唐源,祝潔,楊小余,張乙進(jìn),羅紅,江滟,3***

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 醫(yī)學(xué)檢驗學(xué)院 臨床微生物與免疫學(xué)教研室,貴州 貴陽 550004;2.貴州醫(yī)科大學(xué) 實驗動物中心,貴州 貴陽 550025;3.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院 臨床檢驗中心 微生物免疫科,貴州 貴陽 550004)

甲型流感病毒(influenza A virus,IAV)是常見的呼吸道病原體,具有高度傳染性[1-3]。據(jù)報道,IAV 感染每年可導(dǎo)致29萬～65萬人死亡,嚴(yán)重威脅人類健康[4]。黏膜上皮細(xì)胞分泌的抗病毒蛋白可直接殺死流感病毒、激活吞噬細(xì)胞并誘導(dǎo)其他抗病毒蛋白的產(chǎn)生[5-6]。β防御素3(β defensin-3,BD-3)屬于抗菌肽家族[7],處于抗病毒免疫的第一道防線,BD-3和γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)在IAV感染早期表達(dá)顯著上調(diào)[8-9]。本課題組前期研究表明,BD-3可抑制IAV進(jìn)入細(xì)胞,并增強(qiáng)小鼠對流感病毒的抵抗力[10];此外,還可誘導(dǎo)其他抗病毒蛋白的生成、抑制IAV復(fù)制[10]。例如,BD-3可誘導(dǎo)NK細(xì)胞分泌抗病毒蛋白IFN-γ[11],IFN-γ是Ⅱ型干擾素的唯一成員,其產(chǎn)生對于病毒的清除和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展至關(guān)重要。盡管IFN-γ不能直接殺死IAV,但是它可誘導(dǎo)干擾素刺激基因 (interferon-stimulated genes,ISGs)來抑制IAV[12-14]。研究表明,在角質(zhì)細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中,IFN-γ可誘導(dǎo)人β防御素3(human β defensin-3,HBD3)的表達(dá)[15- 16],并認(rèn)為HBD3和IFN-γ的表達(dá)均與絲裂源活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的激活相關(guān)[17-18],但其中的機(jī)制仍不清楚。本研究基于MAPK通路,探討在人支氣管上皮細(xì)胞(human bronchial epithelial cell line,HBEpiC)BEAS-2B中,HBD3和IFN-γ在抗IAV中的作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1細(xì)胞和病毒株 BEAS-2B細(xì)胞購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫,IAVA/PR/8/34(H1N1)毒株由本實驗室保存。

1.1.2主要試劑 BEAS-2B細(xì)胞及其專用無血清培養(yǎng)基KCB M006購自中國科學(xué)院昆明細(xì)胞庫,DMEM高糖培養(yǎng)基購自美國Gibco公司,IFN-γ購自美國Proteintech公司,HBD3購自Novus公司,P38 MAPK通路抑制劑SB203580,EPK通路抑制劑U1026及JNK通路抑制劑SP600125購自上海碧云天公司,siHBD3、siNC由廣州銳博公司設(shè)計合成;riboFECTTMCP 轉(zhuǎn)染試劑購自廣州銳博公司,IFN-γ中和抗體、對照抗體購自美國R&D公司,總RNA提取試劑盒購自北京天根生物有限公司,逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自大連Takara生物有限公司,酶聯(lián)免疫吸附實驗 (ELISA)試劑盒購自武漢Elabscience公司,p38 MAPK、p-p38 MAPK、ERK及p-ERK抗體購自美國CST公司,JNK、p-JNK抗體購自美國Abcam公司,H1N1核蛋白(NP)抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司,GAPDH抗體、羊抗兔IgG二抗購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2 研究方法及觀察指標(biāo)

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) BEAS-2B細(xì)胞采用BEAS-2B細(xì)胞專用無血清培養(yǎng)基KCB M006,在37 ℃、5% CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2.2病毒增殖 H1N1接種于9 d齡雞胚尿囊腔中進(jìn)行增殖,37 ℃培養(yǎng)48 h后收集雞胚尿囊液,過濾后于-80 ℃保存。

