周艷　莫雨杏　劉淑藝　李衛(wèi)錦　黎海利　劉鍇棟

關(guān)鍵詞：番荔枝；生長素響應(yīng)因子；生物信息學(xué)分析；花發(fā)育；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S667.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

番荔枝（Annona squamosa L.），也稱為釋迦果，屬番荔枝科植物，是熱帶、亞熱帶地區(qū)的著名水果，分布于福建、廣西、廣東、海南、云南等地[1]。由于番荔枝的葉柄抱嵌著葉芽，所以葉片不脫落，葉芽則無法萌發(fā)[2-3]。番荔枝的花具有雌雄異熟且雌蕊先熟的特點(diǎn)，常常出現(xiàn)花發(fā)育異常和畸形花現(xiàn)象，導(dǎo)致“花而不實(shí)”、結(jié)果率低等問題，從而限制了番荔枝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4-6]。

生長素響應(yīng)因子（auxin response factor， ARF）位于生長素信號(hào)傳遞途徑中的核心位置，能夠通過調(diào)控生長素信號(hào)，以調(diào)控生長素相應(yīng)基因的表達(dá)，從而影響植物的生長發(fā)育[7-8]。ARF 基因一般以基因家族的形式存在，通常有3 個(gè)經(jīng)典的蛋白保守結(jié)構(gòu)域：DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD），中間結(jié)構(gòu)域（MR）和C 末端二聚化結(jié)構(gòu)（CTD）[8]。ARF 通過識(shí)別并且結(jié)合位于生長素響應(yīng)基因啟動(dòng)子中的生長素響應(yīng)元件AuxREs（TGTCTC），抑制或激活下游響應(yīng)基因的表達(dá)[9]，并且ARF 能夠通過與AUX/IAA 形成二聚體，影響ARF 蛋白質(zhì)間的相互作用[8]。近年來，越來越多的ARF 被報(bào)道可能參與了植物花的發(fā)育。番茄SlARF1、SlARF9、SlARF11、SlARF15 和SlARF16 參與調(diào)控花的發(fā)育，均在花發(fā)育過程中表達(dá)，且SlARF16在花芽中表達(dá)量最高[10]。番茄SlARF2 在花蕾中具有最高的表達(dá)量，但是不影響花的形成[11]。果梅中PmARF11 基因在轉(zhuǎn)基因煙草的花瓣中具有高表達(dá)水平，且顯著影響花瓣顏色、邊緣深裂和萼片變化，由此可以預(yù)測(cè)PmARF11 基因在花瓣發(fā)育過程發(fā)揮重要作用[12]。黃瓜CsARF10b 和CsARF10c 在雌花中不顯著表達(dá)，在雄花中表達(dá)水平較高，預(yù)測(cè)CsARF10b 和CsARF10c 基因能夠調(diào)控雄花發(fā)育[13]。在番木瓜中，CpARF1、CpARF2、CpARF4、CpARF5 和CpARF10 基因在花發(fā)育的早期高表達(dá)，隨后則呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而CpARF6的表達(dá)則隨著花發(fā)育的進(jìn)程不斷上升[8]。雖然番荔枝的全基因組測(cè)序尚無報(bào)道，但是由于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展為研究番荔枝ARF 基因家族提供了良好的平臺(tái)。

本課題組前期對(duì)番荔枝花發(fā)育4 個(gè)時(shí)期進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，獲得71 948 條unigenes 序列信息，平均長度為825.4 bp，將獲得的unigenes 序列與已知數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)，共有24 911 條unigenes 被注釋到[14]。本研究基于此數(shù)據(jù)庫，在轉(zhuǎn)錄組層面利用生物信息學(xué)方法對(duì)番荔枝ARF 家族基因成員進(jìn)行鑒定，分析番荔枝ARF 家族蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化、理化性質(zhì)、亞細(xì)胞定位、二級(jí)三級(jí)結(jié)構(gòu)等，并通過qRT-PCR 分析番荔枝ARF 家族基因在花發(fā)育不同階段和畸形花中的表達(dá)，為今后番荔枝ARF 家族基因的克隆和功能研究，深入探索番荔枝ARF 家族基因調(diào)控花發(fā)育的機(jī)制奠定基礎(chǔ)，有助于解決番荔枝產(chǎn)業(yè)上出現(xiàn)的“花而不實(shí)”、結(jié)果率低等問題。

