賈 瑞，王 超，李 健

(秦皇島市第一醫(yī)院胸外科,河北 秦皇島 066000)

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤之一,國家癌癥中心的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2016年肺癌在我國男性中的發(fā)病率、病死率均居惡性腫瘤首位,在女性中的發(fā)病率居惡性腫瘤第2位,但病死率仍居首位[1]。目前,肺癌的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明,其發(fā)病可能與吸煙、職業(yè)暴露、電離輻射、肺部病史等有關(guān)。肺癌中80%以上為非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)[2]。近年來,隨著分子靶向治療、免疫治療的不斷發(fā)展,肺癌的治療效果已經(jīng)取得較大的進(jìn)步,但NSCLC患者病死率仍居高不下,主要是因?yàn)槎鄶?shù)患者確診時(shí)已發(fā)展至中晚期,再加上化學(xué)治療藥物使用時(shí)間的延長、藥物劑量的加大,導(dǎo)致耐藥性增加,影響患者預(yù)后[3-4]。長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,LncRNA)是指長度>200個(gè)核苷酸,缺少長的進(jìn)化保守開放閱讀框,且無編碼蛋白質(zhì)功能的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。有研究表明,LncRNA在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長和新陳代謝中發(fā)揮重要作用,其轉(zhuǎn)錄失調(diào)可直接影響腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、凋亡及其對(duì)藥物的敏感性[5]。因此,本研究以對(duì)化學(xué)治療藥物順鉑耐藥的Ⅲb～Ⅳ期的NSCLC患者為研究對(duì)象,探討癌組織中轉(zhuǎn)錄失調(diào)的LncRNA對(duì)順鉑耐藥NSCLC細(xì)胞生物學(xué)特性的影響及其作用機(jī)制,現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 組織標(biāo)本來源選擇2019年4月至2021年2月秦皇島市第一醫(yī)院收治NSCLC患者61例為研究對(duì)象。病例納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合NSCLC診斷標(biāo)準(zhǔn)[6],經(jīng)組織病理檢查確診;(2)患者對(duì)化學(xué)治療藥物產(chǎn)生耐藥性;(3)腫瘤分期為Ⅲb～Ⅳ期[7];(4)能配合完成標(biāo)本采集,且患者近期未使用其他方法治療。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)存在其他部位惡性腫瘤者或存在精神異常者;(2)凝血功能異常,或伴有自身免疫系統(tǒng)疾病者;(3)病情惡化或研究期間死亡者。61例患者中男36例,女25例;年齡45～74(58.49±5.61)歲;體質(zhì)量指數(shù)19～31(23.37±3.41)kg·m-2;腫瘤分期:Ⅲb期40例,Ⅳ期21例;病理學(xué)分型:鱗狀細(xì)胞癌34例,腺癌27例;伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移17例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移44例。本研究獲秦皇島市第一醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(編號(hào):2020F029)。

1.2 細(xì)胞、主要藥物及試劑人NSCLC順鉑耐藥細(xì)胞株A549/DDP購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫;TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green master mix購自大連TaKaRa公司,LncRNA HOXA11反義RNA HOXA11-AS過表達(dá)質(zhì)粒、pcDNA3.1載體購自北京華大基因公司,噻唑藍(lán) (methyl thiazolyl tetrzaolium,MTT)試劑盒購自美國Thermo Fisher公司,磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)抗體購自美國Cell Signaling Technology公司,β-actin抗體購自美國Proteintech公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)將A549/DDP細(xì)胞置于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbeco′s modified Eagle′s medium,DMEM)中進(jìn)行培養(yǎng),每100 mL培養(yǎng)液中加入青霉素(100 kU·L-1)和鏈霉素(100 mg·L-1)各1 mL。取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞備用。

1.4 差異表達(dá)的LncRNA的篩選及驗(yàn)證采用經(jīng)皮肺穿刺方法獲取NSCLC患者的肺癌組織及癌旁組織(距離病灶>3 cm),生理鹽水沖洗2～3次,放入RNA保存液內(nèi),置于4 ℃冰箱中24 h,然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中。分別提取肺癌組織和癌旁組織的總RNA,并進(jìn)行純化和質(zhì)量監(jiān)測,去除核糖體RNA并構(gòu)建文庫,應(yīng)用Illumina Hiseq 4000完成測序;對(duì)原始測序數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)量控制后,完成RNA表達(dá)定量分析[8-9]。然后采用Cufflinks進(jìn)行LncRNA表達(dá)定量分析,篩選出差異表達(dá)的LncRNA。取篩選出的差異表達(dá)LncRNA常規(guī)進(jìn)行基因本體(gene ontology,GO)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)分析[10],然后采用定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)驗(yàn)證差異表達(dá)的LncRNA的表達(dá)量。

1.5 細(xì)胞生物學(xué)特性測定

1.5.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將篩選出的差異表達(dá)LncRNA HOXA11-AS克隆于pcDNA3.1載體上進(jìn)行質(zhì)粒構(gòu)建[11],采用無內(nèi)毒素試劑盒提取質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞,建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HOXA11-AS(HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組)或空載體的細(xì)胞系(對(duì)照組)。