1.2.3IFN-γ與HBD3 將BEAS-2B細(xì)胞以每孔1×108個/L接種于6孔板,培養(yǎng)48 h后吸棄培養(yǎng)基,分為對照組、不同濃度HBD3或IFN-γ處理組、25.0 μg/L IFN-γ組或1.00 mg/L HBD3組。對照組加入新鮮無血清DMEM培養(yǎng)基分別培養(yǎng)4 h、12 h、24 h、48 h;不同濃度HBD3或IFN-γ處理組分別用不同濃度的HBD3(0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L)或IFN-γ(12.5、25.0、50.0、100.0 μg/L)處理細(xì)胞12 h;25.0 μg/L IFN-γ組或1.00 mg/L HBD3組分別處理BEAS-2B細(xì)胞4 h、12 h、24 h、48 h。

1.2.4MAPK通路抑制劑 將BEAS-2B細(xì)胞以每孔1×108個/L接種于6孔板,培養(yǎng)48 h后吸棄培養(yǎng)基,對照組加入新鮮無血清DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h,其余各組分別使用p38 MAPK通路抑制劑SB203580(20 μmol/L)、ERK通路抑制劑U1026(20 μmol/L)、JNK通路抑制劑SP600125(10 μmol/L)處理BEAS-2B細(xì)胞1 h,吸棄上清后,用25.00 μg/L IFN-γ或1.00 mg/L HBD3處理細(xì)胞4 h。

1.2.5病毒感染和干預(yù) BEAS-2B細(xì)胞以再孔1×108個/L接種于6孔板,48 h后吸棄上清,分為對照組、HBD3和/或IFN-γ處理組、對照siRNA組(siNC)、HBD3 siRNA組(siHBD3)、對照抗體組(Control Ab組)、IFN-γ中和抗體組(IFN-γ Ab組)。對照組加入新鮮無血清培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng);HBD3和/或IFN-γ處理組分別用HBD3(1.00 mg/L)和/或IFN-γ(25.0 μg/L)處理細(xì)胞12 h后,5×TCID50H1N1感染BEAS-2B細(xì)胞1 h,吸棄上清,加入無血清DMEM處理12 h。siNC組、siHBD3組分別轉(zhuǎn)染對照siRNA(siNC,N Control_05815)或30 nmol/L hBD3 siRNA(siHBD3:5′-UGUGGAAAUGCCUUCUUAA-3′) 24 h,之后加入HBD3(1.00 mg/L)和/或IFN-γ(25.0 μg/L)處理細(xì)胞12 h后,5 × TCID50H1N1感染BEAS-2B細(xì)胞1 h,吸棄上清,加入無血清DMEM處理12 h。Control Ab組、IFN-γ Ab組分別用Control Ab(0.5 mg/L)或IFN-γ Ab(0.5 mg/L)以及HBD3(1.00 mg/L)和/或IFN-γ(25.0 μg/L)共同處理細(xì)胞12 h后,5×TCID50H1N1感染BEAS-2B細(xì)胞1 h,吸棄上清,加入無血清DMEM處理12 h。

1.2.6實時熒光定量PCR(quantitative reverse transcription,qRT-PCR)檢測目的分子基因水平 按照總RNA提取試劑盒步驟提取細(xì)胞總RNA,根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,將相應(yīng)的引物序列(表1)、cDNA、Ultra-SYBR Mixture等試劑按照說明書上的比例加入PCR 8聯(lián)管中、置于實時熒光定量PCR儀。反應(yīng)結(jié)束后記錄各組Ct值,所有樣本均設(shè)置3個復(fù)孔,以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作為內(nèi)參,使用2-ΔΔCt法分析相對基因表達(dá)量。

表1 qRT-PCR引物序列Tab.1 The primer sequences used for qRT-PCR

1.2.7酶聯(lián)免疫吸附試驗 (enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測HBD3和IFN-γ的蛋白量 處理后的BEAS-2B細(xì)胞用1×PBS洗滌2次后超聲破碎細(xì)胞,隨后12 000 r/min離心10 min,收集上清液,按照試劑盒操作說明書測定HBD3和IFN-γ的蛋白量。

