3.2.2 對(duì)AML12細(xì)胞活性的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、棕櫚酸、油酸＋棕櫚酸處理AML12細(xì)胞，作用24 h，可見油酸濃度達(dá)到800 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性出現(xiàn)顯著降低（＜0.01）。棕櫚酸濃度達(dá)到500 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性顯著降低（＜0.001）。油酸＋棕櫚酸濃度達(dá)到1000 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性仍沒有表現(xiàn)出顯著降低（圖1-B）。相較于HepG2細(xì)胞來說，脂肪酸對(duì)AML12細(xì)胞的傷害更小。

與對(duì)照組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001，下圖同

3.3 不同濃度脂肪酸對(duì)肝細(xì)胞脂肪超載的影響

3.3.1 對(duì)HepG2細(xì)胞脂肪超載的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、油酸＋棕櫚酸處理HepG2細(xì)胞24 h，細(xì)胞固定后，進(jìn)行油紅O染色，可見油酸、油酸＋棕櫚酸均呈濃度相關(guān)性地增加HepG2細(xì)胞的脂質(zhì)積累（＜0.05、0.01，圖2-A）。結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸在未導(dǎo)致HepG2細(xì)胞活力明顯下降的情況下，成功誘導(dǎo)了NAFLD細(xì)胞模型。接著檢測(cè)干預(yù)后細(xì)胞內(nèi)TG的含量，發(fā)現(xiàn)與對(duì)照組比較，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸均可顯著增加HepG2細(xì)胞內(nèi)TG積累（＜0.001，圖2-B）。

3.3.2 對(duì)AML12細(xì)胞脂肪超載的影響 采用125～1000 μmol/L油酸、油酸＋棕櫚酸處理AML12細(xì)胞24 h，細(xì)胞固定后，進(jìn)行油紅O染色，可見油酸、油酸＋棕櫚酸均呈濃度相關(guān)性地增加AML12細(xì)胞的脂質(zhì)積累（＜0.01、0.001，圖2-C）。結(jié)合CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸在不影響AML12細(xì)胞活力的情況下，成功誘導(dǎo)了NAFLD細(xì)胞模型。同樣的，如圖2-D所示，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸可顯著增加AML12細(xì)胞中TG含量（＜0.001）。

由于棕櫚酸對(duì)2種細(xì)胞的損傷都較大，且低劑量的棕櫚酸并不足以誘導(dǎo)2種細(xì)胞產(chǎn)生顯著的脂質(zhì)堆積。所以按照當(dāng)前棕櫚酸配制方法，并不推薦單獨(dú)使用棕櫚酸構(gòu)建NAFLD細(xì)胞模型。

3.4 不同濃度脂肪酸對(duì)脂代謝的影響

3.4.1 對(duì)脂肪從頭合成（De novo lipogenesis，DNL）的影響 如圖3-A所示，與對(duì)照組比較，500 μmol/L油酸組和500 μmol/L油酸＋棕櫚酸組的HepG2細(xì)胞中SREBP-1、ACC及FASN的蛋白表達(dá)沒有出現(xiàn)顯著升高。同樣的，在AML12細(xì)胞中也未觀察到顯著差異。表明在此模型中，脂肪酸的引入并沒有顯著激活肝臟DNL的生理過程。

3.4.2 對(duì)脂肪分解的影響 接著對(duì)調(diào)控肝細(xì)胞脂肪分解速率的蛋白進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果表明，在2種細(xì)胞系的細(xì)胞模型中，ATGL蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05、0.001），而HSL的磷酸化水平顯著降低（＜0.05、0.01，圖3-B）。說明肝細(xì)胞中脂肪超載激活TG第一步水解的同時(shí)抑制了脂肪酸的進(jìn)一步生成，HSL活性的降低促使肝細(xì)胞中脂質(zhì)的進(jìn)一步積累。

圖2 不同濃度脂肪酸對(duì)HepG2細(xì)胞(A、B) 及AML12細(xì)胞(C、D) 油紅O染色及細(xì)胞內(nèi)TG累積的影響(, n = 3)

