朱 瑜，鄭 志，2，3，朱紹輝，3，候 棟，3，陳 璇，權(quán)英珠，樸丙熙，姜林娟

(1．新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院/新鄉(xiāng)市醫(yī)藥微生物應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 新鄉(xiāng) 453003;2.韓陵醫(yī)藥研究院有限公司,江蘇 南京 211100;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院新鄉(xiāng)市肥胖及2型糖尿病診療研究與醫(yī)學(xué)轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 衛(wèi)輝 453100;4.梨花女子大學(xué)藥學(xué)院,韓國(guó) 首爾 04393;5.萊帕堅(jiān)公司,韓國(guó) 首爾 04393)

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種常見(jiàn)的慢性復(fù)發(fā)性疾病,主要癥狀為腹瀉、腹痛、黏液膿血便,且多伴有營(yíng)養(yǎng)不良,其機(jī)制與炎癥活動(dòng)、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)流失、營(yíng)養(yǎng)吸收障礙、代謝紊亂等有關(guān)[1-2]。到目前為止,還沒(méi)有根除UC的治療方案。最新研究證實(shí),針對(duì)UC患者應(yīng)先考慮改善腸道菌群平衡、營(yíng)養(yǎng)不良,才能緩解結(jié)腸炎癥狀,從而改善治療結(jié)局[3]。山藥是具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的藥食同源食材,含多糖、薯蕷皂苷元等營(yíng)養(yǎng)成分,具有補(bǔ)脾養(yǎng)胃、增強(qiáng)免疫力等功能;中藥學(xué)認(rèn)為,UC治療可選用性質(zhì)較為溫和的山藥。但山藥的開(kāi)發(fā)和利用存在局限性,目前如何提高山藥利用價(jià)值仍是主要挑戰(zhàn)[4]。本課題組前期研究證實(shí),益生菌體外接種復(fù)合發(fā)酵方案可抑制腸道內(nèi)的致病菌,提高腸道免疫力,對(duì)多種慢性疾病有改善作用[5-8]。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)不僅具有降低膽固醇和血壓、增強(qiáng)人體免疫及預(yù)防癌癥等功效,還能促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收,可用于預(yù)防或治療腸道微生物群紊亂相關(guān)疾病[9]。基于此,本研究應(yīng)用干酪乳桿菌SJP6841L2菌(KCCM10729P)制作干酪乳桿菌與山藥復(fù)合發(fā)酵劑,探討其對(duì)2,4,6-三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitro-benzene-sulfonic acid,TNBS)誘導(dǎo)的UC小鼠腸道菌群平衡的影響及抗炎作用,為提高山藥利用價(jià)值及制定防治慢性UC患者的營(yíng)養(yǎng)膳食策略奠定基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)菌60只無(wú)特定病原體級(jí)5周齡雄性BALB/C小鼠購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,體質(zhì)量(19.8±1.6)g。飼養(yǎng)環(huán)境為溫度(22±2) ℃、濕度(55±8)%,正常飲食,光/暗周期12 h/12 h。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)要求。干酪乳桿菌SJP6841L2(KCCM10729P)由韓國(guó)萊帕堅(jiān)公司贈(zèng)送。

