石邈 續(xù)力云 陳志軍 陸暢暢 周吉航 黃燕燕

作者單位：316021 舟山醫(yī)院胸心外科（石邈、陳志軍），細胞分子生物實驗室（續(xù)力云、陸暢暢、周吉航、黃燕燕）

肺癌是全球發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤，其5 年生存率低于20%[1]。目前治療肺癌的方法主要有手術(shù)、放療、化療、靶向治療、免疫治療及聯(lián)合治療[2]，然而機體本身就存在抗腫瘤的防御機制，細胞衰老就是其中之一。細胞衰老是細胞永久失去增殖能力但仍保留正常細胞代謝活力的一種狀態(tài)。一般而言，當(dāng)機體受到外界不良刺激，如氧化應(yīng)激、DNA 損傷等，細胞周期就會停滯，隨之細胞開始出現(xiàn)衰老。越來越多的研究表明細胞衰老不僅與腫瘤抑制有關(guān)，而且與正常衰老、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和其他許多退行性疾病也息息相關(guān)[3-5]。

雖然藥物誘導(dǎo)的細胞凋亡是抗腫瘤的主要機制，但是細胞衰老也在其中發(fā)揮了一定的作用[6]。有研究發(fā)現(xiàn)在肺癌患者接受放射治療的過程中，抑制腫瘤生長的方式是細胞衰老而非細胞凋亡[7]。那么抗癌藥物是否也能誘導(dǎo)細胞衰老，從而抑制惡性腫瘤細胞的增殖，這極大地吸引了研究者的興趣。本研究分別選用順鉑（cisplatin，DDP）、Nutlin-3 的活性異構(gòu)體（Nutlin-3a）、4-異硫脲基丁腈鹽酸鹽（kevetrin hydrochlorid,Kevetrin）等3 種藥物體外處理肺癌細胞，探討藥物誘導(dǎo)腫瘤細胞衰老的可能機制和對腫瘤治療的潛在價值。

1 材料和方法

1.1 細胞來源及培養(yǎng) 人肺腺癌細胞A549、人大細胞肺癌細胞H460 和人非小細胞肺癌細胞H2228 均購于中國科學(xué)院上海細胞庫。A549 細胞完全培養(yǎng)基為含10%FBS 的F12 培養(yǎng)基，H460 和H2228 的完全培養(yǎng)基均為含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。

1.2 主要試劑 DDP（批號：232120，美國Sigma 公司）；Nutlin-3a（批號：SML0580，美國Sigma 公司）；Kevetrin（批號：903507，美國Sigma 公司）；β-半乳糖苷酶細胞衰老染色試劑盒（批號：K146501，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；Click-iT?EdU Alexa FluorTM555 Imaging Kit 試劑盒（批號：C10338，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；衰老相關(guān)分子p53 抗體（批號：2527T，美國Cell Signaling Technology 公司）；p21 抗體（批號：2947s，美國Cell Signaling Technology 公司）；β-actin 抗體（批號：20536-I-AP,美國Proteintech 公司）；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）（批號：BL006B，北京Biosharp Life Sciences）等；Real-time qPCR 試劑（批號：RR820A，日本Takara 公司）；CCK-8 細胞增殖與毒性檢測試劑盒（批號：C008，七海生物科技公司）；ABI 熒光定量PCR 儀（型號：7500，美國Applied Biosystems 公司）。