A-脂肪從頭合成相關(guān)蛋白表達(dá) B-脂肪分解相關(guān)蛋白表達(dá) C-脂肪酸氧化相關(guān)蛋白表達(dá) D-酮體含量

3.4.3 對(duì)脂肪酸氧化的影響 如圖3-C所示，在HepG2細(xì)胞模型中，與對(duì)照組比較，油酸組和油酸＋棕櫚酸組的PPARα蛋白表達(dá)水平雖然存在降低趨勢(shì)但未出現(xiàn)顯著差異，CPT1A蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.05），表明過量的脂肪酸促進(jìn)了肝細(xì)胞中脂肪酸的氧化。在AML12細(xì)胞模型中觀察到同樣的現(xiàn)象。為了進(jìn)一步說明脂肪酸氧化的變化，檢測(cè)了細(xì)胞培養(yǎng)基中酮體含量的變化情況，發(fā)現(xiàn)在HepG2細(xì)胞和AML12細(xì)胞中，500 μmol/L油酸和500 μmol/L油酸＋棕櫚酸均顯著升高了酮體的含量（＜0.001，圖3-D）。

4 討論

NAFLD是指除酒精外和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征[13]。游離脂肪酸可用于肝臟攝取和再酯化為TG，是肝中TG庫的主要來源，在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[14]。棕櫚酸和油酸是最豐富的游離脂肪酸，與正常人群相比，NAFLD患者血漿中棕櫚酸和油酸的含量顯著增加[15]。研究表明棕櫚酸對(duì)肝細(xì)胞有顯著的細(xì)胞毒性效應(yīng)，通過聯(lián)合油酸可減輕細(xì)胞損傷[16]。

文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，目前在以肝脂調(diào)控為核心的中藥調(diào)血脂活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)和評(píng)價(jià)中所使用的模型較為多樣，統(tǒng)一性較差。HepG2細(xì)胞是人肝癌細(xì)胞，具有生長(zhǎng)速度快、易于培養(yǎng)、脂滴形態(tài)學(xué)變化明顯等特點(diǎn)，被廣泛用于肝脂代謝的研究中[12]。AML12細(xì)胞是小鼠正常肝細(xì)胞，屬于永生化細(xì)胞，具有穩(wěn)定的表型，存在過氧化物酶體和膽小管樣結(jié)構(gòu)，更容易標(biāo)準(zhǔn)化，適用于多種肝臟疾病的研究[17]。本研究利用油酸、棕櫚酸在體外分別誘導(dǎo)人源HepG2細(xì)胞及鼠源AML12細(xì)胞脂肪變性，并通過檢測(cè)脂代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)闡釋模型特點(diǎn)。

在造模時(shí)間的選擇上，根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，多選擇1～48 h，其中應(yīng)用最多的為24 h（占94%）[18-21]。根據(jù)中藥的作用特點(diǎn)、細(xì)胞生長(zhǎng)周期及前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇24 h作為本研究中2種細(xì)胞模型的造模時(shí)間。另外，目前可供選擇的脂肪酸溶媒也較多，文獻(xiàn)中多存在對(duì)溶媒表述不清的現(xiàn)象。常使用的包括甲醇、乙醇、二甲亞砜等有機(jī)溶劑，但都對(duì)細(xì)胞有較大的毒性作用，且溶解不充分，導(dǎo)致模型穩(wěn)定性差。本研究選擇毒性較小的BSA作為溶媒，可與游離脂肪酸穩(wěn)定結(jié)合，同時(shí)更加符合脂肪酸在體內(nèi)的運(yùn)輸特點(diǎn)[22]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，500 μmol/L油酸及500 μmol/L油酸＋棕櫚酸干預(yù)細(xì)胞24 h后，在不影響細(xì)胞活性的情況下能夠顯著增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累。雖然在800 μmol/L甚至更高濃度的油酸＋棕櫚酸組中HepG2細(xì)胞及AML12細(xì)胞的活力仍未下降，但綜合考慮藥效驗(yàn)證敏感性，選擇500 μmol/L作為構(gòu)建NAFLD體外模型的最佳劑量，在此濃度下，繼續(xù)驗(yàn)證了脂代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)情況。

