陸建能　麥碧儀　劉義軍　趙雨詩　陳云蘭　林麗靜　周大圣　張明

關鍵詞：靈芝；乙醇；梯度沉淀；多糖；理化特性

中圖分類號：S567.3.11 文獻標識碼：A

靈芝是我國重要的藥食兩用真菌，具有扶正固本、滋補強壯、延年益壽等功效[1]。靈芝子實體中含有糖類、三萜類、甾醇類和氨基酸等成分，在免疫調節(jié)、降血脂和免疫性肝損傷等方面具有良好的臨床療效[2-3]，靈芝藥效與靈芝多糖活性和含量密切相關，靈芝多糖成為衡量靈芝產品質量優(yōu)劣的最重要指標之一[4]。

靈芝多糖（GLPs）的結構和分子量是影響其免疫調節(jié)、抗腫瘤和調血脂以及保護肝臟等生物活性的關鍵因素[5-7]。靈芝多糖的支鏈種類以及支鏈和主鏈間的比例會隨提取方法的不同而有所變化[8]，靈芝多糖分子量也會隨分離方法的不同而有所變化，從而影響靈芝多糖的生物活性[9]。醇法、膜法等分離技術是國內外實現不同分子鏈靈芝多糖的常見方法。CAI 等[10]利用級聯膜技術從靈芝多糖分離出322.0、18.8、6.4 kDa 3 種呈β 構型的多糖，所有分級的GLPs 均可以延長老鼠的游泳時間，提高耐力和促進疲勞恢復，推斷分子量在10 kDa 以上的GLPs 可能是潛在的抗疲勞藥物。MA 等[11]采用超濾膜法從靈芝多糖中分離出GLP1（>10 kDa）、GLP2（8～10 kDa）、GLP3（2.5～8 kDa）和GLP4（<2.5 kDa）4 個靈芝多糖，GLP1和GLP2 具有更強的抗氧化和抗增殖活性，高分子量靈芝多糖成分具有更強的生物活性。KAN 等[12]從超微靈芝子實體粉中提取多糖，采用無水乙醇分級沉淀得到4 種不同乙醇濃度下的靈芝多糖，GLP80 的抗氧化活性最好，由于該方法獲得的80%濃度下醇沉的靈芝多糖含有GLP40 和GLP60成分，并不能準確地表達乙醇濃度對靈芝多糖的分離效果，而關于乙醇逐級分離沉淀靈芝多糖的相關報道較少。為了揭示靈芝多糖在不同濃度乙醇中的分布規(guī)律，以及各濃度下分離的靈芝多糖理化特性等相關性質的差異，本研究采用乙醇逐級分離沉淀得到不同靈芝多糖組分，對其單糖組成、分子量分布等結構特征進行表征，并研究不同組分的體外抗氧化活性及對鼠李糖乳桿菌生長的影響，為靈芝多糖多樣化產品的開發(fā)提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

靈芝由本實驗室栽培，栽培方法參考LIU 等[13]的方法。D-甘露糖（D-Man）、L-鼠李糖（L-Rha）、D-葡萄糖（D-Glc）、D-半乳糖（D-Gal）、L-阿拉伯糖（ L-Ara ）、D- 巖藻糖（ D-Fuc ）、D- 木糖（D-Xyl）、D-果糖（D-Fru）標準品購自上海源葉生物科技有限公司。DPPH 自由基清除能力試劑盒（分光法）、總抗氧化能力（T-AOC）試劑盒（分光法）、羥自由基清除能力試劑盒（分光法）購自北京艾普希隆生物科技有限公司。鼠李糖乳桿菌LGG 購自中國普通微生物菌種保藏管理中心（China General Microbiological Culture CollectionCenter， CGMCC）。

