■ 王凱 沈娟娟 阮鵬飛

（1 江門市澳保生物科技有限公司；2 江門市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心）

我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，隨著集約化養(yǎng)殖，水產(chǎn)動(dòng)物疾病呈多發(fā)、復(fù)雜狀態(tài)，生存環(huán)境惡化。由于預(yù)防并治療魚病等原因，人為在飼料中添加大量抗生素，這種方式帶來(lái)了一系列問(wèn)題，比如藥物殘留、耐藥性及其毒副作用等，這些問(wèn)題嚴(yán)重危害著水產(chǎn)品安全與人類健康。針對(duì)這一現(xiàn)狀，在水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中使用替抗產(chǎn)品迫在眉睫。

抗菌肽（Antimicrobial peptide；AMP）是一類兩親性陽(yáng)離子型短肽，長(zhǎng)度約為10～100個(gè)氨基酸殘基。作為先天性免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，抗菌肽是自然界在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中形成的一類天然抗病活性多肽因子，在所有生物防御外源病原微生物的第一道防線中起著不可或缺的重要作用。

植物精油屬于天然、綠色、無(wú)殘留物質(zhì)，具有來(lái)源廣泛、抗菌譜廣、作用迅速、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。牛至油已被我國(guó)農(nóng)業(yè)部批準(zhǔn)作為一種可長(zhǎng)期添加的藥物飼料添加劑，從而說(shuō)明天然植物提取物有望替代抗生物，具有較大的市場(chǎng)潛力。本研究針對(duì)從市場(chǎng)上收集的抗菌肽樣品和植物精油樣品進(jìn)行體外抑菌實(shí)驗(yàn)，比較所有樣品對(duì)水產(chǎn)常見致病菌大腸桿菌、副溶血弧菌、 嗜水氣單胞菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、鰤?mèng)~諾卡氏菌、無(wú)乳鏈球菌、維氏氣單胞菌等的抑菌效果對(duì)比，從而篩選出有顯著抑菌作用效果的抗菌肽和植物精油產(chǎn)品，為實(shí)際養(yǎng)殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

表2 不同抗菌肽產(chǎn)品和植物精油產(chǎn)品對(duì)致病菌的最小抑菌濃度

1.1.1 指示菌株

大腸桿菌（Escherichiacoli）、副溶血弧菌（Vibrio Parahemolyticus）、 嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）、遲鈍愛(ài)德華氏菌（Edwardsiella tarda）、鰤?mèng)~諾卡氏菌（Nocardia seriolae） 、 無(wú)乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii），以上菌種均由江門市澳保生物科技有限公司菌種保藏中心提供。

1.1.2 抗菌肽和植物精油

10 個(gè)不同廠家生產(chǎn)的抗菌肽（Antimicrobial peptide, AP）和植物精油產(chǎn)品均為市售產(chǎn)品，由江門市澳保生物科技有限公司收集。10個(gè)抗菌肽產(chǎn)品分別標(biāo)記為AP-1、AP-2、A P-3、A P-4、A P-5、A P-6、AP-7、AP-8、AP-9、AP-10，植物精油產(chǎn)品分別為桉葉素、香芹酚、肉桂醛、百里香酚。

1.1.3 培養(yǎng)基

TCBS培養(yǎng)基購(gòu)自北京陸橋技術(shù)股份有限公司；大豆酪蛋白瓊脂培養(yǎng)基（TSA）、腦心浸出液肉湯（BHI）、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.1.4 儀器設(shè)備

超凈工作臺(tái)（SW-CJ-1D）：購(gòu)自蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司；紫外分光光度計(jì)：購(gòu)自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；恒溫震蕩搖床（THZ-98AB）和生化培養(yǎng)箱（LRH-70）：購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；超聲儀（KQ-400E）：昆山市超聲儀器有限公司；購(gòu)自滅菌鍋（BKQ-B50Ⅱ）：購(gòu)自山東科博儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同抗菌肽產(chǎn)品和植物精油產(chǎn)品對(duì)致病菌的抑菌試驗(yàn)