DNL主要發(fā)生在肝臟中[23]。乙酰輔酶A在ACC的作用下轉(zhuǎn)化為丙二酰輔酶A，繼而通過FASN轉(zhuǎn)化為脂肪酸主要為棕櫚酸，最終經(jīng)過延長(zhǎng)、酯化等步驟形成TG[23-24]。研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者的DNL速率顯著增加，是導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積的主要因素之一[25]?；颊吒闻K脂肪中15%～38%的棕櫚酸酯來自DNL，顯著高于正常群體[26]。一方面大量棕櫚酸的產(chǎn)生可引發(fā)炎癥和細(xì)胞凋亡；另一方面DNL的上調(diào)促使細(xì)胞轉(zhuǎn)向合成代謝而不是分解代謝，導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)堆積[4]。SREBP-1是DNL速率的主要調(diào)控因子，在NAFLD患者中表達(dá)增強(qiáng)，同時(shí)促進(jìn)ACC及FASN的表達(dá)[23]。在本研究的模型中，SREBP-1、ACC及FASN的表達(dá)并未出現(xiàn)顯著升高。培養(yǎng)基中添加大量的游離脂肪酸使得DNL進(jìn)程并未激活。

脂肪分解是TG分解為非酯化游離脂肪酸及甘油進(jìn)入體循環(huán)的生理過程[4]。其中，ATGL是水解TG的第一步，也是限速步驟，生成甘油二酯和脂肪酸[27]。研究表明，肝臟中ATGL的缺失可以減輕肝臟炎癥及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減緩病程的發(fā)展[19]。HSL是一種多功能的酶，主要調(diào)控二酰甘油酯的分解，其蛋白磷酸化可顯著激活蛋白活性，促進(jìn)脂解速率[28-29]。最后，單甘酯脂肪酶（monoglyceride lipase，MGL）將單酰甘油水解為甘油和脂肪酸。ATGL、HSL和MGL的生理活性受不同蛋白質(zhì)和輔助激活劑的相互調(diào)節(jié)，共同確保脂解速率以適應(yīng)代謝需要[30]。在本研究的模型中，過量TG的積累顯著促進(jìn)了肝細(xì)胞中ATGL的表達(dá)，以激活TG水解的第一步。然而，過量的游離脂肪酸負(fù)向調(diào)控了進(jìn)一步的脂解過程，抑制HSL的磷酸化。

氧化供能是肝內(nèi)脂肪酸代謝的主要途徑。脂肪酸的氧化由PPARα調(diào)節(jié)，長(zhǎng)鏈脂肪酸依賴位于外膜的CPT1進(jìn)入線粒體中[1,31]。PPARα的激活誘導(dǎo)了線粒體、過氧化物酶體和細(xì)胞色素中脂肪酸氧化相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄[32]。然而，這些過程會(huì)產(chǎn)生相當(dāng)數(shù)量的活性氧、氧化應(yīng)激和有毒的二元酸，進(jìn)一步促進(jìn)炎癥產(chǎn)生[33]。丙酮是肝臟中脂肪酸氧化的中間產(chǎn)物，包括乙酰乙酸、β-羥丁酸和丙酮。在2種模型中，酮體的含量顯著升高，PPARα的表達(dá)呈降低趨勢(shì)，但未出現(xiàn)顯著差異，CPT1A的表達(dá)呈現(xiàn)不同程度的顯著增加，說明細(xì)胞中多余的脂肪酸大量進(jìn)入線粒體中，易造成線粒體DNA的氧化損傷，加劇線粒體功能障礙和氧化應(yīng)激。

從上述結(jié)果可以看出，人源肝癌細(xì)胞HepG2與鼠源正常肝細(xì)胞AML12所建立的模型差異并不明顯，在不超生理濃度的情況下，細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)積累均隨脂肪酸濃度的增加而增加；但與HepG2細(xì)胞相比，AML12細(xì)胞對(duì)脂肪酸引起的細(xì)胞毒性耐受力更強(qiáng)，尤其是單獨(dú)使用棕櫚酸時(shí)，在濃度達(dá)到250 μmol/L時(shí)，細(xì)胞活性仍未出現(xiàn)顯著差異。從TG檢測(cè)可以看出，在相同的作用條件下AML12的脂質(zhì)積累更加嚴(yán)重，說明AML12細(xì)胞對(duì)脂肪酸變化更加敏感。