1 材料與方法

1.1 材料

番荔枝（Annona squamosa L.）種植于嶺南師范學(xué)院熱帶果樹試驗(yàn)地，常規(guī)栽培管理。于2018年7 — 8 月分別采摘花芽期（ I ， 1 mm<花芽<2 mm）、花蕾期（II，5 mm<花蕾<6 mm）、開花前期（III，花瓣輕微張開）、開花期（IV，花瓣張開）4 個(gè)階段的花。于2019 年7—8 月分別采摘正常的花蕾（NF）和畸形的花蕾（MF）。不同花的材料重復(fù)3 次，取樣后立即用液氮速凍后保存于–80 ℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序 把1.5 mL 離心管放置冰上預(yù)冷，分別加入1 mL TRNzol 液，搖勻后加入氯仿/異戊醇混合液200 μL、巰基乙醇8 μL，將研磨得到的（花芽期、花蕾期、開花前期、開花期）花樣品各100 mg 加入上述離心管中。

將樣品震蕩混合， 在4 ℃下， 12 000×g 離心10 min。取上清液750 μL，加入等體積的水飽和酚/氯仿/異戊醇，震蕩混勻，在4 ℃下，12 000×g離心10 min。重復(fù)上述步驟2 遍。取上清液650 μL，加入等體積異丙醇，65 μL 醋酸鈉溶液，置于–20 ℃，沉淀30 min。冰浴后的樣本，在4 ℃下，12 000×g 離心20 min，棄上清液，加入500 μL75%乙醇，洗滌沉淀，離心10 min，并重復(fù)2 遍。洗滌后的樣本，吸干乙醇，自然晾干后備用。

建庫用的RNA 需除去污染DNA。方法如下：加入42 μL RNA-free 的DNA 酶，直至全部溶解。在37 ℃水浴消化30 min 后，再加入550 μL 的RNA-free 水至600 μL，在加入水飽和酚/氯仿/異戊醇沉淀，離心棄上清液。重復(fù)上述洗滌步驟。RNA 充分溶解后，稀釋10 倍，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)RNA 質(zhì)量。

番荔枝花發(fā)育不同階段（花芽、花蕾、開花前期、開花期）轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)由基迪奧生物公司進(jìn)行測(cè)序獲得，后續(xù)分析基于此測(cè)序結(jié)果數(shù)據(jù)。

1.2.2 番荔枝ARF 的系統(tǒng)進(jìn)化分析 利用GeneStructure Display Server （ http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index. Php）在線軟件對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。擬南芥ARF 基因序列從生物信息資源網(wǎng)站TAIR（ https：//www. arabidopsis.org/ ） 直接下載。使用MEGA7.0（https：//www.megasoftware.net/mega5）、TreeView1.6（http：//www.brc.dcs.gla.ac.uk/ser-vices/）在線軟件預(yù)測(cè)蛋白結(jié)構(gòu)域，并通過鄰接法，校驗(yàn)參數(shù)（bootstrap）設(shè)置為1000，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。使用ClustalW（http：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）對(duì)ARF 蛋白氨基酸進(jìn)行多重序列比對(duì)。