1.2 主要試劑和儀器山藥產(chǎn)于河南焦作,普通滅菌飼料、墊料購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,TNBS購(gòu)自西格瑪奧德里奇(上海)有限公司,API 50 CHL Medium菌株快速鑒定試劑盒購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司,益生菌選擇性培養(yǎng)基、菌株選擇性培養(yǎng)基亞硫酸鉍瓊脂和乳酸桿菌選擇性培養(yǎng)基購(gòu)自青島海博生物公司,乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品購(gòu)自德國(guó)Sigma公司,密封蛋白1(claudin 1)、閉鎖小帶蛋白-1(zonula occludens-1,ZO-1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)一抗和二抗購(gòu)自美國(guó)圣克魯斯生物技術(shù)公司,血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)、核因子-κB (nuclear factor kappa B,NF-κB)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Biolegend公司;HH.CP-T01A型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自杭州川一實(shí)驗(yàn)儀器有限公司,SX-300型高溫高壓滅菌鍋購(gòu)自日本Tomy公司,CX21型光學(xué)生物顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司,HZQ-F160A型恒溫震蕩培養(yǎng)箱購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司,754型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)購(gòu)自上海菁華科技儀器有限公司,FD-1型壓蓋冷凍干燥機(jī)購(gòu)自北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司,UV-2100型紫外分光光度計(jì)購(gòu)自鄭州南北儀器設(shè)備有限公司,5804R型高速冷凍離心機(jī)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司,HR-2型手持式組織勻漿機(jī)購(gòu)自上海瀘析實(shí)業(yè)有限公司,VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司,7890型氣相色譜儀、DB-FFAP毛細(xì)管柱購(gòu)自美國(guó)安捷倫公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑和無(wú)發(fā)酵山藥劑制作將干酪乳桿菌放入乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基,37 ℃下培養(yǎng)48 h后進(jìn)行活化備用。山藥粉末制備:在300 g 山藥中加入1.5 L蒸餾水,95 ℃下滅菌1 h,冷凍、干燥后獲得山藥粉末,保存于-20 ℃冰箱備用。干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵粉末制備:將山藥粉末放入干酪乳桿菌混合液中,調(diào)整菌數(shù)為8×109CFU·L-1,37 ℃ 發(fā)酵 3 d,每天檢測(cè)pH值和酸堿度;發(fā)酵結(jié)束后,經(jīng)過(guò)濾、冷凍、干燥后獲得干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵粉末,保存于-20 ℃冰箱備用。

1.3.2 動(dòng)物分組及模型制備將60只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,每組10只。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后開(kāi)始制備UC模型。取250 mL TNBS(100 mg·kg-1)溶解到體積分?jǐn)?shù)50%乙醇中制備TNBS溶液。UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉,用2 mm硅膠導(dǎo)管插入小鼠肛門(mén)內(nèi)8 cm 處注入TNBS溶液,并提起小鼠尾巴,持續(xù)倒置2 min,第2天,小鼠出現(xiàn)糞便潛血、腹瀉、體質(zhì)量下降判定為造模成功[5]?？瞻讓?duì)照組小鼠經(jīng)肛門(mén)注射體積分?jǐn)?shù)50%乙醇。造模成功后,空白對(duì)照組、UC模型組小鼠每天經(jīng)口灌胃生理鹽水(10 mL·kg-1),山藥對(duì)照組小鼠每天經(jīng)口給予200 mg·kg-1無(wú)發(fā)酵山藥劑灌胃,低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組每天經(jīng)口分別給予50、100、200 mg·kg-1干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑灌胃,持續(xù)10 d。

1.3.3 觀察并記錄小鼠一般腸炎情況每天同一時(shí)間監(jiān)測(cè)小鼠體質(zhì)量,觀察小鼠黏液膿血便、腹瀉等情況。

1.3.4 組織取材各組小鼠于實(shí)驗(yàn)第11天用乙醚麻醉,開(kāi)腹,心臟取血,取結(jié)腸組織。觀察結(jié)腸組織水腫、出血、損傷程度,記錄結(jié)腸長(zhǎng)度和重量;取距離肛門(mén)1 cm腸組織,用磷酸鹽緩沖液(pH 7.4)洗3次,-70 ℃保存;剩余結(jié)腸組織于40 g·L-1多聚甲醛溶液中固定3 d,備用。

1.3.5 蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色觀察各組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)變化取固定后的結(jié)腸組織,乙醇脫水,再次經(jīng)乙醇、二甲苯脫水,石蠟包埋,5 μm 切片,行HE染色,在光學(xué)顯微鏡下觀察結(jié)腸組織的病理學(xué)變化。