1.2.8Western blot檢測蛋白表達(dá)量 蛋白樣品(20 μg)經(jīng)12% SDS-PAGE電泳分離蛋白,分離結(jié)束后濕轉(zhuǎn)到PVDF膜上。3%牛血清白蛋白封閉2 h,加入相應(yīng)一抗4 °C過夜。之后,用1× TBST洗膜3次,加入二抗室溫?fù)u床孵育1 h。使用電化學(xué)發(fā)光法對蛋白條帶進(jìn)行顯影,并通過Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 IFN-γ與HBD3相互誘導(dǎo)表達(dá)

濃度為12.5、25.0、50.0、100.0 μg/L IFN-γ分別處理BEAS-2B細(xì)胞12 h后,HBD3 mRNA和蛋白表達(dá)與對照組相比明顯增加(t=4.308、7.334、5.972、3.747,P<0.05或P<0.01;t=70.67、123.8、82.26、58.13,P<0.01),25.0 μg/L IFN-γ作用時HBD3蛋白表達(dá)達(dá)到峰值(t=50.21、36.31、51.7,P<0.01);0.25、0.50、1.00、2.00 mg/L HBD3分別處理細(xì)胞12 h后,IFN-γ的mRNA和蛋白表達(dá)與對照組相比明顯增加 (t=3.914、4.920、5.544、3.809,P<0.05或P<0.01;t=5.748、3.600、10.550、6.305,P<0.05或P<0.01),在1.00 mg/L HBD3作用時IFN-γ蛋白表達(dá)達(dá)到峰值(t=4.52、9.96、4.82,P<0.05或P<0.01)。用25.0 μg/L IFN-γ或1.00 mg/L HBD3分別處理BEAS-2B細(xì)胞4、12、24及48 h的結(jié)果顯示,25.0 μg/L IFN-γ處理不同時間,HBD3的mRNA和蛋白表達(dá)與對照組相比明顯增加(t=5.354、7.334、4.027,P<0.05或P<0.01;t=109.70、123.80、53.06、28.94,P<0.05或P<0.01),在12 h達(dá)到峰值;1.00 mg/L HBD3處理不同時間后,IFN-γ的mRNA和蛋白表達(dá)增加(t=5.852、8.727、5.544,P<0.01;t=22.890、10.550、9.221,P<0.01),在12 h達(dá)到峰值。見圖1、圖2。結(jié)果表明,IFN-γ與HBD3在BEAS-2B細(xì)胞中可相互誘導(dǎo)表達(dá),最佳誘導(dǎo)濃度分別為25.0 μg/L和1.00 mg/L,最佳誘導(dǎo)時間為12 h。

注:A、B為不同濃度IFN-γ對HBD3 mRNA及蛋白表達(dá)的影響,C、D為25.0 μg/L IFN-γ作用不同時間對HBD3 mRNA及蛋白表達(dá)的影響;與對照組(Con組)相比,(1)P<0.05,(2)P<0.01;與25.0 μg/L IFN-γ組相比,(3)P<0.01。圖1 IFN-γ對BEAS-2B細(xì)胞HBD3 mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effect of IFN-γ on HBD3 mRNA and protein expression in BEAS-2B cells

