苗麗青， 馬旭輝， 李素貞， 陳茹梅， 柳小慶

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京 100081）

蝦青素最初是從龍蝦中分離出來的一種脂溶性類胡蘿卜素[1]，主要存在于多種藻類、微生物、甲殼類動物及海洋魚類中，在高等植物中鮮有報道[2]。自20世紀80年代中期，隨著蝦青素抗氧化能力及其他生物活性的發(fā)現(xiàn)，蝦青素開始逐步地應(yīng)用于動物飼料、保健食品、化妝品和醫(yī)療制劑等產(chǎn)品中。歐盟早已批準蝦青素可用作膳食補充劑；美國食品和藥物管理局也已批準將蝦青素用作動物和魚類飼料的食物著色劑；我國也允許在食品和飼料添加劑中大量使用蝦青素。因此，市場對蝦青素的需求量越來越大。

在目前的商業(yè)化蝦青素供應(yīng)中，主要是通過化學(xué)法合成蝦青素，或從天然含有蝦青素的雨生紅球藻、紅發(fā)夫酵母、蝦蟹甲殼中提取蝦青素，然后再進一步加工獲得不同用途的產(chǎn)品。保健品和醫(yī)藥制劑中通常利用親水性遞送載體來保障蝦青素等活性物質(zhì)在人體內(nèi)的有效吸收。當前，大規(guī)模生產(chǎn)蝦青素的方法都存在一定的限制性因素，導(dǎo)致蝦青素供不應(yīng)求。近年來，隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展，陸續(xù)報道了富含蝦青素的轉(zhuǎn)基因作物，如水稻、番茄、玉米等，給未來工業(yè)化生產(chǎn)高質(zhì)量的蝦青素帶來了新的可能。

1 蝦青素的特性

蝦青素，又名蝦紅素，即3,3’-二羥基-4,4’-二酮基-β,β’-胡蘿卜素，分子式為C40H52O4。蝦青素分子結(jié)構(gòu)包括1條長共軛的多烯烴鏈以及兩端的六元酮環(huán)，端環(huán)上的C-3和C-3’為手性中心。根據(jù)端環(huán)手性碳的構(gòu)象，蝦青素具有左旋（3S,3'S）、右旋（3R,3'R）和內(nèi)消旋（3R,3'S）3種立體構(gòu)象（圖1）。這些不同構(gòu)象的蝦青素均存在于自然界中，如紅發(fā)夫酵母中的蝦青素為左旋構(gòu)象的游離形式；南極磷蝦中以右旋構(gòu)象的蝦青素酯為主；野生鮭魚中的蝦青素主要是左旋構(gòu)象的游離形式；雨生紅球藻中則是左旋構(gòu)象的蝦青素酯，其中單酯約占80%，雙酯約占15%，在3或3’位羥基參與酯化的脂肪酸主要有油酸、反油酸、蓖麻酸和花生酸等。此外，根據(jù)蝦青素結(jié)構(gòu)中碳碳雙鍵連接基團的不同空間排列方式，蝦青素也存在順反異構(gòu)體，如果2個基團位于雙鍵的同一側(cè)稱為順式結(jié)構(gòu)（Z），反之則稱為反式結(jié)構(gòu)（E）（圖1）。其中，全反式結(jié)構(gòu)的蝦青素最為穩(wěn)定，并在自然界中大量存在。

圖1 蝦青素分子主要的立體異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體Fig. 1 Main stereoisomers and geometric isomers of astaxanthin molecules