1.3.6 紫外分光光度法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織中髓過(guò)氧化酶(myeloperoxidase,MPO)活性取-70 ℃冰箱保存的結(jié)腸組織,加入含體積分?jǐn)?shù)0.5%十六烷基三甲基溴化銨的磷酸鹽緩沖液50 mL,用手持式組織勻漿機(jī)每30 s勻漿1次,重復(fù)3次。勻漿后的結(jié)腸組織于-70 ℃條件下冷凍3 h,37 ℃下解凍,重復(fù)3次。組織勻漿液12 000×g離心15 min,取100 μL上清液,加入2.4 mL 60 mmol·L-1磷酸鹽緩沖液(pH 6.0),25 ℃下反應(yīng)10 min,加入500 μL疊氮化鈉(1.0 g·L-1)終止反應(yīng),應(yīng)用紫外分光光度計(jì)在460 nm處測(cè)定吸光度值計(jì)為OD1,1 min后再次測(cè)定計(jì)為OD2,持續(xù)5 min,計(jì)算MPO平均值[MPO平均=(ODn+1- ODn)× 稀釋倍數(shù)/結(jié)腸組織質(zhì)量]。

1.3.7 ELISA法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織中IL-8、TNF-α、HO-1和NF-κB的表達(dá)水平取1 mg結(jié)腸組織勻漿,生理鹽水稀釋10倍,應(yīng)用IL-8、TNF-α、HO-1、NF-κB ELISA試劑盒檢測(cè)HO-1、NF-κB、IL-8、TNF-α表達(dá)水平,嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行操作。

1.3.8 Western blot檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1和ZO-1蛋白表達(dá)取勻漿后的結(jié)腸組織2 mg,用蛋白定量試劑計(jì)算蛋白濃度;取50 μg蛋白,經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%聚丙烯酰胺凝膠電泳后,蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯膜,加claudin 1、ZO-1、GADPH一抗(滴度11 000),室溫下過(guò)夜,三氨基甲烷緩沖液洗滌 3次,加辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG 2 h,再用三氨基甲烷緩沖液洗滌3次,滴加增強(qiáng)電化學(xué)發(fā)光液,在曝光儀上顯影,以GADPH為內(nèi)參,使用Image J軟件對(duì)蛋白條帶灰度值進(jìn)行定量分析。以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3.9 細(xì)菌生理生化鑒定法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌和腸桿菌數(shù)量取小鼠結(jié)腸內(nèi)容物約0.5 g,用無(wú)菌生理鹽水稀釋至10、100、1 000倍,取100 μL原液和各稀釋液,使用菌株快速鑒定試劑盒對(duì)菌株進(jìn)行分離、篩選后,用全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定菌株,測(cè)定方法參照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)。鑒定后的雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌分別接種于選擇性培養(yǎng)基平板上,厭氧菌在厭氧恒溫培養(yǎng)箱、好氧菌在具有供養(yǎng)裝置的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h,用顯微鏡觀察生成菌落數(shù),計(jì)算各組菌株數(shù)和雙歧桿菌/腸桿菌(B/E)值。

1.3.10 氣相色譜法檢測(cè)各組小鼠結(jié)腸腸道中乙酸、丙酸和丁酸水平取1 g小鼠結(jié)腸內(nèi)容物,加入1 mL 體積分?jǐn)?shù) 10%的硫酸溶液進(jìn)行酸化,再加入5 mL 丙酮,震蕩,12 000×g離心5 min,取上清液,應(yīng)用氣相色譜法檢測(cè)腸道中乙酸、丙酸、丁酸水平,分析條件如下:載氣為流速0.75 mL·min-1的氦氣,進(jìn)樣器溫度為220 ℃,離子源和界面溫度為250 ℃。加熱箱初始溫度為90 ℃(2 min),溫度以每分鐘5 ℃升至 80 ℃,然后以每分鐘10 ℃升至200 ℃,最后以每分鐘20 ℃升至250 ℃。以乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,以標(biāo)準(zhǔn)曲線的濃度和峰面積計(jì)算樣品中乙酸、丙酸、丁酸水平,結(jié)果以μmol·g-1表示。