1.2 方法

1.2.1 靈芝多糖的提取 將靈芝切片粉碎，用靈芝粉末和無水乙醇以1∶15（m/V）的比例，加入圓底蒸餾瓶，在真空提取系統(tǒng)中50 ℃回流提取3 h，過濾，得濾渣（去除原料中的油脂、色素、低聚糖和小分子物質等），50 ℃烘干。取靈芝粉末1000 g，按料水比1∶15（m/V）加入蒸餾水，在90 ℃水浴鍋中提取2 h，過濾，上清液濃縮至原液的1/3，5000 r/min 離心10 min 進一步除雜，得到靈芝多糖溶液。在靈芝多糖溶液中加入適量無水乙醇，調節(jié)溶液乙醇濃度為40%（V/V）時得到絮狀沉淀，5000 r/min 離心10 min，收集沉淀，命名為GLP40；所得上清液繼續(xù)加入適量無水乙醇，調節(jié)溶液乙醇濃度為50%（V/V）時得到絮狀沉淀，5000 r/min 離心10 min，收集沉淀，命名為GLP50；按照上述方法，分別沉淀得到GLP60、GLP70、GLP80、GLP90；所得沉淀置于–40 ℃冷凍干燥機凍干48 h，然后置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定靈芝子實體中的多糖含量。以葡萄糖為標準品，配制0.1 mg/mL 的葡萄糖溶液。分別吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 葡萄糖溶液于15 mL 具塞玻璃試管中，加蒸餾水補至1 mL配成不同濃度的標準葡萄糖溶液，然后分別加入1.0 mL 6%苯酚溶液，快速加入5.0 mL 硫酸，振蕩20 s 混勻，100 ℃水浴15 min，快速冷卻至室溫，在490 nm 處測定其吸光值（A）。根據不同濃度葡萄糖溶液（C）的吸光值建立標準曲線A=0.01×C+0.0017（R²=0.9994）。

多糖含量的測定：稱取10 mg 各樣品于10 mL離心管中，加3 mL 水溶解，振蕩20 s 混勻，沸水浴2 h，冷卻至室溫，過0.45 μm 有機微孔濾膜至100 mL 容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，即為測試液。按照上述步驟處理，在490 nm 處測定其吸光值，根據曲線計算多糖含量。

1.2.3 單糖組成分析 根據鄧永智等[14-15]的方法分析靈芝多糖單糖組成，稍加改進。準確稱取10 mg 多糖樣品與2 mL 2 mol/L 三氟乙酸（TFA）在110 ℃烘箱中水解6 h，氮氣吹干，加入同體積甲醇沸水浴蒸干，重復3 次。加入10 mg 鹽酸羥胺和1 mL 吡啶，輕輕搖晃使其充分溶解，于90 ℃水浴鍋中反應30 min，冷卻至室溫，加入1 mL 乙酸酐，90 ℃水浴30 min，氮氣吹干，加入1 mL氯仿溶解，過0.45 μm 微孔濾膜，進行GC-MS 分析。另外以D-甘露糖、L-鼠李糖、D-葡萄糖、D-半乳糖、L-阿拉伯糖、D-巖藻糖、D-木糖、D-果糖等標準品經相同條件處理，進樣。

氣相色譜-質譜（GC-MS）分析條件。色譜柱：HP-5ms（30 mm×0.25 mm×0.25 μm）毛細管柱；升溫程序：初始柱溫130 ℃，保持5 min 后，以2.5 ℃ /min 的升溫速度升溫至220 ℃ ， 再以10.0 ℃/min 升溫至260 ℃，進樣溫度280 ℃；載氣為99.99%高純度氮氣，柱流量為1.0 mL/min，分流比1∶50；進樣量為1.0 μL。質譜（MS）條件：離子源溫度230 ℃，接口溫度260 ℃，掃描質量范圍為30～450 m/z，溶劑延遲時間5.0 min。

1.2.4 近紅外光譜測定 將1 mg/mL 多糖水溶液置于金鏡表面上， 滴入一滴樣品溶液， 置于Thermo Nicolet iN10 近紅外分析儀（美國賽默飛）測量，整個測量過程采用液氮和氮氣保護，每次樣品測量之前使用相同參數采集清潔金鏡表面的背景光譜（采集背景），掃描范圍為4000～400 cm^–1，分辨率為4 cm^–1。

1.2.5 分子量分布測定 采用高效液相凝膠色譜儀（HPGPC）測定靈芝多糖分子量和純度。將多糖樣品以及5000、11 600、23 800、48 600、80 900、148 000、273 000、409 800、667 800 Da 多糖標準品配制成5 mg/mL 標準品溶液，12 000 r/min離心10 min，上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，移入1.8 mL 進樣瓶中。溶液注入高效液相色譜儀（LC-10A， Shimadzu）串聯凝膠柱中（BRT105-104-102， 8 mm×300 mm）建立保留時間（RT， min）與峰位分子量（Mp）、重均分子量（Mw）、數均分子量（Mn）的線性回歸方程，其中檢測器為示差檢測器（RI-10A， Shimadzu），流動相為0.05 mol/LNaCl 溶液，柱溫40 ℃，流速0.6 mL/min，進樣量20 μL。分子量與保留時間的校正曲線為lgMp=–0.1799RT+11.556，R²=0.995；lgMw=–0.1917RT+12.108，R²=0.9934；lgMn=–0.1776X+11.392，R2=0.9905。