2 蝦青素的合成代謝途徑

蝦青素作為酮式類胡蘿卜素，僅在細菌、真菌、藻類和少數(shù)植物中有完整的合成代謝途徑，其中包括被人們所熟知的紅發(fā)夫酵母[3]和雨生紅球藻[4-5]。鮭魚、龍蝦等動物從頭合成蝦青素的能力較差，一般只能通過食物鏈在體內(nèi)富集[6-7]。類胡蘿卜素的合成代謝途徑大同小異。在開花植物中[8]，以3-磷酸甘油醛和丙酮酸為起始底物經(jīng)過多步反應(yīng)生成牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl pyrophosphate, GGPP)；而后兩分子GGPP在八氫番茄紅素合成酶(phytoene synthase,PSY)的作用下形成八氫番茄紅素，此步驟是類胡蘿卜素合成的限速節(jié)點；再經(jīng)氧化形成番茄紅素后進行分支，一支在番茄紅素環(huán)化酶(lycopene epsilon cyclase, LCY-e)的作用下合成葉黃素，另一支則向β-胡蘿卜素方向進行，最后形成脫落酸。β-胡蘿卜素是細菌、真菌、藻類和少數(shù)植物中合成蝦青素的前體物質(zhì)，蝦青素與β-胡蘿卜素的結(jié)構(gòu)差異在于碳鏈兩端環(huán)C3和C3’上的羥基及C4和C4’上的羰基。因此，將β-胡蘿卜素合成代謝途徑延伸到蝦青素過程實際上是在β-胡蘿卜素分子兩端β-環(huán)上的相應(yīng)位點補充羥基和羰基的過程，但在不同物種中，羥基化和羰基化的方式和途徑略有不同，總體上可分為3條途徑如圖2所示。

圖2 β-胡蘿卜素合成蝦青素的3條途徑Fig. 2 Three ways of synthesize astaxanthin from β-carotene

夏側(cè)金盞花是目前報道的唯一可以合成蝦青素的高等植物。Cunningham等[9]從夏側(cè)金盞花花瓣cDNA文庫中篩選出類似β-胡蘿卜素3-羥化酶基因的cDNAs（cbfd1和cbfd2），并將這2個cDNAs轉(zhuǎn)入大腸桿菌中進行基因功能驗證，結(jié)果表明CBFD1/ CBFD2具有底物專一性，可對未修飾的類胡蘿卜素β環(huán)的C4和類胡蘿卜素4-酮基-β-環(huán)的C3進行羥基化修飾，但是不能對未修飾的β環(huán)或4-羥基-β環(huán)的C3進行羥基化修飾。該團隊在2011年進一步驗證了這個結(jié)果，并確定了另外2 個基因hbfd1、hbfd2編碼的 HBFD[2]，能夠?qū)?-羥基-β-環(huán)上的羥基脫氫形成4-羰基-β-環(huán)。夏側(cè)金盞花中以β-胡蘿卜素為底物合成蝦青素時，先由CBFD對β-胡蘿卜素β環(huán)的C4羥基化；然后該位點的羥基被HBFD脫氫形成羰基；最后由CBFD在4-羰基-β環(huán)的C3位添加羥基，從而生成蝦青素。

海洋細菌的蝦青素代謝途徑似乎更簡潔。β-胡蘿卜素酮化酶CrtW和β-胡蘿卜素羥化酶CrtZ之間既不相互干擾，也不像夏側(cè)金盞花中的酮化酶和羥化酶之間有嚴格的催化反應(yīng)先后順序。

藻類中，雨生紅球藻的酮化酶BKT和CrtW的氨基酸序列很相似[10]，但和BKT搭配發(fā)揮羥化酶作用的是細胞色素P450還原酶[11]。在酵母中，將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為蝦青素的功能基因尚存爭議。因為在β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化為蝦青素的過程中存在羥化和酮化2個不同的反應(yīng)，而在這一步的前半過程中僅僅克隆到1個相關(guān)基因CrtS。Ojima等[12]將CrtS導(dǎo)入可產(chǎn)β-胡蘿卜素的大腸桿菌時檢測到中間產(chǎn)物海膽酮，以此提出CrtS有羥化和酮化2種功能的假說。但是álvarez等[13]將CrtS導(dǎo)入能產(chǎn)β-胡蘿卜素的毛霉工程菌時只檢測到β-胡蘿卜素的羥化產(chǎn)物β-隱黃質(zhì)和玉米黃質(zhì)，因此認為β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化酶只有羥化的功能。Alcaíno等[14]克隆出另一個基因CrtR，編碼細胞色素P450還原酶，研究表明CrtR是CrtS將β-胡蘿卜素轉(zhuǎn)變成蝦青素所必需的。