1.2.1.1 抑菌圈測(cè)定

菌液制備：分別將大腸桿菌、嗜水氣單胞菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、無(wú)乳鏈球菌、維氏氣單胞菌接種在營(yíng)養(yǎng)平板上，副溶血弧菌接種在TCBS平板上，37℃培養(yǎng)24h；鰤?mèng)~諾卡氏菌接種在TSA上，28℃培養(yǎng)。將培養(yǎng)后的單菌落接種至50mL的無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，鰤?mèng)~諾卡氏菌接種在BHI液體培養(yǎng)基中，分別震蕩培養(yǎng)24h。

測(cè)試菌的配制：將上述測(cè)試菌培養(yǎng)液放置于常溫后，置分光光度計(jì)于600nm處測(cè)吸光值至1.0，并將上述菌液稀釋10倍備用。

培養(yǎng)皿制備：將滅菌后的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基放置到60℃左右開始倒培養(yǎng)皿 ，每個(gè)培養(yǎng)皿倒15～20mL左右，倒好后水平靜置使其在水平臺(tái)面上凝固，備用。

樣品制備：10%溶液制備：精密稱定待測(cè)的試樣5.00g，加入滅菌水45.00g，配制成10%溶液，40℃超聲水浴15min使其溶解。吸取適量上述溶液于離心管中，10,000rpm離心5min，取上清液過(guò)0.45μm濾膜，濾液作供試樣品溶液。

表3 不同抗菌肽產(chǎn)品和植物精油聯(lián)合使用對(duì)致病菌的抑菌效果

試驗(yàn)菌的接種：用移液槍吸取步驟1.2菌懸液0.1mL，將其移至到已經(jīng)倒好的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)皿內(nèi)，用涂布棒涂布均勻，蓋好培養(yǎng)皿。

添加抑菌劑：用消毒的打孔器在培養(yǎng)皿上打孔，各孔中心之間相距25mm以上，用移液槍吸取100μL溶液至瓊脂孔內(nèi)，蓋好培養(yǎng)皿，正置培養(yǎng)。

結(jié)果的判定：經(jīng)37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，無(wú)透明的抑菌圈，則沒(méi)有抑菌作用；有透明的抑菌圈，則有抑菌作用，抑菌圈越大表示樣品對(duì)檢測(cè)菌的抑制作用越強(qiáng)。

1.2.2 不同抗菌肽產(chǎn)品和植物精油產(chǎn)品對(duì)致病菌的最小MIC測(cè)定

選取上述試驗(yàn)中抑菌效果最好的植物精油作為后續(xù)試驗(yàn)所用的植物精油。采用二倍稀釋法結(jié)合抑菌圈測(cè)定最小抑菌濃度，稀釋后的濃度分別為1000、500、250、125、62.5ug/mL，然后按照1.2.1方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。培養(yǎng)結(jié)束后，查看加對(duì)應(yīng)濃度的孔是否出現(xiàn)透明的抑菌圈，則最低濃度出現(xiàn)抑菌圈的濃度極為最小抑菌濃度。

1.2.3 不同抗菌肽產(chǎn)品和植物精油聯(lián)合使用對(duì)致病菌的抑菌試驗(yàn)

根據(jù)抑菌試驗(yàn)結(jié)果，篩選出抑菌效果好的抗菌肽和植物精油產(chǎn)品，然后將抗菌肽產(chǎn)品和植物精油分別按1∶1進(jìn)行復(fù)配，按1.2.1方法進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同抗菌肽產(chǎn)品和植物精油產(chǎn)品對(duì)致病菌的抑菌試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)所有收集的抗菌肽和植物精油樣品進(jìn)行的抑菌試驗(yàn)結(jié)果如表1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)抗菌肽產(chǎn)品AP-1、AP-2、AP-4具有廣譜抑菌作用，其中AP-1和AP-4抑菌作用更強(qiáng)。植物精油香芹酚、肉桂醛和百里香酚較桉葉素均有更好的抑菌作用。