2.2 IFN-γ和HBD3通過MAPK通路相互誘導(dǎo)表達(dá)

用不同濃度的IFN-γ(100.0、50.0、25.0、12.5 μg/L)處理BEAS-2B細(xì)胞12 h,Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,p-JNK、p-ERK、p-p38 MAPK表達(dá)均明顯增加(t=10.720、10.450、8.436、8.038,P<0.01;t=10.47、33.22、12.52、70.06,P<0.01;t=13.250、13.720、8.366,P<0.01;圖3)。不同濃度的HBD3(2.00、1.00、0.50、0.25 mg/L)處理BEAS-2B細(xì)胞12 h后,Western blot結(jié)果顯示,與對照組相比,p-JNK在1.00 mg/L HBD3作用時表達(dá)顯著增加(t=7.015,P<0.01),p-ERK、p-p38 MAPK表達(dá)均明顯增加(t=10.720、11.570、17.160、6.066,P<0.01;t=20.27、18.25、17.18、18.24,P<0.01;圖4)。采用p38 MAPK通路抑制劑SB203580(20 μmol/L)、ERK通路抑制劑U0126(20 μmol/L)或JNK通路抑制劑SP600125(10 μmol/L)預(yù)處理BEAS-2B細(xì)胞,結(jié)果顯示,與25.0 μg/L IFN-γ組或1.00 mg/L HBD3組相比,SB203580、U0126及SP600125預(yù)處理可明顯降低IFN-γ誘導(dǎo)HBD3 mRNA及蛋白水平的增加(t=7.640、5.571、8.053,P<0.01;t=52.23、58.04、67.28,P<0.01)及HBD3誘導(dǎo)IFN-γ mRNA及蛋白水平的增加(t=4.718、5.484、4.927,P<0.01;t=5.395、5.599、6.234,P<0.01;圖5)。以上結(jié)果表明,IFN-γ和HBD3可通過MAPK通路相互誘導(dǎo)表達(dá)。

注:A、B為不同濃度HBD3對BEAS-2B細(xì)胞中IFN-γ mRNA及蛋白的表達(dá)的影響,C、D為1.00 mg/L HBD3作用不同時間對BEAS-2B細(xì)胞IFN-γ mRNA及蛋白表達(dá)的影響;與對照組(Con組)相比,(1)P<0.05,(2)P<0.01;與1.00 mg/L HBD3組相比,(3)P<0.05,(4)P<0.01。圖2 HBD3對BEAS-2B細(xì)胞IFN-γ mRNA及蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effect of HBD3 on IFN-γ mRNA and protein expression in BEAS-2B cells

注:A為p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38 MAPK、p38 MAPK蛋白條帶結(jié)果,B、C、D為p-JNK/JNK、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK比值;(1)與對照組(Con組)相比,P<0.01;與25.0 μg/L IFN-γ組相比,(2)P<0.05,(3)P<0.01。圖3 IFN-γ作用后BEAS-2B細(xì)胞p-p38 MAPK、p-ERK、p-JNK 蛋白表達(dá)Fig.3 Expression of p-p38 MAPK,p-ERK,and p-JNK protein in BEAS-2B cells after IFN-γ treatment

注:A為p-JNK、JNK、p-ERK、ERK、p-p38 MAPK、p38 MAPK蛋白條帶結(jié)果,B、C、D為p-JNK/JNK、p-ERK/ERK、p-p38 MAPK/p38 MAPK定量結(jié)果;(1)與對照組(Con組)相比,P<0.01;與1.00 mg/L HBD3組相比,(2)P<0.05,(3)P<0.01。圖4 HBD3作用后BEAS-2B細(xì)胞p-p38 MAPK、p-ERK、p-JNK 蛋白表達(dá)Fig.4 Expression of p-p38 MAPK,p-ERK,and p-JNK protein in BEAS-2B cells after HBD3 treatment

注:A、B分別為HBD3 mRNA相對表達(dá)水平及蛋白濃度,C、D分別為IFN-γ mRNA相對表達(dá)水平及蛋白濃度;(1)與單獨IFN-γ(25.0 μg/L)+或HBD3(1.00 mg/L)+組相比,P<0.01;(2)與SB203580、U0126、SP600125、0.1%DMSO、IFN-γ全-組相比,P<0.01。圖5 MAPK通路抑制劑對BEAS-2B細(xì)胞HBD3和IFN-γ表達(dá)水平的影響Fig.5 Effect of MAPK pathway inhibitors on the expression level of HBD3 and IFN-γ in BEAS-2B cells