3 蝦青素的應(yīng)用

3.1 蝦青素在水產(chǎn)和畜牧飼料中的應(yīng)用

蝦青素是天然著色劑，它以不同的構(gòu)象存在于不同物種中，從而賦予生物獨特的顏色，極具代表性的是鮭魚肉質(zhì)呈現(xiàn)的紅色。這種紅色讓人們在視覺上感受到愉悅，并習(xí)慣以這種鮮艷的顏色象征食物的新鮮度和風(fēng)味。蝦青素能夠在魚類的脂蛋白[15]、肌球蛋白[16]、α-肌動蛋白[17]中積累。因此，為了能夠使人工養(yǎng)殖的鮭魚呈現(xiàn)更鮮艷的色澤，傳統(tǒng)飼料中需要額外添加適量蝦青素。據(jù)評估，在2009年動物飼料和營養(yǎng)品市場的需求分別是3億和3千萬美元，但在2020年分別達到8億和3億美元，其中蝦青素作為鮭魚飼料的年需求就有2億美元（2 500美元·kg-1）[18]。

除水產(chǎn)品以外，蝦青素還可用于家禽飼料。在肉鴨飼糧中添加10 mg·kg-1的天然蝦青素能使其在肉鴨體內(nèi)有效沉積，促使活鴨的喙、脛?wù)瞥尸F(xiàn)天然健康的金黃色，也能夠有效抑制肌肉的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，提高營養(yǎng)價值[19]。用高蝦青素玉米完全代替?zhèn)鹘y(tǒng)飼料中的玉米來飼喂蛋雞（圖3），所產(chǎn)雞蛋蛋黃中的蝦青素可達12.10~14.15 mg·kg-1，每枚雞蛋的蝦青素含量約為540 μg，可滿足人體日?？寡趸＝⌒枨骩20]。

圖3 高蝦青素轉(zhuǎn)基因玉米及其飼喂蛋雞所產(chǎn)的雞蛋Fig. 3 Astaxanthin corn and eggs from laying hens

3.2 蝦青素在保健食品、化妝品中的應(yīng)用

蝦青素分子中的長共軛多烯烴鏈能夠淬滅單線態(tài)氧，并清除自由基，因此蝦青素具有極強的抗氧化能力[21]。據(jù)報道，蝦青素的抗氧化活性比玉米黃素、葉黃素、角黃素和β-胡蘿卜素高10倍，比生育酚高100倍[22]。因此，人們認為在食品和護膚品中添加蝦青素，能夠利用其抗氧化活性達到美白護膚、增強免疫及延緩衰老等功效。截至2022年11月，國內(nèi)標識含有蝦青素成分的注冊商品有2 371 474個，其中護膚、美妝類有70 765個；食品45 156個；然而，蝦青素類保健品基本均為國外進口產(chǎn)品[23-24]。

3.3 蝦青素在醫(yī)療藥物中的應(yīng)用

由于蝦青素具有強抗氧化作用，因此可作為多靶點藥理學(xué)制劑。蝦青素可通過調(diào)節(jié)肝臟免疫反應(yīng)、肝臟炎癥和氧化應(yīng)激來預(yù)防性改善非酒精性脂肪性肝炎和肝纖維化[25]。除此之外，F(xiàn)akhri等[26]認為，蝦青素可以防止大部分氧化應(yīng)激和炎癥相關(guān)的疾病，包括炎癥性疾病、癌癥、肥胖、高甘油三酯血癥、高膽固醇血癥及心血管、胃腸道、肝臟、神經(jīng)退行性眼科、骨骼、生殖系統(tǒng)疾病和皮膚病。Lignell等[27]也表明,口服含蝦青素的藥物可明顯增強人的肌肉力量和對運動的耐受度。