1.3 細胞衰老檢測 采用β-半乳糖苷酶染色。吸棄細胞培養(yǎng)液，加入1 ml β-半乳糖苷酶染色固定液，室溫固定15 min，吸去固定液，加入1 ml 染色工作液，37 ℃恒溫箱中孵育過夜，培養(yǎng)1 周后，光學(xué)顯微鏡下觀察各組細胞的形態(tài)和間質(zhì)變化，鏡下觀察染色，陽性細胞（衰老細胞）呈深藍色，陰性細胞無著色。各組隨機計數(shù)40 個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算陽性細胞率（%）。各組獨立重復(fù)實驗3 次。具體分組如下：設(shè)置對照組和不同濃度DDP（1.562 5、3.125、6.25、12.5 μmol/L）處理組分別處理A549、H460、H2228 肺癌細胞株；同理，設(shè)置二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）對照組和不同濃度Nutlin-3a（2、4、8、16 μmol/L）處理組分別處理A549、H460、H2228 肺癌細胞；設(shè)置空白對照組和100 μmol/L Kevetrin 處理組分別處理A549 肺癌細胞。1.4 細胞增殖實驗 采用EdU染色。在細胞培養(yǎng)液中加入EdU 工作液，室溫孵育2 h；去上清液，加入1 ml 3.7%甲醛固定液，室溫孵育15 min，用含3%BSA 的PBS 洗1 次；加入1 ml 含0.5% Triton?X-100 PBS 通透液，室溫作用15 min，用含3%BSA 的PBS 洗1 次；隨后加入試劑盒中的Click-iT?reaction cocktail，室溫避光孵育30 min，用含3%BSA 的PBS 洗1 次，加入試劑盒組分G: Hoechst?33342 室溫孵育30 min，染核，PBS 洗1次后；熒光顯微鏡下觀察、拍照，處于增殖狀態(tài)的細胞為紅色陽性細胞，藍色為細胞核。各組隨機計數(shù)40 個細胞中的陽性細胞數(shù)，計算增殖細胞陽性率（%），各組分別獨立重復(fù)實驗3次。具體分組為：設(shè)置6.25 μmol/L DDP 及其對照組、8 μmol/L Nutlin-3a 及其DMSO 對照組分別處理A549 細胞。

1.5 細胞存活率檢測 采用CCK-8 法。取100 μl 細胞密度為5×104個/ml 的對數(shù)生長期肺癌細胞，接種于96 孔板，次日根據(jù)實驗分組換液，換成含相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)液，作用72 h 后，向每孔加入10 μl CCK-8溶液，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育2 h，酶標(biāo)儀測定450 nm 處吸光度（A）值。實驗組藥物濃度分別為6.25 μmol/L DDP、8 μmol/L Nutlin-3a 和100 μmol/L Kevetrin，每組各設(shè)置6 個復(fù)孔。計算細胞存活率，細胞存活率=[（A實驗孔吸光度-A空白孔吸光度）/（A對照孔吸光度-A空白孔吸光度）]×100%。

1.6 肺癌細胞p21 mRNA 表達水平 采用Real-time qPCR 法。具體為：提取細胞樣本RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，作為PCR 擴增模板，PCR 反應(yīng)體系各做3 份復(fù)孔，ABI 熒光定量PCR 儀上機檢測，擴增程序如下：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，68 ℃延伸35 s，重復(fù)40 個循環(huán)。p21 正向引物：5'-CCATGTGGACCTGTCACTGT- 3'，反向引物：5'- GTGGTAGAAATCTGTCATGCTGG-3'；GAPDH 正向引物：5'-CATCATCCCTGCCTCTACTG-3'，反向引物：5'-GCCTGCTTCACCACCTTC-3'。以GAPDH 作為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法分析不同藥物對p21 表達水平的影響。

