李軍義，劉娣，馬紅，汪亮，霍秀鵬，郝麗*

（1.東北林業(yè)大學野生動物與自然保護地學院，哈爾濱，150040；2.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所，哈爾濱，150086）

排卵與黃體生成是所有哺乳動物繁殖所必需的，對繁殖性能至關重要。排卵前卵泡顆粒細胞（GC）中的多個信號通路會被黃體生成素激活，這些通路中包含CEBPB所在的信號通路。CEBPB是亮氨酸拉鏈蛋白家族成員之一，已被證明在多種細胞類型中具有調(diào)節(jié)細胞增殖和分化及免疫調(diào)節(jié)的作用，如脂肪生成（前脂肪細胞）［1］、免疫反應（單核細胞和巨噬細胞）［2］、蛻膜（子宮基質(zhì)細胞）［3］和乳腺上皮細胞分化等［4?6］。在排卵過程中CEBPB基因的增加受到黃體生成素的調(diào)節(jié)，而CEBPB基因的缺失會最終導致生殖缺陷［7］。

MicroRNAs（miRNAs）是一類內(nèi)源性非編碼調(diào)控RNA，長度為18～23 個核苷酸，在轉(zhuǎn)錄后水平負調(diào)控基因表達。miRNA 在許多生物過程中具有關鍵調(diào)節(jié)作用，包括細胞增殖、分化和發(fā)育等［8］。自然界中廣泛存在的生物發(fā)光有機體（如細菌、真菌、魚和昆蟲等）中，催化生物發(fā)光反應的為熒光素酶（luciferase），底物為熒光素（luciferin）。熒光素酶可以催化熒光素氧化，同時發(fā)出生物熒光（bioluminescence），運用熒光測定儀（即化學發(fā)光儀，luminometer）可以檢測出生物的熒光強度，當?shù)孜镞^量時，發(fā)光量總值與樣品熒光酶活性成正比，從而可對熒光素酶報告基因的表達進行間接估計［9］。

哺乳動物黃體正常生成與排卵對于動物的繁殖極為重要，miR-155 是否可以通過靶向CEBPB 調(diào)節(jié)黃體生成素的激增，進而調(diào)節(jié)排卵功能的分子機制尚不清楚。王富霞等［10］研究表明，過表達miR-155可以顯著抑制NSCLC 細胞的增殖、遷移及侵襲。本研究通過過表達miR-155 后檢測與繁殖性能相關基因的變化規(guī)律，進而推測miR-155 與卵泡顆粒細胞增殖的關系，通過雙熒光素基因報告載體方法 驗證兩者之間關系，為后續(xù)動物繁殖研究提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 CEBPB基因3′UTR雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒構建

從miRbase 官網(wǎng)基因數(shù)據(jù)庫中獲取miR-155的成熟序列。通過在線生物信息學網(wǎng)站（www.targetscan.org）分析miR-155 的靶基因（圖1），推測CEBPB基因是miR-155 的一個靶基因。根據(jù)預測，定點缺失種子序列的堿基，構建野生型與突變型雙熒光素酶報告基因質(zhì)粒（圖2）。

圖1 miR-155靶基因預測Fig.1 miR-155 target gene prediction

圖2 miR-155結合位點突變示意圖Fig.2 Schematic diagram of binding site mutation

1.2 引物設計

使用Primer 5.0 設計定量引物，反轉(zhuǎn)錄引物為通用引物。miR-155、CEBPB及U6 的定量和反轉(zhuǎn)錄引物如表1 所示，CEBPB3′UTR 野生型與突變型的引物如表2所示。

表1 miR-155和U6的定量與反轉(zhuǎn)錄引物Tab.1 Quantification of miR-155 and U6 with transactivation primers

表2 CEBPB 3′UTR野生型與突變型的引物Tab.2 Primers for wild type and mutant type of CEBPB 3′UTR

1.3 pMD18-T-野生型與突變型質(zhì)粒構建

以民豬的組織基因組為模板，以表2 中設計的序列為引物，PCR 獲取CEBPB基因的野生型與突變型3′UTR 序列。PCR 擴增體系：2×TaqMaster Mix 10.0 μL；上下游引物（10 μmol/L）各0.5 μL；模板1.0 μL；ddH2O 補齊 至20.0 μL。PCR 反應 參數(shù)：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，50～60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸4 min，共計32 個循環(huán)；72 ℃延伸 5 min；16 ℃保持1 min。參照EasyPure Quick Gel Ex?traction Kit 進行純化回收。回收得到的目的片段與T 載體過夜相連，轉(zhuǎn)化入感受態(tài)細胞，經(jīng)菌液PCR 鑒定后陽性菌落送吉林省庫美生物科技股份有限公司測序。參考FastFilter Plasmid DNA Mini Kit D6944說明書抽提陽性菌液質(zhì)粒用于后續(xù)試驗。