4 商業(yè)化蝦青素的主要來源

4.1 化學(xué)合成蝦青素

利用化學(xué)法合成蝦青素是商業(yè)化蝦青素的主要來源。在國內(nèi)，皮士卿等[28]報道了蝦青素的化學(xué)合成方法，該方法的合成原料獲取容易、反應(yīng)選擇度高、合成收率高。在國外，市場供應(yīng)的合成蝦青素主要來源于德國的巴斯夫公司和瑞士的羅氏公司。這2家公司的合成方法相似，過程復(fù)雜且條件嚴苛[29]，但是成本相對低廉。除此之外，也有利用角黃素來合成蝦青素的方法，雖然該法合成的蝦青素生物活性更高，但成本高、產(chǎn)率低，且合成過程存在危險性[30]。目前，工業(yè)化合成的蝦青素大多作為飼料添加劑，用于鮭魚等水產(chǎn)養(yǎng)殖。

4.2 天然提取法

除化學(xué)合成法外，還可以從天然含有蝦青素的生物中提取蝦青素?，F(xiàn)有的提取方法主要是從雨生紅球藻、血紅裸藻、紅發(fā)夫酵母、蝦蟹甲殼等生物中提取蝦青素。蝦青素在不同物種中的形態(tài)不同，生產(chǎn)中一般需要提取較穩(wěn)定的全反式構(gòu)象蝦青素。目前在工業(yè)化生產(chǎn)中，只能從雨生紅球藻中提取全反式構(gòu)象的天然蝦青素，但藻類生長周期長、生物量少，且誘導(dǎo)蝦青素積累的逆境脅迫與細胞生物量積累互相矛盾，導(dǎo)致雨生紅球藻中蝦青素含量為1%~5%[31]。紅發(fā)夫酵母等菌體雖然繁殖速度快，生物量高，但蝦青素含量僅0.4%[31]。從廢棄甲殼中提取蝦青素的方法成本高、產(chǎn)量低、純度低，因此也極少被采用。總的來說，現(xiàn)有工業(yè)化生產(chǎn)方法或多或少存在著技術(shù)難度大、生產(chǎn)成本高、蝦青素產(chǎn)量低的問題。然而，在保健品和化妝品等領(lǐng)域需要更高安全性和生物活性的天然蝦青素，因此導(dǎo)致這類商品價格高昂。

5 生物合成商業(yè)化蝦青素的基因工程

關(guān)于蝦青素生物合成的基因工程研究率先在藻類和微生物中開展，其中紅發(fā)夫酵母中的蝦青素含量達到細胞干重的0.5%左右；雨生紅球藻的蝦青素含量則可達到細胞干重的4%~5%左右（表1）。然而，這些受體生物自身的生物量較低，且其存儲蝦青素的機制尚未清楚，因此蝦青素產(chǎn)量普遍較低。近些年，許多研究者利用綠色環(huán)保的農(nóng)作物作為生物反應(yīng)器，通過基因工程技術(shù)來實現(xiàn)生物合成蝦青素（表1）。這種方法具有成本低、操作性強、產(chǎn)量高、生物量高、耐儲存等諸多優(yōu)點。