1.2.3 番荔枝ARF 基因家族理化性質(zhì)及蛋白結(jié)構(gòu)分析 利用在線軟件Prot Param（http：//web.expasy.org/protparam/）分析預(yù)測(cè)番荔枝ARF 蛋白序列的分子量、等電點(diǎn)、不穩(wěn)定系數(shù)、脂肪指數(shù)和疏水性等基本的理化性質(zhì)。利用在線軟件Prabi（NPS@：SOPMA secondary structure prediction，https：//npsa- prabi.ibcp.fr/cgi-bin /npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）對(duì)ARF 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)α-螺旋、延伸鏈、β-轉(zhuǎn)角、無規(guī)則卷曲進(jìn)行預(yù)測(cè)。利用在線軟件SWISS-MODEL（https：//swissmodel. expasy.org/）對(duì)ARF 蛋白質(zhì)序列進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)分析。利用在線軟件NCBI 的CD-search（ https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）分析番荔ARF 家族蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。利用MEGA 7.0 軟件分析ARF 中間結(jié)構(gòu)域（MR）的氨基酸組成。

1.2.4 番荔枝ARF 蛋白的亞細(xì)胞定位分析 利用在線軟件SoftBerry （ http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcomppl&group=prgrams&subgroup=proloc）對(duì)ARF 蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析。同時(shí)將得到的AsARF2 、AsARF3a 和AsARF6a 全長序列編碼區(qū)CDS 序列克隆到pCAMBIA1302-35S-GFP 載體中。使用pCAMBIA1302- 35S-GFP 空載體為陰性對(duì)照。將構(gòu)建完畢的載體和GFP 空載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 感受態(tài)細(xì)胞，挑取單克隆菌落，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，并通過搖床大量培養(yǎng)。以陽性克隆擴(kuò)增后的菌液注射本氏煙煙草葉片。以培養(yǎng)48 h 后的煙草葉片制作臨時(shí)裝片，在激發(fā)光波長為488 nm 和發(fā)射光波長為625～725 nm 的條件下用激光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光信號(hào)檢測(cè)。觀察產(chǎn)生的綠色熒光在煙草表皮細(xì)胞內(nèi)的分布情況。

1.2.5 番荔枝ARF 家族基因在花發(fā)育中的表達(dá)分析 分別提取番荔枝花發(fā)育4 個(gè)階段花器官、正?；ㄒ约盎位ǖ目俁NA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)檢測(cè)AsARF 家族基因的表達(dá)。按照SYBR^?Premix Ex Taq^TM操作，以AsActin 為內(nèi)參基因，在熒光定量PCR 儀上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，檢測(cè)基因的表達(dá)量。反應(yīng)條件：96 ℃1 min，95 ℃ 15 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共40次循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3 次。反應(yīng)結(jié)束后分析熒光值變化曲線和熔解曲線。相對(duì)定量分析采用比較Ct 法，目的基因的相對(duì)表達(dá)水平為2^–ΔΔCT。具體引物信息見表1。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 17.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）和差異顯著性檢驗(yàn)（Duncans 法）。

2 結(jié)果與分析

2.1 番荔枝ARF 家族基因的鑒定及系統(tǒng)進(jìn)化分析

基于番荔枝花發(fā)育不同階段轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，在NR、NT、Swiss-Prot 和PFAM 4 個(gè)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行注釋，初步注釋到18 個(gè)ARF 轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)基因，通過NCBI Blast 和SMART 軟件預(yù)測(cè)，去除重復(fù)序列及冗余轉(zhuǎn)錄本后，最終得到11 個(gè)ARF轉(zhuǎn)錄因子。