1.2.6 體外抗氧化活性測定 總抗氧化能力（T-AOC）的測定。采用FRAP 法測定，吸取75 μL125 μg/mL 靈芝多糖水溶液于1.5 mL 測定管中，依次加入75 μL 蒸餾水和850 μL 顯色液（蘇州格銳思生物科技有限公司FRAP 試劑盒試劑），振動混勻，置于室溫反應10 min，在590 nm 處測其吸光值（A1），若吸光值>1.8，則采用蒸餾水稀釋至一定的倍數（D）。蒸餾水作空白對照，按照上述步驟，在590 nm 處測其吸光值（A0）。多糖的總抗氧化能力（μmol/mL）=0.36×[（A1–A0）+0.0262）]×D。采用蒸餾水調零，重復3 次。

1.2.7 DPPH 自由基清除能力的測定 吸取400 μL 500 μg/mL 多糖溶液于1.5 mL 測定管中，然后加入600 μL 工作液（蘇州格銳思生物科技有限公司FRAP 試劑盒試劑），振動混勻，置于室溫避光反應30 min，4000 r/min 離心5 min，取上清液，在517 nm 處測其吸光值（A2），作為測定組。吸取400 μL 500 μg/mL 多糖溶液于1.5 mL 測定管中，加入600 μL 80%甲醇，振動混勻，按照上述步驟，在517 nm 處測其吸光值（A1），作為對照組。吸取400 μL 80%甲醇以及600 μL 工作液于測定管中，振動混勻，按照上述反應步驟，在517 nm 處測其吸光值（A0），作為空白組。多糖的DPPH 自由基清除率=[1–（A2–A1）/A0]×100%。采用無水乙醇調零，重復3 次。

1.2.8 羥自由基清除能力的測定 吸取125 μL試劑盒中的試劑1 于1.5 mL 測定管中，依次加入125 μL 試劑盒中的試劑2，625 μL 1000 μg/mL 靈芝多糖溶液，125 μL 試劑盒中的試劑3，振動混勻，置于37 ℃反應20 min，在517 nm 處測其吸光值（A₂），作為測定組。吸取125 μL 試劑1 于1.5 mL 測定管中，依次加入125 μL 試劑2，625 μL1000 μg/mL 靈芝多糖溶液，125 μL 蒸餾水，振動混勻，置于37 ℃反應20 min，在510 nm 處測其吸光值（A1），作為對照組。吸取125 μL 試劑1 于1.5 mL 測定管中，依次加入125 μL 試劑2，625 μL蒸餾水，125 μL 試劑3，振動混勻，置于37 ℃反應20 min，在510 nm 處測其吸光值（A₀），作為空白組。多糖的羥自由基清除率=[A₀–（A₂–A₁）]/A₀×100%。上述測試采用蒸餾水調零，所有測試重復3 次。

1.2.9 多糖對鼠李糖乳桿菌生長的影響 在無菌條件下，取鼠李糖乳桿菌LGG 200 μL 接種于MRS 肉湯培養(yǎng)基上，（37±1）℃厭氧培養(yǎng)12 h，進行菌種活化。在接種2%（體積分數）鼠李糖桿菌LGG 的MRS 液體培養(yǎng)基中添加滅菌1%多糖溶液，以添加去離子水為空白對照，在（37±1）℃培養(yǎng)20 h，從0 h 開始，每隔2 h 測定菌液OD600值，繪制鼠李糖乳桿菌的生長曲線。

1.3 數據處理

采用Excel 2013 軟件對試驗數據進行整理，利用Origin 8.0 軟件作圖，采用SPSS 22.0 軟件進行差異顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 靈芝多糖中總糖和單糖含量分析

由圖1 可知，不同濃度醇沉所得靈芝多糖顏色和外觀形貌存在較大差異。由表1 可知，GLP70的總糖含量最高，GLP90 的總糖含量最低，說明70%乙醇濃度能將提取液中的大部分靈芝多糖沉淀下來，同時90%乙醇濃度有助于將靈芝提取液中的大部分雜質沉淀下來。不同濃度所得粗多糖中均含有6 種單糖，包括鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖。根據這6 種單糖的摩爾比可知，不同多糖樣本中的單糖占比存在較大差異，GLP40 主要由甘露糖和木糖組成，GLP50、GLP60、GLP70、GLP80 和GLP90 主要由葡萄糖和甘露糖組成，GLP80 和GLP90 的葡萄糖占比較高。