2.3 IFN-γ和HBD3相互誘導(dǎo)增強(qiáng)抗IAV作用

用25.0 μg/L IFN-γ和/或1.00 mg/L HBD3處理BEAS-2B細(xì)胞12 h后,用5×TCID50H1N1感染細(xì)胞1 h。結(jié)果顯示,HBD3和IFN-γ單獨或聯(lián)合作用均可有效抑制H1N1 NP mRNA及蛋白表達(dá)(t=7.986、4.645、12.090,P<0.01;t=20.22、13.20、25.37,P<0.01),且2者聯(lián)合使用對H1N1 NP mRNA及蛋白表達(dá)的抑制效果更佳(t=4.105、7.445,P<0.05或P<0.01;t=5.150、12.170,P<0.05或P<0.01);轉(zhuǎn)染siHBD3或IFN-γ中和抗體作用后,用5×TCID50H1N1感染細(xì)胞1 h,H1N1 NP的mRNA及蛋白水平的結(jié)果顯示,siHBD3轉(zhuǎn)染顯著減弱了IFN-γ對H1N1 NP mRNA及蛋白的抑制作用(t=17.25,P<0.01;t=16.92,P<0.01);然而,IFN-γ中和抗體作用后HBD3對H1N1 NP mRNA及蛋白的抑制作用均無顯著影響(t=2.00,P>0.05;t=0.44,P>0.05)。見圖6、圖7。

3 討論

黏膜上皮細(xì)胞分泌的抗病毒蛋白在IAV感染過程中發(fā)揮著重要作用,病毒感染早期或期間誘導(dǎo)抗病毒蛋白的生成有助于提高宿主抵抗病毒的能力[19]。研究表明,在BEAS-2B細(xì)胞中,表沒食子兒茶素沒食子酸酯可誘導(dǎo)IFN-λ的分泌抑制IAV感染[20]。此外,流感病毒感染后呼吸道上皮細(xì)胞分泌的BD-3和IFN-γ在宿主恢復(fù)過程中也起著重要的作用[8-9]。BD-3屬于β防御素家族,具有很強(qiáng)的抗病毒活性。BD-3可通過破壞IAV的包膜,阻止IAV進(jìn)入細(xì)胞并誘導(dǎo)其他抗病毒蛋白的生成來抑制IAV[10]。IFN-γ由活化的T細(xì)胞、NK細(xì)胞及呼吸道上皮細(xì)胞生成[8,21-24]。IFN-γ的生成對病毒的清除及適應(yīng)性免疫的發(fā)展至關(guān)重要,其可通過誘導(dǎo)ISGs的表達(dá)抑制IAV復(fù)制[13-14]。盡管之前的研究已表明BD-3及IFN-γ可抑制IAV,但2者的抗IAV機(jī)制仍不清楚,進(jìn)一步探索BD-3及IFN-γ的抗IAV機(jī)制有助于更好地防治IAV感染。

注:A、B、C表示H1N1 NP mRNA表達(dá)水平;(1)與單H1N1+組相比,P<0.01;與H1N1、IFN-γ、HBD3全+組相比,(2)P<0.05,(3)P<0.01;(4)與H1N1、IFN-γ、siHBD3全+組相比,P<0.01。圖6 BEAS-2B細(xì)胞H1N1、IFN-γ、HBD3、siHBD3、IFN-γ Ab單獨或聯(lián)合作用對H1N1 NP mRNA表達(dá)的影響Fig.6 Effects of H1N1,IFN-γ,HBD3,siHBD3,and IFN-γ Ab alone or their combination on H1N1 NP mRNA expression in BEAS-2B cells

注:A、C、E分別為NP蛋白條帶結(jié)果,B、D、F為NP蛋白定量結(jié)果;(1)與單H1N1+組相比,P<0.01;與H1N1、IFN-γ、HBD3全+組相比,(2)P<0.05,(3)P<0.01;(4)與H1N1、IFN-γ、siHBD3全+組相比,P<0.01。圖7 BEAS-2B細(xì)胞H1N1、IFN-γ、HBD3、siHBD3、IFN-γ Ab單獨或聯(lián)合作用對H1N1 NP蛋白表達(dá)的影響Fig.7 EffectS of H1N1,IFN-γ,HBD3,siHBD3,and IFN-γ Ab alone or their combination on H1N1 NP Protein expression level in BEAS-2B cells