1.7 肺癌細胞p53 和p21 蛋白表達檢測 采用Western blot 法。取1×105個/ml 的對數(shù)生長期細胞接種于24 孔板，參照1.3 分別設(shè)置3 種不同藥物不同濃度梯度藥物處理組和空白對照組。DDP 和Nutlin-3a 藥物處理細胞1 周，Kevetrin 藥物處理細胞1 和2 h，以及對應(yīng)時間的各自對照組細胞，細胞裂解液充分裂解細胞，提取蛋白樣品，經(jīng)12%SDS-PAGE 凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜于0.45 μm 硝酸纖維素膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗4 ℃孵育過夜；TBST 洗膜3 次各10 min，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（1∶10 000）室溫孵育1 h，TBST 洗膜3 次各10 min，將膜置于ECL 化學(xué)發(fā)光劑中顯影、拍照，β-actin 或GAPDH 作為內(nèi)參，檢測各分組細胞p53 和p21 蛋白表達水平。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；兩組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DDP、Nutlin-3a 和Kevetrin 對肺癌細胞衰老的影響 光學(xué)顯微鏡下觀察到1.562 5、3.125、6.25、12.5 μmol/L DDP 處理的A549、H460 和H2228 細胞胞體增大，β-半乳糖苷酶藍染衰老細胞增多，見圖1（插頁）。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，不同濃度DDP 處理組A549、H460 和H2228 陽性細胞率均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖2。此外，光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)2、4、8、16 μmol/L Nutlin-3a 處理的H460、H2228肺癌細胞，8 μmol/L Nutlin-3a處理的A549細胞，100 μmol/L Kevetrin 處理的A549 細胞，均發(fā)現(xiàn)藍染衰老細胞增多，見圖3（插頁）。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與DMSO 對照組比較，不同濃度Nutlin-3a 處理組H460 和H2228 陽性細胞率均增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4A。與DMSO 對照組比較，8 μmol/L Nutlin-3a 處理組A549 陽性細胞率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（8.33%±0.83%比30.47%±1.67%，P＜0.01），見圖4B。與空白對照組比較，100 μmol/L Kevetrin 處理組A549 陽性細胞率增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（18.33%±1.67%比71.67%±1.67%，P＜0.01），見圖4C。

圖1 光學(xué)顯微鏡下觀察1.562 5、3.125、6.25、12.5 μmol/L DDP 處理組和對照組對A549、H460 及H2228 肺癌細胞衰老的影響

圖2 不同濃度DDP 處理組和對照組陽性細胞率比較

圖3 光學(xué)顯微鏡下觀察所見（A：光學(xué)顯微鏡下觀察2、4、8、16 μmol/L Nutlin-3a 處理組及DMSO 對照組對H460 及H2228 細胞衰老的影響；B：光學(xué)顯微鏡下觀察8 μmol/L Nutlin-3a 處理組及DMSO 對照組對A549 細胞衰老的影響；C：光學(xué)顯微鏡下觀察100 μmol/L Kevetrin 處理組及空白對照組對A549 細胞衰老的影響）

2.2 DDP 和Nutlin-3a 對肺癌細胞增殖的影響 利用EdU 染色觀察6.25 μmol/L DDP 及其對照組、8 μmol/L Nutlin-3a 及其DMSO 對照組對A549 細胞株增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在熒光顯微鏡下各藥物處理組的紅色陽性細胞，即正處于細胞增殖分裂狀態(tài)的細胞數(shù)目明顯少于對照組，見圖5A、B（插頁）。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，6.25 μmol/L DDP 處理組增殖細胞陽性率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（53.33%±1.67%比8.33%±0.83%，P＜0.05），見圖5C（插頁）。與DMSO 對照組比較，8 μmol/L Nutlin-3a 處理組增殖細胞陽性率降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（28.33%±1.67%比0.83%±0.08%，P＜0.05），見圖5D（插頁）。

圖5 DDP 和Nutlin-3a 對A549 肺癌細胞增殖的影響（A：6.25 μmol/L DDP 對A549 細胞增殖的影響，EdU 染色，×400；B：8 μmol/L Nutlin-3a 對A549 細胞增殖的影響，EdU 染色，×400；C：6.25 μmol/L DDP 處理組及對照組增殖細胞陽性率比較,與對照組比較，aP＜0.05；D：8 μmol/L Nutlin-3a 處理組及DMSO 對照組增殖細胞陽性率比較；與DMSO 對照組比較，aP＜0.01）

2.3 DDP、Nutlin-3a 和Kevetrin 對肺癌細胞存活率的影響 給藥72 h 后，與各自對照組比較，6.25 μmol/L DDP、8 μmol/L Nutlin-3a 和100 μmol/L Kevetrin 處理組A549、H460、H2228 細胞存活率均降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖6。