2.2 靈芝多糖近紅外光譜分析

為了進一步確定不同濃度醇沉所得靈芝多糖的結構差異，分別對6 種多糖進行紅外光譜分析（圖2）。6 種多糖均在3311～3376 cm^–1之間具有較寬的吸收峰，為O-H 的伸縮振動，在2935 cm^–1附近具有弱吸收峰，為烷基的C-H 伸縮振動，在1618～1630 cm^–1處出現的較強的峰是C=O 伸縮振動，在1404～1411 cm^–1處出現的峰是-CH 的變角振動引起的，在1048～1084 cm^–1 附近出現的峰是常見的吡喃糖環(huán)內酯和羥基的吸收峰共振吸收峰，是由于糖環(huán)上C-O-C 醚鍵的不對稱伸縮振動構成了糖類的特征吸收峰，也是葡聚糖典型的紅外光譜信號[16]。此外892.9 cm^–1處是典型的吡喃葡聚糖和β-型糖苷鍵鏈接特征吸收峰[17]，說明6 種靈芝多糖均為β-型葡聚糖構型。同時930 cm^–1處的弱峰為端基碳C-H 彎曲振動峰[18]，GLP40 和GLP50 在930 cm^–1附近有特征吸收峰，而在890 cm^–1處較弱，說明60%及以上濃度醇沉所得的靈芝多糖主要為β-型葡聚糖構型，且官能團無明顯差異。

2.3 靈芝多糖分子量分布規(guī)律分析

采用HPGPC 對不同乙醇濃度所得靈芝多糖的分子量和純度進行測定。由圖3 可知，不同乙醇濃度所得靈芝多糖的高效凝膠滲透色譜圖有明顯差異。利用峰位分子量（Mp）、峰重均分子量（Mw）、數均分子量（Mn）對不同乙醇濃度所得靈芝多糖的分子量等參數進行計算（表2）。由表2 可知，不同乙醇濃度所得粗多糖的分子量分布存在較大差異，重均分子量越大，其數均分子量與峰均分子量也越大。以重均分子量為例，GLP40 分子量分布在97～14 925 g/mol 之間，GLP50 分子量為99～49 410 g/mol，GLP60 分子量為98～32 030 g/mol，GLP70 分子量分布在3614～19 589 g/mol 之間，GLP80 分子量分布在3614～10 795 g/mol 之間，GLP90 分子量分布在4385～11 084 g/mol 之間。不同靈芝多糖組分中分子量占比也有差異，Mw>10 000 g/moL 中，GLP40、GLP50、GLP60、GLP70、GLP80、GLP90 分別占比55.038%、79.837%、86.355%、84.349%、70.818%和61.059%，且呈先增后降的趨勢。

2.4 靈芝多糖體外抗氧化活性分析

不同乙醇濃度所得靈芝多糖體外抗氧化活性如圖4 所示，不同濃度醇沉所得靈芝多糖均具有一定的DPPH 清除能力、羥基自由基清除能力及總抗氧化能力，且呈顯著差異。顯著性分析結果表明：GLP40、GLP50、GLP60、GLP80、GLP90兩兩間的DPPH 清除能力存在顯著性差異，GLP70 與GLP50 的DPPH 清除能力差異不顯著，與其他差異顯著。GLP40、GLP50、GLP60、GLP80、GLP90 兩兩間的羥基自由基清除能力存在顯著性差異，GLP70 與GLP90 的羥基自由基清除能力差異不顯著，與其他差異顯著。GLP40、GLP50、GLP60、GLP70、GLP90 兩兩間的總抗氧化能力存在顯著性差異，GLP70 與GLP80 的總抗氧化能力差異不顯著，與其他差異顯著。其中，羥基自由基清除能力隨著乙醇濃度的增加而增強，而DPPH 清除能力和總抗氧化能力無明顯的變化規(guī)律，GLP90 的DPPH 清除能力、羥基自由基清除能力、總抗氧化能力均最大。