1.4 CEBPB 基因野生型與突變型雙熒光素酶報告載體構建

XhoⅠ和NotⅠ雙酶切psi-Check-2 空載體及測序正確的含有野生型與突變型重組T 載體。將雙酶切獲得的野生型與突變型片段分別連接到線性化的psi-Check-2載體中，載體構建步驟同1.3。

1.5 重組質(zhì)粒的功能驗證

將重組質(zhì)粒與miR-155 的mimics 和inhibitor 共轉(zhuǎn)染入PK15 細胞，設NC 為對照組，24 h 后檢測各組細胞的相對熒光強度。

1.6 反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR

將miR-155 的mimics 和inhibitor 分別轉(zhuǎn)染入PK15 細胞，24 h 后收取細胞提取總RNA，參照Ta?KaRa RR047A 反轉(zhuǎn)錄試劑盒與TaKaRa RR820A 熒光定量試劑盒分別進行反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR。

2 結果

2.1 目的DNA片段重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將構建的pMD18-T-wt 質(zhì)粒和pMD18-T-mut 質(zhì)粒雙酶切，凝膠電泳后在423、378 bp 左右獲得條帶（圖3），符合預期大小，說明克隆片段成功連入T載。

圖3 pMD18-T-wt質(zhì)粒和pMD18-T-mut質(zhì)粒雙酶切鑒定Fig.3 Identification of pMD18-T-wt plasmid and pMD18-T-mut plasmid by double digestion

2.2 目的DNA片段測序

將野生型和突變型的基因測序結果用DANMAN 軟件進行序列比對，結果如圖4所示，野生型基因片段相似性為100%，突變型成功突變掉種子區(qū)域片段。

圖4 野生型和突變型比對結果Fig.4 Comparison results of wild type and mutant

2.3 重組真核表達質(zhì)粒雙酶切鑒定

將構建的psi-Check-2-wt 質(zhì)粒（圖5）和psi-Check-2-mut 質(zhì)粒（圖6）進行雙酶切，凝膠電泳后在423、378 bp 左右獲得條帶，符合預期大小，說明克隆片段成功連入真核表達載體中。

圖5 psi-Check-2-wt雙酶切鑒定Fig.5 psi-Check-2-wt double enzyme digestion identification

圖6 psi-Check-2-mut雙酶切鑒定Fig.6 psi-Check-2-mut double enzyme digestion identification

2.4 雙熒光素酶相對活性檢測

將野生型（wt）和突變型（mut）雙熒光酶報告基因重組質(zhì)粒分別與miR-155 mimics 和miR-155 in?hibitor共轉(zhuǎn)染到PK15細胞，NC作為對照。結果如圖7A 所示，與NC 相比，miR-155 mimics 顯著抑制了野生型質(zhì)粒的熒光素酶相對活性（p<0.05）；與NC組相比（圖7B），miR-155 inhibitor對野生型質(zhì)粒熒光相對活性的抑制無顯著性差異，同時對突變型質(zhì)粒熒光素酶活性抑制也不明顯，結果表明，miR-155與CEBPB的靶向結合與預期相符，miR-155對CEBPB具有靶向調(diào)節(jié)作用。

圖7 wt和mut相對熒光素酶活性Fig.7 Relative luciferase activities of wt and mut

2.5 miR-155 mimics 與inhibitor 轉(zhuǎn)染后CEBPB基因的表達

miR-155 mimics與miR-155 inhibitor分別轉(zhuǎn)染到PK15 細胞中，24 h 后收取細胞，提取細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄、實時熒光定量檢測miR-155 以及CEBPB基因的表達變化。結果表明，與轉(zhuǎn)染陰性對照組相比，轉(zhuǎn)染miR-155 mimics 促使miR-155 過表達（p<0.001）（圖8A），基因CEBPB表達受到抑制（p<0.001）；轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor 結果正好與mimics 組相反，miR-155 的表達受到抑制，而基因CEBPB的表達得到促進（p<0.05）（圖8B）。在miR-155 mimics組繁殖性能相關基因BMP1、PPARG的表達量受到顯著抑制（圖8C）；BMP1、PPARG在miR-155 inhibtor 組的表達量顯著升高（p<0.05）（圖8D）。