本實(shí)驗(yàn)選用的脂肪酸濃度相對(duì)較低，對(duì)細(xì)胞傷害較小。因此，更加適宜于反映NAFLD疾病初期病理特征，對(duì)于后續(xù)疾病出現(xiàn)的炎癥及細(xì)胞損傷，可采用更高劑量的脂肪酸進(jìn)行誘導(dǎo)；另外，實(shí)驗(yàn)采用單一因素即脂肪酸濃度增加作為造模條件，不能全面反映NAFLD臨床中復(fù)雜的多重致病因素[34]，因此，在藥物發(fā)現(xiàn)或藥效評(píng)價(jià)中可根據(jù)需求，注意結(jié)合其他體外模型進(jìn)行交互驗(yàn)證。

綜上，500 μmol/L油酸、500 μmol/L油酸＋棕櫚酸（體積比2∶1）作用于HepG2細(xì)胞及AML12細(xì)胞可成功誘導(dǎo)NAFLD體外細(xì)胞模型，影響肝細(xì)胞脂肪分解和脂肪酸氧化相關(guān)蛋白的表達(dá)，具有脂質(zhì)堆積穩(wěn)定、成模周期較短、經(jīng)濟(jì)高效的特點(diǎn)。適用于中藥及中藥方劑中調(diào)血脂活性物質(zhì)的廣泛篩選，為有效治療NAFLD的創(chuàng)新中藥發(fā)現(xiàn)及不同藥理學(xué)特征的評(píng)價(jià)研究提供模型參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

[1] Yoon H, Shaw J L, Haigis M C,. Lipid metabolism in sickness and in health: Emerging regulators of lipotoxicity [J]., 2021, 81(18): 3708-3730.

[2] Nguyen P, Leray V, Diez M,. Liver lipid metabolism [J]., 2008, 92(3): 272-283.

[3] Zheng Q, Li X J Y, Huang N N,. Saikosaponins ameliorate hyperlipidemia in rats by enhancing hepatic lipid and cholesterol metabolism [J]., 2023, 305: 116110.

[4] Yki-J?rvinen H, Luukkonen P K, Hodson L,. Dietary carbohydrates and fats in nonalcoholic fatty liver disease [J]., 2021, 18(11): 770-786.

[5] Watanabe S, Hashimoto E, Ikejima K,. Evidence-based clinical practice guidelines for nonalcoholic fatty liver disease/nonalcoholic steatohepatitis [J]., 2015, 45(4): 363-377.

[6] Lazarus J V, Mark H E, Anstee Q M,. Advancing the global public health agenda for NAFLD: A consensus statement [J]., 2022, 19(1): 60-78.

[7] 李文怡, 袁成民. 非酒精性脂肪性肝病的中西醫(yī)治療 [J]. 臨床肝膽病雜志, 2020, 36(4): 919-923.

[8] 童光東, 邢宇鋒, 周曉玲, 等. 肝癖 (非酒精性脂肪性肝炎) 診療方案 [J]. 中國(guó)肝臟病雜志: 電子版, 2021, 13(1): 1-9.

[9] 張聲生, 李軍祥. 非酒精性脂肪性肝病中醫(yī)診療專家共識(shí)意見 (2017) [J]. 臨床肝膽病雜志, 2017, 33(12): 2270-2274.

[10] 劉靜, 孫蓉. 小柴胡湯對(duì)非酒精性脂肪性肝炎模型小鼠的保護(hù)作用研究 [J]. 中草藥, 2020, 51(14): 3708-3716.

[11] Li J C, Wu K Y, Zhong Y,. Si-Ni-SAN ameliorates obesity through AKT/AMPK/HSL pathway-mediated lipolysis: Network pharmacology and experimental validation [J]., 2023, 302: 115892.