2.5 靈芝多糖對鼠李糖乳桿菌LGG 生長的影響

不同乙醇濃度所得靈芝多糖對鼠李糖乳桿菌LGG 的生長曲線如圖5 所示。由圖5 可知，與對照相比，靈芝多糖能促進鼠李糖乳桿菌LGG 的生長，且不同乙醇濃度沉淀所得多糖的促進作用有差異。GLP40 處理的初始刺激效果最強，4 h 以后快速進入對數生長期；而其他多糖處理在4 h之前比對照生長慢，但是4 h 之后快速超過對照，進入對數生長期，同時對數期比對照延遲2 h 以上。經過培養(yǎng)20 h，GLP40、GLP50、GLP60、GLP70、GLP80、GLP90 處理的生長曲線有多次重復交叉，可能源于不同靈芝多糖樣品中含有刺激鼠李糖乳桿菌LGG 不同生長階段的成分，但是還需進一步研究。

3 討論

多糖是靈芝子實體中重要的功能性成分之一，多糖中單糖種類、分子量、官能團等影響著多糖的結構特征。靈芝子實體中多糖種類豐富，含巖藻糖、半乳糖、阿拉伯糖、甘露糖、木糖、葡萄糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸等單糖中的一種或幾種，且以α-或β-糖苷鍵相連[19]，其中β 型多糖起主要的生物活性作用[20-21]。同一品種不同狀態(tài)（發(fā)酵液、菌絲體和子實體）靈芝多糖的組成存在差異[22]，且不同提取方法的靈芝多糖結構和生物活性也存在差異，由于不同濃度乙醇對不同分子量的靈芝多糖具有不同的沉淀效果[23]，導致本研究中6 種多糖樣本的單糖占比存在較大差異。KAN 等[12]研究表明，分級沉淀中各組分存在濃度的交叉性，比如GLP60 組分含有40%、50%、60%3 種濃度下沉淀的多糖成分，GLP60 中葡萄糖含量最高，由于沉淀方法的差異導致二者結果也有差異。官能團組成是靈芝多糖結構的另一個重要特征，本研究所得6 種靈芝多糖組分官能團組成無較大差異，與劉鈞發(fā)等[24-25]的研究結果一致。由此可見，栽培方式、提取方法等因素對靈芝多糖結構官能團的影響較小。

靈芝多糖的體外抗氧化活性及其生物活性與多糖構型、分子量等結構特征緊密相關[26-27]。ZHEN 等[28]從樹舌中分離純化出靈芝均質多糖，其中分子量為6.82×10⁵Da 的多糖組分能顯著抑制MCF-7 細胞的增殖。KAN 等[12]采用分級沉淀得到GLP40、GLP60 和GLP80 三種多糖組分，GLP80 的DPPH 清除能力、羥基自由基清除能力及總抗氧化能力最強，其次是GLP60 和GLP40，高濃度乙醇沉淀物的體外抗氧化活性較強，與本研究結果一致?？赡苡捎贒PPH 清除能力、羥基自由基清除能力及總抗氧化能力3 種檢測方法的作用機理不同，且與KAN 等[12]的提取方法不同，從而導致本研究中6 種多糖組分的3 種體外抗氧化活性的變化規(guī)律不一致。CAI 等[10]采用級聯膜技術分離得到3 種多糖組分，進行小鼠實驗發(fā)現分子量在10 kDa 以上的多糖能延長游泳時間，提高耐力和促進疲勞恢復。本研究中乙醇濃度大于70%所得分子量在10 kDa 以上的多糖組分呈下降趨勢，由此可以推斷70%乙醇能將大部分靈芝功效成分分離出來。吳林秀[29]的研究結果表明，茶樹菇多糖可以有效防止鼠李糖桿菌LGG 被活性氧抑制，并且提供碳源能促進鼠李糖桿菌生長，同時作為益生元能促進益生菌的增殖，從而更好地調節(jié)胃腸道功能。本研究結果表明，6 種靈芝多糖組分均有助于促進鼠李糖乳桿菌LGG 的生長，為靈芝多糖的產品開發(fā)提供基礎數據支撐，但其作用效果存在一定差異，今后需進一步研究靈芝多糖刺激鼠李糖桿菌生長的作用機理。

本文研究了梯度乙醇沉淀工藝對靈芝多糖結構特征及生物活性的影響，結果表明：靈芝多糖主要由鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖組成，梯度乙醇沉淀工藝未改變6 個多糖組分中單糖種類組成和官能團組成，但影響了6 個多糖組分的各單糖含量、分子量分布、體外抗氧化活性等，靈芝多糖能促進鼠李糖乳桿菌LGG 的生長。本研究為靈芝多糖提取工藝研究及產品開發(fā)提供了基礎數據支撐。