圖6 DDP、Nutlin-3a 和Kevetrin 對肺癌細胞存活率的影響（A：6.25 μmol/L DDP 處理組和對照組肺癌細胞存活率比較，與對照組比較，aP＜0.05；B：8 μmol/L Nutlin-3a 處理組和DMSO 對照組肺癌細胞存活率比較，與DMSO 對照組比較，aP＜0.05；C：100 μmol/L Kevetrin 處理組和空白對照組肺癌細胞存活率比較，與空白對照組比較，aP＜0.05）

2.4 DDP、Nutlin-3a 和Kevetrin 對A549 肺癌細胞p21 mRNA 表達水平的影響 與對照組比較，6.25 μmol/L DDP處理組肺癌細胞p21 mRNA表達水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（1.000±0.104比5.400±0.717，P＜0.05），見圖7A。與DMSO 對照組比較，8 μmol/L Nutlin-3a 處理組肺癌細胞p21 mRNA表達水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（1.018±0.063 比45.340±18.530，P＜0.05），見圖7B。與空白對照組比較，100 μmol/L Kevetrin 處理組肺癌細胞p21 mRNA 表達水平上調(diào)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（0.890±0.153 比11.400±2.642，P＜0.05），見圖7C。

圖7 DDP、Nutlin-3a 和Kevetrin 對A549 肺癌細胞p21 mRNA 表達水平的影響（A：6.25 μmol/L DDP 處理組和對照組肺癌細胞p21 mRNA 表達水平比較，與對照組比較，aP＜0.05；B：8 μmol/L Nutlin-3a 處理組和DMSO 對照組肺癌細胞p21 mRNA 表達水平比較，與DMSO 對照組比較，aP＜0.05；C：100 μmol/L Kevetrin 處理組和空白對照組肺癌細胞p21 mRNA 表達水平比較，與空白對照組比較，aP＜0.05）

2.5 DDP、Nutlin-3a 和Kevetrin 對肺癌細胞p53 和p21蛋白表達的影響 與對照組比較，不同濃度DDP 處理組肺癌細胞p53 和p21 蛋白表達水平均升高，且p21 蛋白表達水平隨著藥物濃度的梯度增高而升高，見圖8。與DMSO 對照組比較，不同濃度Nutlin-3a 處理組A549、H460 細胞p53 和p21 蛋白表達水平均升高，見圖9A、B。與空白對照組比較，100 μmol/L Kevetrin 處理組A549 細胞p21 蛋白表達水平上調(diào)，p53 蛋白表達水平變化不明顯，見圖9C。

圖8 DDP 對肺癌細胞p53 和p21 蛋白表達的影響（A：不同濃度DDP 對A549 細胞p53 和p21 蛋白表達水平的影響；B：不同濃度DDP 對H460 細胞p53 和p21 蛋白表達水平的影響；C：不同濃度DDP 對H2228 細胞p53 和p21 蛋白表達水平的影響）

圖9 Nutlin-3a、Kevetrin 對肺癌細胞p53 和p21 蛋白表達的影響（A：不同濃度Nutlin-3a 對A549 細胞p53 和p21 蛋白表達水平的影響；B：不同濃度Nutlin-3a 對H460 細胞p53 和p21 蛋白表達水平的影響；C：100 μmol/L Kevetrin 對A549 細胞p53 和p21 蛋白表達水平的影響）

3 討論

DDP 作為臨床治療肺癌患者的一線基礎(chǔ)化療用藥，目前一致認為鉑類藥物發(fā)揮抗腫瘤的主要機制是抑制DNA 復(fù)制，其主要作用在細胞有絲分裂的G2 期，能夠誘導(dǎo)腫瘤細胞死亡。Nutlin-3a 是以MDM2-p53 為靶點設(shè)計開發(fā)的MDM2 抑制劑，是當(dāng)下腫瘤藥物研發(fā)的熱點之一。眾所周知，p53 是抑癌基因，而MDM2 是p53 基因的一個重要抑制因子，兩者相結(jié)合可使p53 蛋白降解，導(dǎo)致抑癌作用減弱[7]。相反，另一種藥物Kevetrin 也是抗腫瘤藥物，能夠激活p53 抑癌基因的能力，抑制腫瘤生長[8]。