1.5.2 MTT法檢測2組細(xì)胞增殖能力取HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞接種于96孔板,每孔鋪2 000個(gè)細(xì)胞,每孔液體總量200 μL,鋪板完成后在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),細(xì)胞貼壁后每孔加入 20 μL MTT溶液,在含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中孵育3～4 h后,小心吸去上清,加入150 μL二甲基亞砜溶液。在多功能搖床上搖晃10 min,使用酶標(biāo)儀檢測各孔570 nm波長處的吸光度值,連續(xù)檢測 5 d[12]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。吸光度值越大,代表細(xì)胞增殖能力越大。

1.5.3 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測2組細(xì)胞遷移能力HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組各取1×105個(gè)細(xì)胞,接種于6孔板,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,置入含體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中,待細(xì)胞長滿后,用200 μL的移液器吸頭尖端垂直劃線,然后用磷酸緩沖鹽溶液洗去細(xì)胞碎片,加入無血清的DMEM,再次置入培養(yǎng)箱內(nèi);分別于0、24 h用倒置顯微鏡對(duì)各孔的劃線位置進(jìn)行拍照[13],用Image J軟件對(duì)空白區(qū)域的面積進(jìn)行測定,并計(jì)算出細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=(0 h 的空白面積-24 h的空白面積)/0 h的空白面積×100%。細(xì)胞遷移率越高表示細(xì)胞遷移能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.5.4 Transwell法檢測2組細(xì)胞侵襲能力取HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞用無血清培養(yǎng)基重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),調(diào)整細(xì)胞密度為5×108L-1后備用。預(yù)先在Transwell小室下部加入含體積分?jǐn)?shù)10% FBS的DMEM 600 μL,在Transwell小室上部分別加入2組細(xì)胞懸液200 μL;待細(xì)胞下沉至小室底膜后,再將整體小室放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 12 h。 然后取出培養(yǎng)基,加入40 g·L-1多聚甲醛固定10 min,磷酸緩沖鹽溶液沖洗,體積分?jǐn)?shù)0.1%的結(jié)晶紫染色20 min,倒置顯微鏡下隨機(jī)觀察5個(gè)視野的細(xì)胞并拍照,計(jì)算HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)量[13]。穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)越多表示細(xì)胞侵襲能力越強(qiáng)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

1.5.5 Western blot法檢測2組細(xì)胞中PI3K、AKT信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)參照文獻(xiàn)[14]中的方法測定HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白的表達(dá)。取HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組和對(duì)照組細(xì)胞,分別加入細(xì)胞裂解液,4 ℃、12 000 r·min-1離心 20 min后取上清液,進(jìn)行電泳分離蛋白,將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上,含50 g·L-1脫脂乳粉的等滲緩沖鹽溶液室溫封閉1 h,依次加入一抗和二抗,常規(guī)完成硝酸纖維素膜洗滌,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法顯色,膠片掃描后使用Bandscan 5.0軟件完成蛋白條帶灰度測定。 以目的蛋白的灰度值與內(nèi)參蛋白(β-actin)的灰度值的比值代表目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取平均值。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織和癌旁組織中差異表達(dá)的LncRNA共篩選出轉(zhuǎn)錄失調(diào)的LncRNA 311個(gè),其中表達(dá)上調(diào)的LncRNA有125個(gè),表達(dá)下調(diào)的LncRNA有186個(gè)。GO分析和KEGG分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)錄失調(diào)的LncRNA主要與細(xì)胞黏附、膠原蛋白黏附、細(xì)胞分化、細(xì)胞外基質(zhì)組織形成等功能有關(guān)。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果顯示,與mRNA共表達(dá)最多的前10個(gè)LncRNA分別為RP11-845C23.3、RP1-170O19.14、RP11-276F13.1、AC084809.2、PINK1-AS、RP11-688G15.3、CTD-2561B21.7、HOXA11-AS、RP11-597M12.1、RP5-1024G6.2(圖1)。其中HOXA11-AS在肺癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其他9個(gè)LncRNA在肺癌組織和癌旁組織中的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 因此,選擇HOXA11-AS轉(zhuǎn)染A549/DDP細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 LncRNA與mRNA的共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Co-expression network diagram of LncRNA and mRNA

2.2 2組細(xì)胞增殖能力比較結(jié)果見表1。培養(yǎng)1 d 時(shí),2組細(xì)胞的增殖能力比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);培養(yǎng)2、3、4、5 d時(shí),HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的增殖能力顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 對(duì)照組和HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖能力比較Tab.1 Comparison of cell proliferation activity between the control group and the HOXA11-AS transfection group

2.3 2組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較結(jié)果見圖2、圖3和表2。培養(yǎng)0 h 時(shí),2組細(xì)胞的遷移率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);培養(yǎng)24 h 時(shí),HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移率顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組穿過基底膜的細(xì)胞數(shù)顯著多于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖2 對(duì)照組和HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移能力 (×33)Fig.2 Migration ability of cells in the control group and the HOXA11-AS transfection group(×33)