圖8 miR-155的mimics和inhibitor轉(zhuǎn)染結果Fig.8 Results of the mimics and inhibitor transfection of miR-155

3 討論

CEBPB是轉(zhuǎn)錄因子CEBP 家族中極其重要的一員。CEBPB主要通過信號傳導途徑來發(fā)揮其功能，它能對多種胞外信號分子產(chǎn)生應答，進而對靶基因的表達水平進行調(diào)節(jié)［11］。排卵過程受到轉(zhuǎn)錄因子的影響，CEBPB是其中的轉(zhuǎn)錄因子之一［12］。在排卵前的卵泡中，CEBPB增加受黃體生成素的調(diào)節(jié)，并且以依賴ERK1/2 的方式激活［13］。有針對性地破壞CEBPB基因會導致卵巢和子宮的生殖缺陷［14］，如排卵與黃體化失敗、膜退化和增殖等。miR-155是一個多功能小RNA 分子，在細胞增殖、分化和免疫等方面均發(fā)揮重要的作用，它可以靶向目標基因影響其發(fā)揮功能。有研究證明，miR-155 在多卵巢綜合征（PCOS）組大鼠卵巢組織中的表達量顯著增高［15］。此外，miR-155 在RIF 患者子宮內(nèi)膜中也表現(xiàn)出表達量上調(diào)，并且有可能通過調(diào)控MMP16基因來影響子宮內(nèi)膜的容受性［16］。miR-155 基因敲減的小鼠被證明無優(yōu)勢卵泡，有較多小卵泡，無黃體，顆粒細胞減少，卵泡膜明顯增厚，間質(zhì)細胞增生顯著［15］。復發(fā)性流產(chǎn)小鼠體內(nèi)miR-155 表達下調(diào)；正常懷孕的小鼠，其早孕著床過程的子宮內(nèi)膜組織中，miR-155的表達量隨著妊娠時間增加也出現(xiàn)下調(diào)的趨勢［17］。因此，miR-155對繁殖性能具有重要的調(diào)節(jié)作用。

本研究結果表明，CEBPB是miR-55 的靶基因，兩者具有負向調(diào)控的作用。miR-155 mimics wt 組熒光素酶的活性受到顯著抑制，實時熒光定量結果表現(xiàn)為miR-155 mimics組CEBPB的相對表達量相對于NC 組明顯受到抑制（p<0.05），而miR-155 inhibitor組CEBPB的相對表達量顯著升高（p<0.05）。Oliveira等［18］研究表明，miR-155與CEBPB、HOMAIR 和血漿纖維蛋白原呈負相關，與血清脂聯(lián)素呈正相關，本研究結果與其相似。繁殖性能相關基因BMP1、PPARG與miR-155 的表達水平在體外水平呈負相關。BMP1可以靶向靶基因促進體外培養(yǎng)顆粒細胞增殖并抑制細胞凋亡［19］；PCOS病人體內(nèi)PPARG的表達量明顯降低，PPARG缺失型剪接變體過表達后的細胞增殖、遷移及凋亡均下調(diào)，表明PPARG可以調(diào)節(jié)卵母細胞的增殖凋亡等［20］，而miR-155 可能通過抑制BMP1與PPARG基因的表達水平進而抑制顆粒細胞的增殖與凋亡等。

雙熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)具有諸多優(yōu)點，如無細胞毒性、反應靈敏且穩(wěn)定等，該系統(tǒng)中的螢火蟲和海腎熒光素酶能催化熒光素氧化并發(fā)出可量化的熒光，目前在轉(zhuǎn)錄水平和信號通路等方面得到廣泛應用，可用于microRNA 與基因是否具有靶向關系的驗證。李池慧等［21］應用該技術構建了KSR2基因3′UTR 雙熒光素酶報告基因載體并且驗證了hcmvmiR-UL70-3p 和hcmv-miR-US4-3p 靶向關系。本研究表明miR-155 可以靶向結合CEBPB基因的3′UTR，表明miR-155與CEBPB存在靶向關系，之后可以通過轉(zhuǎn)染miR-155 的mimics 和inhibitor 觀察兩者之間的具體關系，為后續(xù)研究miR-155與CEBPB在卵細胞中的調(diào)控關系做準備。