為了研究番荔枝11 個(gè)ARF 蛋白家族的進(jìn)化關(guān)系與功能，利用MEGA7.0 軟件構(gòu)建番荔枝和擬南芥ARF 蛋白家族的系統(tǒng)進(jìn)化樹，根據(jù)進(jìn)化樹將2 個(gè)物種的ARF 家族蛋白進(jìn)行聚類分析，共分為5 組（圖1A）。對(duì)于番荔枝來說，第1 組包括1 個(gè)AsARF 基因家族成員（AsARF2），占基因家族成員總數(shù)的9.09%；第2 組包括2 個(gè)AsARF 基因家族成員（AsARF3a、AsARF3b），占基因家族成員總數(shù)的18.18%；第3 組包括3 個(gè)AsARF 基因家族成員（AsARF5a、AsARF5b、AsARF7），占基因家族成員總數(shù)的27.27%；第4 組包括4 個(gè)AsARF 基因家族成員（AsARF6a、AsARF6b、AsARF6c、AsARF6d），占基因家族成員總數(shù)的36.36%；第5 組包括1 個(gè)AsARF 基因家族成員（AsARF7），占基因家族成員總數(shù)的9.09%。

進(jìn)一步分析表明，大部分AsARF 包含3 個(gè)經(jīng)典的結(jié)構(gòu)域，分別是DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）、中間區(qū)域結(jié)構(gòu)域（MR）和C-末端二聚化結(jié)構(gòu)域（CTD）。AsARF3a、AsARF6a 和AsARF6b 只含有DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域和中間區(qū)域結(jié)構(gòu)域，不含有C-末端二聚化結(jié)構(gòu)域，其他AsARF 均含有3 個(gè)完整的結(jié)構(gòu)域（圖1B）。

通過ClustalW 軟件進(jìn)行比對(duì)，如圖2 所示，可以得出大部分ARF 蛋白家族包含3 個(gè)特有的保守結(jié)構(gòu)域，即DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）、中間區(qū)域結(jié)構(gòu)域（MR）、C-末端二聚化結(jié)構(gòu)域（CTD），證實(shí)上述蛋白序列具有極高的序列相似度。

2.2 番荔枝ARF基因家族理化性質(zhì)分析

如表2 所示，番荔枝ARF 家族成員理論分子量在73.85～112.51 kDa 之間， 氨基酸數(shù)量在677～1007 aa 之間，等電點(diǎn)分布在5.42～7.63 之間，11 個(gè)ARF 蛋白的平均等電點(diǎn)為6.28。有8 個(gè)番荔枝ARF 蛋白呈酸性，3 個(gè)番荔枝ARF 蛋白呈堿性，預(yù)測(cè)在酸性亞細(xì)胞環(huán)境中，大部分番荔枝ARF蛋白才會(huì)發(fā)揮作用。11 個(gè)番荔枝ARF 蛋白的脂肪系數(shù)大小在62.66～77.1 之間；番荔枝ARF 蛋白親水系數(shù)大小在–0.648～0.351 之間，屬于親水性蛋白；所有ARF 的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，預(yù)測(cè)番荔枝ARF 蛋白為不穩(wěn)定蛋白。

番荔枝ARF 家族蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)中，-螺旋和無規(guī)則卷曲所占比例比較大，所占比例從大到小排序：無規(guī)則卷曲>-螺旋>延伸鏈>-轉(zhuǎn)角。采用SWISS-MODEL對(duì)番荔枝ARF 蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果表明番荔枝ARF 蛋白主要由無規(guī)則卷曲、-螺旋、-轉(zhuǎn)角等構(gòu)成三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖3）。

2.3 番荔枝ARF 蛋白的氨基酸組成及分類

番荔枝AsARF 蛋白的氨基酸組成如圖4A 所示，絲氨酸、谷氨酰胺、脯氨酸、亮氨酸、甘氨酸等在AsARF 蛋白中的含量較高。根據(jù)中間區(qū)域結(jié)構(gòu)域（MR）的氨基酸組成和是否存在C-末端二聚化結(jié)構(gòu)域（CTD），可以把11 個(gè)AsARF 分為三類（圖4B）。第1 類包括DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）和CTD 結(jié)構(gòu)域，MR 結(jié)構(gòu)域?yàn)榧せ钣颍ˋD）的AsARF 蛋白， 包括AsARF5a 、AsARF5b 、AsARF6c、AsARF6d、AsARF7 和AsARF16；第2 類包括DBD 結(jié)構(gòu)域和CTD 結(jié)構(gòu)域，MR 結(jié)構(gòu)域?yàn)橐种朴颍≧D）的AsARF 蛋白，包括AsARF2和AsARF3b；第3 類包括DBD 結(jié)構(gòu)域，MR 結(jié)構(gòu)域?yàn)镽D 抑制域，且缺乏CTD 結(jié)構(gòu)域的AsARF蛋白，包括AsARF3a、AsARF6a 和AsARF6b。