上述3 種藥物都具有抗腫瘤生長作用，但在有關(guān)能夠誘導(dǎo)肺癌細胞衰老方面研究甚少。研究表明衰老細胞會停止分裂，然而不同于靜止的細胞，衰老細胞不僅體積會增大，而且在顯微鏡下觀察到細胞形態(tài)會變得平滑而不規(guī)則，細胞內(nèi)衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶活性增加[4]。本研究設(shè)計了3 種藥物對肺癌細胞作用的體外試驗，探討藥物是否能夠誘導(dǎo)肺癌細胞衰老，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DDP、Nutlin-3a 及Kevetrin 處理的A549、H460 和H2228 細胞，胞體增大，β-半乳糖苷酶藍染陽性衰老細胞增多，陽性細胞率增高。

細胞衰老的主要特征表現(xiàn)是細胞周期停滯，即細胞停止分裂，同時伴隨著線粒體功能紊亂，促炎反應(yīng)增強[9-11]。既往研究認為，在機體內(nèi)，一方面細胞衰老是對抗腫瘤形成、發(fā)展的天然保護屏障，包括惡性腫瘤的放射治療和化療藥物[12]；另一方面，衰老細胞過多的積累將會反向損害器官組織的正常功能，并促進衰老[13]。本研究通過藥物的細胞毒性實驗及EdU 染色細胞增殖實驗，發(fā)現(xiàn)DDP、Nutlin-3a 和Kevetrin 均可使肺癌細胞存活率明顯降低，細胞增殖能力減弱，這也許是其發(fā)揮誘導(dǎo)肺癌細胞衰老機制之一。

以往研究發(fā)現(xiàn)，無論是體外還是體內(nèi)實驗，利用化學(xué)藥物治療惡性腫瘤后，腫瘤細胞停止生長，出現(xiàn)衰老，并且p53 參與其中的分子調(diào)控，同時還說明了p21 是p53 影響基因表達的主要中介[3]。此外，細胞在衰老的過程中，它的基因表達譜會發(fā)生急劇變化，尤其是與細胞周期抑制因子或者激活因子相關(guān)的基因，其中包括p21 和p16 的過表達，抑制了編碼蛋白質(zhì)刺激細胞周期的基因[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，6.25 μmol/L DDP、100 μmol/L Nutlin-3a 及8 μmol/L Kevetrin 可使A549 肺癌細胞p21 mRNA 表達水平上調(diào)，且DDP 和Nutlin-3a可上調(diào)A549、H460 和H2228 肺癌細胞p53 和p21 蛋白表達水平。

細胞衰老特征的主要表現(xiàn)包括了不可逆性細胞周期停滯、細胞形態(tài)扁平增大、基因表達和染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變以及衰老相關(guān)的β-半乳糖苷酶和分泌型表型的獲得[15]。故本研究不足之處未能分析檢測藥物誘導(dǎo)下肺癌細胞衰老時細胞內(nèi)染色質(zhì)的改變及衰老細胞的衰老相關(guān)分泌表型。

以往研究大多認為細胞衰老能夠抑制腫瘤生長，然而近期研究發(fā)現(xiàn)，衰老細胞在腫瘤中持續(xù)存在，在癌癥中誘導(dǎo)衰老可能會在化療或靶向治療時促進復(fù)發(fā)[16]。因此，鑒定由衰老細胞特異性表達而在增殖細胞中缺失的治療靶點很有必要[17]?？傊狙芯堪l(fā)現(xiàn)DDP、Nutlin-3a、Kevetrin 3 種藥物都能夠誘導(dǎo)肺癌細胞衰老，抑制腫瘤細胞增殖，這也許對今后肺癌的治療提供一種新策略。