[12] 羅燕, 和興萍, 李雪, 等. 幾種細(xì)胞脂肪變性模型的建立與比較分析 [J]. 中華中醫(yī)藥學(xué)刊, 2017, 35(8): 2074-2077.

[13] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝病學(xué)分會(huì)脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組, 中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)脂肪性肝病專家委員會(huì), 非酒精性脂肪性肝病防治指南(2018年更新版) [J]. 臨床肝膽病雜志, 2018, 34(5): 947-957.

[14] Kawano Y, Cohen D E. Mechanisms of hepatic triglyceride accumulation in non-alcoholic fatty liver disease [J]., 2013, 48(4): 434-441.

[15] Puri P, Wiest M M, Cheung O,. The plasma lipidomic signature of nonalcoholic steatohepatitis [J]., 2009, 50(6): 1827-1838.

[16] Leamy A K, Egnatchik R A, Young J D. Molecular mechanisms and the role of saturated fatty acids in the progression of non-alcoholic fatty liver disease [J]., 2013, 52(1): 165-174.

[17] Kanuri G, Bergheim I.andmodels of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) [J]., 2013, 14(6): 11963-11980.

[18] Luo W, Ye L, Hu X T,. MD2 deficiency prevents high-fat diet-induced AMPK suppression and lipid accumulation through regulating TBK1 in non-alcoholic fatty liver disease [J]., 2022, 12(3): e777.

[19] Fuchs C D, Radun R, Dixon E D,. Hepatocyte-specific deletion of adipose triglyceride lipase (adipose triglyceride lipase/patatin-like phospholipase domain containing 2) ameliorates dietary induced steatohepatitis in mice [J]., 2022, 75(1): 125-139.

[20] da Silva Lima N, Fondevila M F, Nóvoa E,. Inhibition of ATG3 ameliorates liver steatosis by increasing mitochondrial function [J]., 2022, 76(1): 11-24.

[21] Zhang J, Tan J, Wang M K,. Lipid-induced DRAM recruits STOM to lysosomes and induces LMP to promote exosome release from hepatocytes in NAFLD [J]., 2021, 7(45): eabh1541.

[22] Liu Y X, Qiao Z C, Liu W Q,. Oleic acid as a protein ligand improving intestinal absorption and ocular benefit of fucoxanthin in water through protein-based encapsulation [J]., 2019, 10(7): 4381-4395.

[23] Ipsen D H, Lykkesfeldt J, Tveden-Nyborg P. Molecular mechanisms of hepatic lipid accumulation in non-alcoholic fatty liver disease [J]., 2018, 75(18): 3313-3327.

[24] Badmus O O, Hillhouse S A, Anderson C D,. Molecular mechanisms of metabolic associated fatty liver disease (MAFLD): Functional analysis of lipid metabolism pathways [J]., 2022, 136(18): 1347-1366.

[25] Smith G I, Shankaran M, Yoshino M,. Insulin resistance drives hepaticlipogenesis in nonalcoholic fatty liver disease [J]., 2020, 130(3): 1453-1460.

[26] Batchuluun B, Pinkosky S L, Steinberg G R. Lipogenesis inhibitors: Therapeutic opportunities and challenges [J]., 2022, 21(4): 283-305.

[27] Zechner R, Zimmermann R, Eichmann T O,. FAT SIGNALS: Lipases and lipolysis in lipid metabolism and signaling [J]., 2012, 15(3): 279-291.

[28] Tardelli M, Bruschi F V, Trauner M. The role of metabolic lipases in the pathogenesis and management of liver disease [J]., 2020, 72(3): 1117-1126.

[29] Anthonsen M W, R?nnstrand L, Wernstedt C,. Identification of novel phosphorylation sites in hormone-sensitive lipase that are phosphorylated in response to isoproterenol and govern activation properties[J]., 1998, 273(1): 215-221.

[30] Morigny P, Boucher J, Arner P,. Lipid and glucose metabolism in white adipocytes: Pathways, dysfunction and therapeutics [J]., 2021, 17(5): 276-295.