2.4 亞細(xì)胞定位分析

轉(zhuǎn)錄因子通過與靶基因的啟動(dòng)子元件相結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，通常定位于細(xì)胞核中。通過在線軟件SoftBerry 分析亞細(xì)胞定位，結(jié)果如表3 所示，11 個(gè)番荔枝ARF 蛋白都為潛在的細(xì)胞核定位蛋白。隨機(jī)選取AsARF2、AsARF3a和AsARF6a 構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化技術(shù)浸潤本氏煙煙草葉片，在激光共聚焦顯微鏡下對(duì)綠色熒光信號(hào)（GFP）進(jìn)行觀察。結(jié)果顯示，AsARF2、AsARF3a 和AsARF6a 蛋白都定位在細(xì)胞核中（圖5）。這一結(jié)果表明，轉(zhuǎn)錄因子AsARF 蛋白具有細(xì)胞核定位的特征。

2.5 番荔枝ARF 基因家族在花發(fā)育不同階段的表達(dá)分析

通過qRT-PCR技術(shù)分析了AsARF 基因在花發(fā)育4 個(gè)階段的基因表達(dá)模式，結(jié)果表明AsARF3a、AsARF3b 、AsARF5a 、AsARF5b 、AsARF6a 和AsARF7 在花芽期表達(dá)量高，在花蕾期、開花期、開花前期的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)。AsARF2 和AsARF6b 的表達(dá)量在花蕾期比較高，在開花前期和開花期呈下降趨勢(shì)。此外，AsARF6c 和AsARF6d在整個(gè)開花前期表現(xiàn)出較高的表達(dá)水平。而AsARF16 在花芽期和開花期呈現(xiàn)高表達(dá)（圖6）。

2.6 番荔枝ARF 基因家族在正?；ê突位ㄖ械谋磉_(dá)分析

利用qRT-PCR分析AsARF 基因在番荔枝正?；ê突位ㄖ械谋磉_(dá)， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)， AsARF2、AsARF3a、AsARF5a、AsARF5b、AsARF6b、AsARF6c和AsARF16 基因在正?；ㄖ谐尸F(xiàn)高表達(dá)，而AsARF3b、AsARF6a、AsARF6d、AsARF7 則在畸形花中表達(dá)量更高（圖7）。

3 討論

生長素作為一類植物生長發(fā)育相關(guān)的重要激素，而其中生長素響應(yīng)因子ARF 是為植物生長素響應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子之一，也是核心的正負(fù)調(diào)控因子[9， 15]。通過對(duì)植物的ARF 家族進(jìn)行鑒定分析，有助于深入研究ARF 在植物生長發(fā)育各個(gè)環(huán)節(jié)的調(diào)控機(jī)制。近年來，隨著基因組測(cè)序技術(shù)的不斷推進(jìn)，為基因家族分析提供了很大的便利性。但是番荔枝作為熱帶亞熱帶地區(qū)著名果樹[1-2， 14]，其基因組序列還未得到測(cè)序解析，這在很大程度上限制了控制其重要性狀基因的研究。因此從轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)獲得相關(guān)基因家族成員成為研究的熱點(diǎn)之一。