表1 主要研究物種中的蝦青素含量Table 1 Contents of astaxanthin in main studied species

最初關(guān)于轉(zhuǎn)蝦青素基因的研究是在模式植物煙草中。將雨生紅球藻CrtO基因轉(zhuǎn)入煙草，在其花中首次合成了蝦青素[35]；而轉(zhuǎn)入藍藻CrtO的轉(zhuǎn)基因煙草中在葉片中檢測到酮類胡蘿卜素，含量為165.00 μg·g-1DW[44]；同時融合表達CrtW和CrtZ的轉(zhuǎn)基因煙草和番茄中積累的蝦青素量雖有提升但仍然很少[45]；將來自海洋細菌Brevundimonas sp.strain SD212的CrtW和CrtZ通過葉綠體轉(zhuǎn)化煙草，獲得的轉(zhuǎn)基因煙草葉片中蝦青素的含量高達5.44 mg·g-1DW[37]；將酮化酶基因BKT和CrtB轉(zhuǎn)入馬鈴薯后，轉(zhuǎn)基因植株的蝦青素積累量達13.90 μg·g-1DW[36]；轉(zhuǎn)BKT基因胡蘿卜中蝦青素積累量達到 91.60 μg·g-1FW[38]。北京大學(xué)陳鋒團隊向擬南芥和煙草中分別轉(zhuǎn)入不同藻類來源的酮化酶基因BKT后，發(fā)現(xiàn)來自萊茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）的CrBKT使轉(zhuǎn)基因植株中蝦青素積累量分別最高達到2.07和1.60 mg·g-1DW[39-40]；進一步在番茄中同時表達CrBKT和來自雨生紅球藻的羥化酶基因HpBHY，轉(zhuǎn)基因番茄果實中蝦青素積累量達16.10 mg·g-1DW[41]。

隨后，人們將蝦青素的生物合成聚焦到糧食作物上。劉耀光團隊[43]在水稻胚乳中成功重構(gòu)了蝦青素的代謝途徑。Farré等[42]通過基因槍共轉(zhuǎn)化法獲得同時表達短波單胞菌（Brevundimonas sp.strain SD212）Crbkt和BrcrtZ基因的轉(zhuǎn)基因玉米，其籽粒蝦青素的積累量達16.77 μg·g-1DW。柳小慶等[20]向玉米中引入蝦青素合成通路中的關(guān)鍵酶基因創(chuàng)制了高蝦青素玉米種質(zhì)，其蝦青素含量高達47.76~111.82 mg·kg-1DW，是以往轉(zhuǎn)蝦青素基因谷物的6倍（圖3）。

6 蝦青素活性遞送系統(tǒng)

蝦青素是一種高度不飽和的分子，對高溫、光照和氧化等條件異常敏感，因此蝦青素極易發(fā)生降解，進而降低蝦青素產(chǎn)品的生物活性。只有同步提高蝦青素在應(yīng)用體系中的生物利用率和穩(wěn)定性，才能促進蝦青素的工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用，并對人體健康發(fā)揮有效保障。

遞送系統(tǒng)在目前可采納的策略中具有較強保護性和實用性，包括乳液、納米粒、脂質(zhì)體等傳統(tǒng)遞送體系。Khalid等[46]采用高壓均質(zhì)法和改良卵磷脂、酪蛋白酸鈉（sodium caseinate, SC）原料將蝦青素進行了“水包油”的納米乳液化處理；Ribeiro等[47]采用預(yù)混膜的乳化方式保護蝦青素，但其仍會發(fā)生部分降解。目前，脂質(zhì)體多采用卵磷脂、二肉豆蔻酰磷脂酰膽堿[48]、大豆磷脂酰膽堿[49]等材料，用這些材料包裹蝦青素，其口服安全性更高，且可被人體消化吸收。相對于前2種方法，納米顆粒的保護效果更好，利用率更高。采用多次乳化/溶劑揮發(fā)法將蝦青素包埋在戊二醛交聯(lián)的殼聚糖基質(zhì)中，形成直徑在5~50 μm的蝦青素微膠囊粉末狀產(chǎn)品，這種包埋能夠保護蝦青素不發(fā)生異構(gòu)化或化學(xué)降解[50]。利用DNA/殼聚糖共組裝物作為納米載體，可獲得DNA/殼聚糖負載蝦青素（astaxanthin-loaded DNA/chitosan, ADC）膠體系統(tǒng)[51]，其蝦青素含量高達 65 μg·mL-1。ADC 納米顆?？啥虝r間內(nèi)通過腸上皮細胞的內(nèi)吞作用被吸收，其活性氧清除效率高達54.3%，是游離蝦青素的2倍。采用硬脂酸-殼聚糖偶聯(lián)物和酪氨酸鈉（NaCas）通過離子凝膠法制備的生物聚合納米顆粒，用其包埋蝦青素濃度可高達 140 μmol·L-1[52]。通過氧化右旋糖酐和牛血清白蛋白間原位偶聯(lián)制備的固體脂質(zhì)-聚合物雜化納米粒（solid lipidpolymer hybrid nanoparticles, SLPN）包埋蝦青素也能夠起到有效保護[53]。