2 結(jié)果

2.1 干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑發(fā)酵前后菌數(shù)和pH值比較干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑溶解液初始、發(fā)酵第4 天pH值分別為5.9±0.1、3.7±0.1,初始pH值顯著高于發(fā)酵第4 天,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=66.000,P=0.000);干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑初始、發(fā)酵第4 天總菌數(shù)分別為(1.4±0.2)、(8.2±0.2) logCFU·mL-1,發(fā)酵第4 天總菌數(shù)較初始總菌數(shù)增長(zhǎng)了(17.8±0.7)倍,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=102.000,P=0.000)。

2.2 6組小鼠一般癥狀及結(jié)腸組織病理變化UC模型組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)多發(fā)小潰瘍、水腫、腸壁粘連及出血。山藥對(duì)照組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)部分水腫,中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸出現(xiàn)輕微水腫,高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組和空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸無(wú)水腫、潰瘍、血便、腹瀉等腸炎癥狀。UC模型組小鼠第2天出現(xiàn)腹瀉、血便、食欲下降等癥狀,毛發(fā)凌亂、呆滯、反應(yīng)遲鈍等反應(yīng)。山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠的癥狀在第3天出現(xiàn)好轉(zhuǎn);8 d后,小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化,毛發(fā)光澤度、大便情況、活躍度、飲食、精神狀態(tài)良好,與空白對(duì)照組小鼠比較無(wú)明顯差別。

2.3 6組小鼠結(jié)腸組織的長(zhǎng)度、厚度、重量比較結(jié)果見(jiàn)表1。UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸的長(zhǎng)度顯著短于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,結(jié)腸厚度顯著厚于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,結(jié)腸重量顯著大于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸的長(zhǎng)度、厚度、重量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸的長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,結(jié)腸厚度、重量顯著小于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。山藥對(duì)照組與中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸的長(zhǎng)度、厚度、重量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);UC模型組與低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸的長(zhǎng)度、厚度、重量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表1 6組小鼠結(jié)腸的長(zhǎng)度、厚度和重量比較Tab.1 Comparison of length,thickness and weight of colon of mice among the six groups

2.4 6組小鼠結(jié)腸組織病理變化結(jié)果見(jiàn)圖1。空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸黏膜上皮組織完整清晰,隱窩、杯狀細(xì)胞無(wú)損傷,無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),無(wú)潰瘍面。UC模型組小鼠結(jié)腸的隱窩、杯狀細(xì)胞丟失,大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),黏膜上皮組織完全損傷。山藥對(duì)照組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中仍有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和輕微潰瘍面,部分隱窩、杯狀細(xì)胞出現(xiàn)損傷,部分黏膜上皮組織損傷。低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn),隱窩、杯狀細(xì)胞清晰,黏膜及結(jié)腸組織結(jié)構(gòu)完整。

A:空白對(duì)照組(×40);B:UC模型組(×10);C:山藥對(duì)照組(×10);D:低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組(×10);E:中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組(×10);F:高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組(×20)。圖 1 6組小鼠結(jié)腸組織病理學(xué)(HE染色)Fig.1 Histopathology of colon tissues of mice in the six groups(HE staining)

2.5 6組小鼠結(jié)腸組織中IL-8、TNF-α、NF-κB、HO-1水平及MPO活性比較結(jié)果見(jiàn)表2。UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中IL-8、TNF-α、NF-κB、HO-1 水平及MPO活性顯著高于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中IL-8、TNF-α、NF-κB、HO-1水平及MPO活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中TNF-α、NF-κB、HO-1水平及MPO活性顯著低于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。山藥對(duì)照組與中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組及UC模型組與低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中IL-8、TNF-α、NF-κB、HO-1水平及MPO活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 6組小鼠結(jié)腸組織中IL-8、TNF-α、NF-κB、HO-1水平和MPO活性比較Tab.2 Comparison of the levels of IL-8,TNF-α,NF-κB,HO-1 and activity of MPO in colon tissues of mice among the six groups