目前在番茄中發(fā)現(xiàn)了17 個(gè)ARF 家族成員[11]、黃瓜中18 個(gè)[16]、蘋果中29 個(gè)[17]、番木瓜中11個(gè)[8]。本研究基于番荔枝花發(fā)育不同階段轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)，篩選并鑒定出番荔枝ARF 轉(zhuǎn)錄因子家族成員11 個(gè)。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示番荔枝和擬南芥的ARF 形成6 對(duì)旁系同源基因?qū)Γ@為研究番荔枝ARF 基因功能提供了有價(jià)值的信息。生物信息學(xué)分析顯示番荔枝ARF 蛋白的蛋白特性、氨基酸長度有較大差異，說明番荔枝ARF 家族蛋白的特性不一，可能具有多樣化的生物學(xué)功能。本研究鑒定的番荔枝AFR 蛋白大部分含有3 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，分別是DNA 結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DBD）、中間區(qū)域結(jié)構(gòu)域（MR）和C-末端二聚化結(jié)構(gòu)域（CTD），但AsARF3a、AsARF6a 和AsARF6b 等3 個(gè)成員僅有2 個(gè)保守結(jié)構(gòu)域，CTD 結(jié)構(gòu)域缺失，上述特性與前人研究的番木瓜、荔枝等[8， 18-19]ARF 家族蛋白的性質(zhì)一致。研究表明，DBD 結(jié)構(gòu)域具有DNA 結(jié)合活性，可以與生長素反應(yīng)基因啟動(dòng)子上的作用元件結(jié)合，進(jìn)而通過與MR 結(jié)構(gòu)域激活或抑制相關(guān)基因的表達(dá)。CTD 結(jié)構(gòu)域是一個(gè)介導(dǎo)蛋白質(zhì)–蛋白質(zhì)互作的結(jié)構(gòu)域，另一個(gè)在生長素信號(hào)途徑中起抑制作用的AUX/IAA 蛋白中也具有類似結(jié)構(gòu)域，2 個(gè)蛋白可以通過該結(jié)構(gòu)域的互作而形成ARF-ARF、ARF-Aux/IAA 和 Aux/IAA-Aux/IAA同源或異源寡聚體[8-9]。但番荔枝中AsARF3a、AsARF6a 和AsARF6b 的CTD 結(jié)構(gòu)域缺失的ARF功能如何還有待進(jìn)一步研究。

對(duì)番荔枝ARF 編碼蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)后發(fā)現(xiàn)，該基因編碼的蛋白質(zhì)中無規(guī)則卷曲所占比例最大，其次是-螺旋；在蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)中，發(fā)現(xiàn)番荔枝ARF 編碼蛋白為多鏈折疊蛋白，以無規(guī)則卷曲為主，這與石榴和水仙[18-19]ARF 編碼蛋白的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果基本一致。根據(jù)ARF蛋白MR 的氨基酸組成，可以預(yù)測(cè)ARF 為轉(zhuǎn)錄抑制子或轉(zhuǎn)錄激活子。前人研究發(fā)現(xiàn)AtARF1、AtARF2、AtARF3、AtARF4 和AtARF9 蛋白非保守的中間區(qū)域富含甘氨酸（G）、絲氨酸（S）、亮氨酸（L）和脯氨酸（P）殘基，能夠發(fā)揮轉(zhuǎn)錄抑制作用，為轉(zhuǎn)錄抑制子，而AtARF5-8 和AtARF19中間區(qū)域富含谷氨酰胺（Q）、絲氨酸（S）和亮氨酸（L）殘基，發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活作用，為轉(zhuǎn)錄激活子[20-22] 。本研究中， AsARF5a 、AsARF5b 、AsARF6c、AsARF6d、AsARF7 和AsARF16 蛋白的中間區(qū)域富含Q、S、L，推測(cè)這6 個(gè)蛋白可能為轉(zhuǎn)錄激活子。而AsARF2、AsARF3a、AsARF3b、AsARF6a 和AsARF6b 這5 個(gè)蛋白推測(cè)為轉(zhuǎn)錄抑制子。但是番荔枝ARF 家族基因中是促進(jìn)或抑制生長素響應(yīng)基因表達(dá)的具體功能分析還有待進(jìn)一步探究。

亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，番荔枝ARF 蛋白主要定位在細(xì)胞核中，具有轉(zhuǎn)錄因子的定位特征。對(duì)AsARF2、AsARF3a 和AsARF6a 蛋白的亞細(xì)胞定位試驗(yàn)結(jié)果也顯示，AsARF2、AsARF3a 和AsARF6a 蛋白定位于細(xì)胞核，這與其他物種ARF蛋白定位[23-24]基本一致。

ARF 家族基因在花發(fā)育的過程中也發(fā)揮著重要的作用，擬南芥的AtARF2、AtARF5 可以調(diào)節(jié)雌性和雄性配子體發(fā)育[25]，AtARF2 突變體表現(xiàn)出延遲開花的表型[26]。本研究中AtARF2 的同源基因AsARF2 主要在花蕾期表達(dá)，AtARF5 同源基因AsARF5a 、AsARF5b 主要在花芽期表達(dá)， 且AsARF2、AsARF5a 和AsARF5b 三個(gè)基因在正?；ㄖ械谋磉_(dá)顯著高于畸形花， 推測(cè)番荔枝AsARF2、AsARF5a 和AsARF5b 具有調(diào)控早期花發(fā)育和花器官的正常發(fā)育的功能。此外，有研究報(bào)道擬南芥中AtARF3 在花發(fā)育早期起到顯著的作用[27]。番荔枝中AsARF3a 和AsARF3b 兩個(gè)基因的表達(dá)主要集中在花芽期，這說明AsARF3a 和AsARF3b 很可能也參與了早期花發(fā)育。在擬南芥中AtARF6 還被證實(shí)能夠促進(jìn)雄蕊花絲伸長、花藥開裂和雌核成熟[28]。在其他物種中， 多個(gè)AtARF6 的同源基因得到了鑒定， 如辣椒CaARF6A、CaARF6B、CaARF6C，它們被證明參與了調(diào)控花發(fā)育與成熟過程[29]。在本研究中，AsARF6a 主要在花芽期高度表達(dá)，AsARF6b、AsARF6c 和AsARF6d 則多集中于花蕾期和開花前期表達(dá)，這在客觀上證實(shí)了番荔枝這幾個(gè)同源基因在維持花器官發(fā)育中起到一定的作用。同時(shí)AsARF6b、AsARF6c 在正?；ㄖ斜磉_(dá)量高，而AsARF6a、AsARF6d 在畸形花中表達(dá)量更高，說明它們?cè)诨ǖ恼０l(fā)育中的具體功能可能不同。

4 結(jié)論

ARF 家族在植物生長和發(fā)育的整個(gè)過程中都發(fā)揮著重要的作用，本研究基于番荔枝花發(fā)育不同階段轉(zhuǎn)錄組研究為背景，對(duì)ARF 家族基因進(jìn)行篩選、生物信息學(xué)和表達(dá)模式分析。但由于番荔枝基因組數(shù)據(jù)缺乏和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的局限性，更多番荔枝ARF 家族基因還有待進(jìn)一步挖掘鑒定，同時(shí)將來需要進(jìn)行轉(zhuǎn)基因試驗(yàn)等進(jìn)行深入的功能驗(yàn)證分析，以揭示ARF 家族基因在花的正常發(fā)育中的具體功能。本研究結(jié)果為進(jìn)一步了解番荔枝中ARF 轉(zhuǎn)錄因子家族成員調(diào)控花發(fā)育的相關(guān)機(jī)制奠定基礎(chǔ)，并為解決番荔枝產(chǎn)業(yè)上出現(xiàn)的“花而不實(shí)”、結(jié)果率低等問題提供研究思路。