圖3 對(duì)照組和HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞侵襲能力 (結(jié)晶紫染色,×200)Fig.3 Invasion ability of cells in the control group and the HOXA11-AS transfection group(crystal violet staining,×200)

表2 對(duì)照組與HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞遷移和侵襲能力比較Tab.2 Comparison of migration ability and invasion ability of cells between the control group and the HOXA11-AS transfection group

2.4 2組細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖4和表3。HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖4 對(duì)照組和HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白的表達(dá)(Western blot)Fig.4 Expression of PI3K,AKT protein in the control group and the HOXA11-AS transfection group(Western blot)

表3 對(duì)照組和HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of the relative expression of PI3K,AKT protein between the control group and the HOXA11-AS transfection group

3 討論

在哺乳動(dòng)物的基因組中,約有20 000個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因分散在重復(fù)和非轉(zhuǎn)錄的序列內(nèi),僅部分重要的或與進(jìn)化相關(guān)的基因被轉(zhuǎn)錄,而其他大量的非編碼RNA被視為轉(zhuǎn)錄過程中的“轉(zhuǎn)錄噪聲”。既往研究表明,LncRNA在具有基因調(diào)節(jié)功能的非編碼RNA中占較高的比例[15]。研究表明,LncRNA存在于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核內(nèi),能直接參與胚胎的發(fā)育、物質(zhì)代謝、物種的進(jìn)化,亦可參與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展,諸多惡性腫瘤存在LncRNA的異常表達(dá)。RNA-seq作為測定全轉(zhuǎn)錄組表達(dá)的一種新技術(shù),能進(jìn)一步篩選出差異表達(dá)的LncRNA,從而為多種疾病的臨床診療提供參考依據(jù)。本研究中,肺癌組織和癌旁組織中共篩選出311個(gè)差異表達(dá)LncRNA,其中125個(gè)LncRNA的表達(dá)上調(diào),186個(gè)LncRNA的表達(dá)下調(diào)。共表達(dá)最多的前10個(gè)LncRNA中HOXA11-AS在肺癌組織中的表達(dá)量顯著高于癌旁組織,其余9個(gè)在2種組織中的表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,因此,選擇HOXA11-AS轉(zhuǎn)染的A549/DDP細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。本研究結(jié)果顯示,HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞在培養(yǎng)2、3、4、5 d時(shí)的增殖能力均顯著高于對(duì)照組;HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞的遷移和侵襲能力顯著高于對(duì)照組; HOXA11-AS轉(zhuǎn)染組細(xì)胞中PI3K、AKT蛋白的相對(duì)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組;說明LncRNA中的HOXA11-AS能有效促進(jìn)耐藥肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲,其機(jī)制可能與HOXA11-AS激活PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān),PI3K/AKT信號(hào)通路能通過調(diào)控基因表達(dá)調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、分化、生長和凋亡等,從而推測LncRNA中HOXA11-AS可能與肺癌耐藥的發(fā)生、發(fā)展存在一定的關(guān)系。

HOXA11-AS是同源盒家族基因中的一員,位于染色體7q15.2上。HOXA11-AS能夠促進(jìn)多種腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移,并且與多種腫瘤的侵襲能力相關(guān),在NSCLC中同樣有促癌作用[16]。有研究發(fā)現(xiàn),在NSCLC組織中HOXA11-AS的表達(dá)顯著上調(diào),是正常肺組織中的2.38倍,并且與NSCLC患者的預(yù)后相關(guān)[17]。關(guān)于HOXA11-AS作用機(jī)制的研究,目前尚處于早期階段,其參與腫瘤化學(xué)治療耐藥的機(jī)制尚不十分明確。WEI等[18]研究顯示,HOXA11-AS可促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞對(duì)活性氧的敏感性。LI等[19]研究發(fā)現(xiàn), HOXA11-AS上調(diào)后可通過miR-98/PBX3 軸增強(qiáng)鼻咽癌對(duì)順鉑的耐藥性,為順鉑耐藥的鼻咽癌患者提供了潛在的治療靶點(diǎn)。CHEN等[20]研究發(fā)現(xiàn),敲低HOXA11-AS后可增加卵巢癌細(xì)胞中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá),提高癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性,減少卵巢癌細(xì)胞增殖,促進(jìn)其凋亡。ZHANG等[21]研究表明,肺癌A549細(xì)胞中HOXA11-AS敲低后可增加癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性并抑制AKT/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo),而過表達(dá)A549/DDP細(xì)胞中的HOXA11-AS后可使癌細(xì)胞對(duì)順鉑產(chǎn)生抵抗并激活A(yù)KT/β-連環(huán)蛋白信號(hào)傳導(dǎo)。

綜上所述,轉(zhuǎn)錄失調(diào)的LncRNA可能參與了NSCLC的發(fā)生與發(fā)展,其中HOXA11-AS可能激活了PI3K/AKT信號(hào)通路,從而影響細(xì)胞的增殖、遷移及侵襲能力,本研究結(jié)果為NSCLC患者繼發(fā)耐藥的治療提供了新的思路。