表1 不同抗菌肽產(chǎn)品和植物精油產(chǎn)品對(duì)致病菌的抑菌效果

3 討論

隨著抗生素的禁用，綠色、安全、無(wú)殘留的微生態(tài)制劑和植物提取物成為研究的焦點(diǎn)。目前，抗菌肽和植物精油已廣泛用于醫(yī)藥、食品和化妝品行業(yè)。張靜等發(fā)現(xiàn)百里香酚和香芹酚因其獨(dú)特的芳香味對(duì)動(dòng)物有很好的誘食作用，且具有很好的殺菌效果，其中丁香酚具有廣譜抗菌性，特別是對(duì)大腸桿菌抑制效果最為明顯。王新偉等研究表明，香芹酚、肉桂醛對(duì)大腸桿菌有明顯的抑制作用。胡艷芬等研究發(fā)現(xiàn)，香芹酚對(duì)大腸桿菌有很好的抑制作用。張赟彬等發(fā)現(xiàn)肉桂醛影響細(xì)菌的膜通透性，而成倍數(shù)增長(zhǎng)的核酸、蛋白質(zhì)含量表示胞膜的完整性遭到破壞，

肉桂醛降低菌體膜電位，影響其代謝活性，從而抑制細(xì)菌生長(zhǎng)，對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌有極強(qiáng)的抑菌作用。許君茹等發(fā)現(xiàn)抗菌肽對(duì)革蘭陽(yáng)性菌和革蘭陰性菌均有一定程度的抑制作用，其對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的最小MIC分別為20ug/mL、20ug/mL和40ug/mL。而在本研究中抗菌肽AP-1和AP-4、植物精油香芹酚、肉桂醛和百里香酚對(duì)大腸桿菌的最小MIC為125ug/mL。羅振福等也報(bào)道了天蠶素對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑制作用。然而不同文獻(xiàn)報(bào)道的植物精油和抗菌肽對(duì)細(xì)菌的最小MIC值存在一定的差異，這可能與不同廠家的抗菌肽和植物精油的純度有關(guān)。這與本試驗(yàn)抑菌結(jié)果及最小MIC結(jié)果一致，不同廠家抗菌肽和植物精油對(duì)不同致病菌的抑菌作用有所差異，其對(duì)致病菌的抑菌作用越強(qiáng)，其最小MIC越小，反之亦然。

為驗(yàn)證植物精油單獨(dú)使用時(shí)和其它抑菌分子聯(lián)合起來(lái)使用的效果對(duì)比，眾多學(xué)者開展相關(guān)研究。張皓然等報(bào)道，植物精油與檸檬酸復(fù)合使用時(shí)具有協(xié)同作用，對(duì)大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌均有較好的抑制效果。王康莉?qū)⒅参锞瓦M(jìn)行復(fù)配，使用牛津杯法研究其抑菌效果，研究報(bào)道將肉桂醛與香蘭素按照 4∶1進(jìn)行復(fù)配時(shí)，對(duì)金黃色葡萄菌與沙門氏菌表現(xiàn)出最強(qiáng)的抑制效果。在本研究中，抗菌肽AP-1和AP-4和4種植物精油分別按照1∶1進(jìn)行復(fù)配，對(duì)各致病菌的抑菌作用較單一產(chǎn)品的抑菌作用效果顯著提升。為產(chǎn)品抑菌效果提升提供新思路。

4 結(jié)論

本文研究了10個(gè)廠家生產(chǎn)的抗菌肽產(chǎn)品和4種植物精油對(duì)大腸桿菌、副溶血弧菌、 嗜水氣單胞菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、鰤?mèng)~諾卡氏菌、無(wú)乳鏈球菌、維氏氣單胞菌的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)不同抗菌肽和植物精油的抑菌功能有極大差異，其中抗菌肽AP-1和AP-4抑菌作用最佳，植物精油除桉葉素以外，其它3個(gè)植物精油均有較強(qiáng)的抑菌作用。通過(guò)對(duì)抗菌肽AP-1和AP-4及植物精油香芹酚、肉桂醛和百里香酚對(duì)致病菌的最小抑菌濃度檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)植物精油對(duì)各菌的最小抑菌濃度基本在125ug/mL就有抑菌作用，抗菌肽AP-1和AP-4對(duì)不同菌的最小抑菌濃度有較大差異，基本在125ug/mL～500ug/mL之間。對(duì)抗菌肽AP-1、AP-4和4種植物精油之間的相互作用也進(jìn)行了研究，AP-1、AP-4和4種植物精油復(fù)配后對(duì)各致病菌的抑菌作用較單一產(chǎn)品的抑菌作用效果顯著提升，表明它們之間存在協(xié)同增效的作用，為實(shí)際產(chǎn)品應(yīng)用提供可行性參考。