2.6 6組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1和ZO-1蛋白表達(dá)水平比較結(jié)果見(jiàn)圖2和表3。UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著低于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。山藥對(duì)照組與中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組及UC模型組與低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1:空白對(duì)照組;2:UC模型組;3:山藥對(duì)照組;4:低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組;5:中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組;6:高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組。圖 2 6組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1和ZO-1蛋白表達(dá)Fig.2 Expressions of claudin 1 and ZO-1 protein in colon tissues of mice among the six groups

表3 6組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1和ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較Tab.3 Comparison of the relative expression of claudin 1 and ZO-1 protein in colon tissues of mice among the six group

2.7 6組小鼠結(jié)腸腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌數(shù)及B/E值比較結(jié)果見(jiàn)表4。UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)及B/E值顯著低于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,擬桿菌、腸桿菌數(shù)顯著高于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌數(shù)及B/E值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸腸道中乳酸桿菌數(shù)及B/E值顯著高于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,擬桿菌、腸桿菌數(shù)顯著低于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。山藥對(duì)照組與中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組及UC模型組與低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌數(shù)及B/E值比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表4 6組小鼠結(jié)腸腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌數(shù)及B/E值比較Tab.4 Comparison of the number of bifidobacterium,lactobacilli,bacteroides,enterobacteria and B/E value in intestinal tract of colon of mice among the six groups

2.8 6組小鼠結(jié)腸腸道中乙酸、丙酸及丁酸水平比較結(jié)果見(jiàn)表5。UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乙酸、丙酸、丁酸水平顯著低于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組與高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乙酸、丙酸、丁酸水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乙酸水平顯著高于UC模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中丙酸水平顯著高于UC模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中丁酸水平顯著高于UC模型組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乙酸、丙酸水平顯著高于低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。山藥對(duì)照組與中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乙酸、丙酸水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中丁酸水平顯著高于山藥對(duì)照組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表5 6組小鼠結(jié)腸腸道中乙酸、丙酸及丁酸水平比較Tab.5 Comparison of the levels of acetic acid,propionic acid and butyric acid in intestinal tract of colon of mice among the six groups

3 討論

有研究發(fā)現(xiàn),干酪乳桿菌可有效預(yù)防或治療腸道微生物群紊亂相關(guān)疾病,在食品發(fā)酵工程及生物醫(yī)藥領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注[9]。益生菌以山藥低聚糖作為碳源,分泌酸性化合物、細(xì)菌素、苯乳酸等多種抑菌活性物質(zhì),并促進(jìn)益生菌進(jìn)一步增殖。本研究首次利用干酪乳桿菌(SJP6841L2)制作干酪乳桿菌與山藥發(fā)酵混合劑,結(jié)果發(fā)現(xiàn),干酪乳桿菌與山藥發(fā)酵后,總菌數(shù)較初始總菌數(shù)增長(zhǎng)(17.8±0.7)倍,且微環(huán)境偏于酸性(pH 3.7),說(shuō)明山藥的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和酸性條件能夠促進(jìn)干酪乳桿菌生長(zhǎng)和增殖。有研究報(bào)道,干酪乳桿菌可產(chǎn)生有機(jī)酸物質(zhì),降低周圍環(huán)境的pH值,形成酸性微環(huán)境[10],這與本研究結(jié)果一致。