蝦青素與多種蛋白體能夠發(fā)生相互作用，其中具有兩親性的蛋白體適合作為親脂性物質(zhì)的親水性遞送載體。當脂肪酸作為蛋白配體時，牛血清白蛋白（bovine albumin, BSA)-蝦青素系統(tǒng)[54]能夠有效保證蝦青素的儲存穩(wěn)定性，同時，體外模擬也表現(xiàn)出親水傳遞載體，明顯改善了蝦青素的生物利用率；若換用除DHA以外的不飽和脂肪酸或長鏈脂肪酸，則包埋的蝦青素穩(wěn)定性下降，但生物利用率有所提高。因此，要根據(jù)實際應(yīng)用中的具體情況來選擇配合蛋白體的脂肪酸。從馬鈴薯淀粉加工副產(chǎn)物中提取出的馬鈴薯蛋白（potato proteins，PP）[55]也能與蝦青素分子形成納米顆粒，雖然模擬腸胃消化后只達到80%保留率，但由于原料廉價，能夠大幅降低蝦青素作為膳食補充劑的成本。對于其他疏水性物質(zhì)的遞送載體，如大豆β-聚球蛋白（β-CG）[56]，未來也有望應(yīng)用于蝦青素的遞送。

7 蝦青素未來應(yīng)用的展望

蝦青素具備多種生物功能，因此具有龐大的市場需求，但現(xiàn)有的工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)化應(yīng)用中都存在著一定的限制性因素。目前，第一步生產(chǎn)來源的難題可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)得以解決，尤其是以玉米、水稻為代表的農(nóng)作物及以番茄、甘藍為代表的果蔬等植物可作為生物反應(yīng)器，來大量積累具有較強生物活性的蝦青素。其中，含蝦青素的果蔬還能夠直接供應(yīng)市場，提高人們?nèi)粘ｏ嬍持械奈r青素含量；而玉米作為糧飼兼用的作物，能同時滿足人們的日常膳食需求和相關(guān)工業(yè)用途的需要。但是，由于這些含蝦青素的轉(zhuǎn)基因作物存在轉(zhuǎn)化方式帶來的外源基因碎片化和基因分離等問題，同時缺少對相關(guān)種質(zhì)中的蝦青素特性的評價標準，導(dǎo)致國內(nèi)的研究成果無法服務(wù)于市場需求。第二步有效利用的難題需要靠合理的應(yīng)用遞送系統(tǒng)，并根據(jù)實際應(yīng)用場景來選擇對應(yīng)不同特點的遞送系統(tǒng)。隨著疏水活性分子遞送系統(tǒng)種類的不斷增多，且技術(shù)相對成熟，尤其是納米顆粒技術(shù)，可利用多種材料對蝦青素進行有效保護和遞送。如果將與蝦青素具有天然特異性互作的蛋白體引入現(xiàn)有的蝦青素轉(zhuǎn)基因作物中，有望在生物反應(yīng)器內(nèi)同時積累并包埋蝦青素分子，“一步化”實現(xiàn)蝦青素的物質(zhì)提取和遞送系統(tǒng)裝配。隨著市場需求的持續(xù)增加，關(guān)于蝦青素研究也會更加深入，未來一定能更好地實現(xiàn)蝦青素資源低成本和高效能的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。