[31] Li X J Y, Ge J D, Li Y J,. Integrative lipidomic and transcriptomic study unravels the therapeutic effects of saikosaponins A and D on non-alcoholic fatty liver disease [J]., 2021, 11(11): 3527-3541.

[32] Wang Y P, Nakajima T, Gonzalez F J,. PPARs as metabolic regulators in the liver: Lessons from liver-specific PPAR-null mice [J]., 2020, 21(6): 2061.

[33] Rao M S, Reddy J K. Peroxisomal beta-oxidation and steatohepatitis [J]., 2001, 21(1): 43-55.

[34] Buzzetti E, Pinzani M, Tsochatzis E A. The multiple-hit pathogenesis of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) [J]., 2016, 65(8): 1038-1048.

Lipid-regulating activity and evaluation method of traditional Chinese medicine based on liver lipid regulation

LI Jian-chao1, 2, ZHONG Ying2, LI Rong-rong1, 2, SONG Xu-yu2, HUANG Na-na2, SUN Rong2, 3

1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China 2. The Second Hospital of Shandong University, Jinan 250033, China 3. Shandong University, Institute of Advanced Medical Sciences, Jinan 250012, China

To construct ancell model of non-alcoholic fatty liver disease (NAFLD) with “multi-cell origin” and “good stability”, which is suitable for lipid-regulating activity and evaluation with “l(fā)iver lipid regulation” as the core of traditional Chinese medicine, so as to facilitate the accurate discovery of lipid-regulating active substances of traditional Chinese medicine and evaluate their pharmacological effects of lipid regulation.HepG2 cell line of human hepatocellular carcinoma and AML12 cell line of mouse liver parenchyma were selected, modeling reagents (oleic acid and palmitic acid), modeling methods, action concentration, action time and solvent selection were studied by literature and experiments. CCK-8 and oil red O experiments were used to determine the optimal modeling concentration, and then the contour of human liver lipid metabolism was followed. The expressions of lipid metabolism-related proteins in cells was detected by Western blotting as a model evaluation standard.It was found that 10% fatty acid free bovine serum albumin (BSA) was oleic acid solvent and 20% BSA was palmitic acid solvent with good stability. 500 μmol/L oleic acid and 500 μmol/L oleic acid + palmitic acid (volume ratio 2∶1) treated for 24 h could significantly increase the intracellular lipid accumulation (< 0.001) without affecting the cell activity, which proves that the modeling is successful. Palmitic acid modeling alone caused great damage to both kinds of cells, so the model was not suitable for the discovery and evaluation of lipid-lowering substances. After modeling with 500 μmol/L oleic acid and 500 μmol/L oleic acid + palmitic acid, expressions of de novo lipogenesis synthesis related proteins sterol regulatory element-binding protein-1 (SREBP-1), acetyl-CoA carboxylase (ACC) and fatty acid synthase (FASN) were not significantly increased, but the expression of lipolysis related protein adipose triglyceride lipase (ATGL) was significantly increased (< 0.05, 0.001), and phosphorylation of hormone sensitive lipase (HSL) was significantly decreased (< 0.05, 0.01), and the expression of peroxisome proliferator-activated receptor α (PPARα), a protein related to fatty acid oxidation, had no significant difference, while the expression of carnitine palmitoyl transferase 1A (CPT1A) was significantly increased (< 0.05).500 μmol/L oleic acid and 500 μmol/L oleic acid + palmitic acid (volume ratio of 2∶1) can significantly increase the lipid accumulation in HepG2 and AML12 cells, and successfully construct the cell model of NAFLD, which is stable, economical and efficient.

liver lipid metabolism;model; non-alcoholic fatty liver disease; free fatty acid; oleic acid; palmitic acid

R285.5

A

0253 - 2670(2023)10 - 3158 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2023.10.013

2023-02-07

國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目（2022YFC3502100）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82274197）；國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（81773997）；濟(jì)南市科研帶頭人工作室項(xiàng)目（202228099）

李建超，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幩幚韺W(xué)與毒理學(xué)。E-mail: lijianchao0117@163.com

孫 蓉，博士生導(dǎo)師，教授，從事中藥藥理學(xué)與毒理學(xué)研究。E-mail: sunrong107@163.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]