抗病毒蛋白可通過誘導(dǎo)其他抗病毒細(xì)胞因子的表達(dá)增強(qiáng)其抗病毒功能。此前的研究表明,在不同細(xì)胞中BD-3和IFN-γ可相互誘導(dǎo)表達(dá)。例如,在角質(zhì)細(xì)胞和人臍靜脈內(nèi)皮中,IFN-γ可誘導(dǎo)BD-3 mRNA的表達(dá)[15-16]且BD-3可誘導(dǎo)NK細(xì)胞中IFN-γ的分泌[11]。本研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ作用后HBD3表達(dá)明顯升高,同時,HBD3作用后IFN-γ表達(dá)也明顯增加。結(jié)果表明,在BEAS-2B細(xì)胞中,HBD3與IFN-γ可相互誘導(dǎo)表達(dá)。然而,HBD3與IFN-γ的相互誘導(dǎo)并不是劑量依賴性的,這可能與HBD3和IFN-γ免疫調(diào)節(jié)的雙重作用有關(guān)。研究表明,IFN-γ可抑制流感病毒感染后期的抗菌防御[25],而HBD3在抗菌活性及炎癥反應(yīng)方面有著雙重作用[26]。

多項研究表明,HBD3和IFN-γ的生成與MAPK信號通路相關(guān)[17-18]。穿心蓮內(nèi)酯、冬凌草素及異甘草素可通過p38、ERK、JNK信號通路誘導(dǎo)腸上皮細(xì)胞中HBD3的表達(dá),并且牙齦卟啉單胞菌感染后可通過p38、ERK信號通路誘導(dǎo)IFN-γ的生成[27-28]。本研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ及HBD3可明顯增加p-p38 MAPK、p-ERK及p-JNK蛋白表達(dá),且抑制p38 MAPK、ERK及JNK信號通路后可明顯減少IFN-γ與HBD3的相互誘導(dǎo)表達(dá)。以上結(jié)果表明,IFN-γ及HBD3可通過MAPK通路相互誘導(dǎo)表達(dá)。

HBD3和IFN-γ是重要的抗病毒蛋白[29-30]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),BD-3可通過抑制IAV吸附和進(jìn)入過程抑制IAV的復(fù)制[10]。也有研究發(fā)現(xiàn),重組鴨IFN-γ在體內(nèi)外均可抑制流感病毒H5N1的復(fù)制[14]。本研究發(fā)現(xiàn)HBD3和IFN-γ可顯著抑制H1N1 NP的表達(dá),且HBD3和IFN-γ聯(lián)合作用的抑制作用更顯著。這與此前的研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以促進(jìn)IFNα/β的抗病毒作用相似[31-32]。Tewary等[33]的研究發(fā)現(xiàn),HBD3可增加IFN表達(dá),并增加機(jī)體免疫作用。這些結(jié)果表明,HBD3與IFN-γ的聯(lián)合抗IAV作用可能與其相互誘導(dǎo)作用有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),沉默HBD3減弱了IFN-γ對H1N1 NP表達(dá)的抑制作用。然而,IFN-γ中和抗體作用后對HBD3抑制H1N1 NP表達(dá)的作用無顯著影響。這可能是由于HBD3能夠直接殺死IAV,而IFN-γ必須通過誘導(dǎo)ISGs或其他抗病毒蛋白的生成才能發(fā)揮其抗病毒活性。然而,本研究中HBD3誘導(dǎo)IFN-γ生成的量不足以誘導(dǎo)ISGs或其他抗病毒蛋白的生成。

綜上所述,本研究結(jié)果表明,在BEAS-2B細(xì)胞中,HBD3和IFN-γ可通過MAPK信號通路相互誘導(dǎo)發(fā)揮抗IAV作用。這一結(jié)果也揭示了宿主免疫蛋白HBD3及IFN-γ抗IAV的新機(jī)制。但HBD3和IFN-γ的抗病毒作用不僅限于誘導(dǎo)相關(guān)的抗病毒蛋白,還包括免疫細(xì)胞的激活、適應(yīng)性免疫及免疫平衡的調(diào)節(jié)[34-35]。為了全面了解HBD3和IFN-γ相互誘導(dǎo)抑制IAV的機(jī)制,在之后的研究中將使用動物模型研究HBD3和IFN-γ的相互誘導(dǎo)機(jī)制以及其在體內(nèi)的抗IAV作用,為HBD3和IFN-γ的臨床應(yīng)用建立理論基礎(chǔ)。