山藥含有豐富的多糖、皂苷類、氨基酸、維生素、脂肪酸等營(yíng)養(yǎng)成分,具有抗炎、調(diào)節(jié)免疫、降血糖、抗腫瘤、抗氧化、抑菌等多種生物學(xué)功能。而UC患者的腸道黏膜機(jī)械屏障受損、通透性增高、細(xì)胞微環(huán)境遭到破壞、黏膜缺血和缺氧,導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)成分吸收障礙、吸收不充分、營(yíng)養(yǎng)丟失。益生菌作為活性有益微生菌,對(duì)膽汁酸和低pH值環(huán)境具有耐受能力,可提高腸道細(xì)胞外消化能力、增加腸道吸收轉(zhuǎn)運(yùn)載體的表達(dá)及維持腸道黏膜屏障。此外,益生菌能增加絨毛高度、增加隱窩深度、降低上皮電阻,維護(hù)腸上皮結(jié)構(gòu)完整性,促進(jìn)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)吸收。本研究結(jié)果顯示,空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,結(jié)腸厚度顯著小于UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,結(jié)腸組織的重量顯著低于UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組;空白對(duì)照組與高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織的長(zhǎng)度、厚度、重量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度顯著長(zhǎng)于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,結(jié)腸厚度、重量顯著小于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組;山藥對(duì)照組與中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織的長(zhǎng)度、厚度、重量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;UC模型組與低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織的長(zhǎng)度、厚度、重量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果說(shuō)明,干酪乳桿菌-山藥發(fā)酵復(fù)合發(fā)酵劑能改善UC模型小鼠結(jié)腸組織損傷,且呈一定劑量關(guān)系。此外,本研究結(jié)果顯示,UC模型組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)多發(fā)小潰瘍、水腫、腸壁粘連及出血;山藥對(duì)照組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織出現(xiàn)部分水腫,中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠出現(xiàn)輕微水腫,高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組和正常組小鼠結(jié)腸組織無(wú)水腫、潰瘍,無(wú)血便、腹瀉等腸炎表現(xiàn)。UC模型組小鼠第2天出現(xiàn)腹瀉、血便、食欲下降等癥狀;山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠的癥狀在第3天出現(xiàn)好轉(zhuǎn),且8 d后小鼠體質(zhì)量無(wú)明顯變化,毛發(fā)光澤度、大便情況、活躍度、飲食、精神狀態(tài)良好;這說(shuō)明,干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑可改善UC模型小鼠的水腫、潰瘍、血便、腹瀉等腸炎表現(xiàn);推測(cè),干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑可能通過(guò)干酪乳桿菌自身生理代謝功效,形成酸性微環(huán)境、改善腸道黏膜屏障、恢復(fù)腸上皮結(jié)構(gòu)完整性,防止腸道內(nèi)山藥營(yíng)養(yǎng)成分流失,提高山藥藥理功效,促進(jìn)UC的改善。

UC主要發(fā)病機(jī)制為結(jié)腸組織的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),引起腸黏膜組織炎癥反應(yīng)。IL-8可在內(nèi)皮細(xì)胞受到炎癥刺激時(shí)發(fā)揮趨化作用,是潰瘍性結(jié)腸炎早期復(fù)發(fā)的生物標(biāo)志。TNF-α可導(dǎo)致腸道細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng),引起腸道組織損傷[11]。有研究報(bào)道,乳酸芽孢桿菌液處理的山藥可顯著抑制腸炎小鼠腸道組織中促炎因子TNF-α分泌[12]。本研究結(jié)果顯示,空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中IL-8、TNF-α水平及MPO活性顯著低于UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,空白對(duì)照組與高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中IL-8、TNF-α水平及MPO活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中IL-8、TNF-α水平及MPO活性顯著低于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,山藥對(duì)照組與中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組及UC模型組與低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中IL-8、TNF-α水平及MPO活性比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;這說(shuō)明,與單獨(dú)山藥干預(yù)比較,干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑可顯著抑制UC模型小鼠結(jié)腸組織中炎癥因子水平,從而減輕腸道炎癥反應(yīng),且呈一定量效關(guān)系。NF-κB是免疫調(diào)控中一個(gè)重要的信號(hào)傳導(dǎo)因子。UC發(fā)生時(shí)NF-κB被激活,然后通過(guò)信號(hào)通路促進(jìn)氧化應(yīng)激,并誘導(dǎo)應(yīng)激刺激相關(guān)因子如血紅素分解代謝過(guò)程中限速酶HO-1的分泌。本研究結(jié)果顯示,高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB和HO-1水平顯著低于UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組與空白對(duì)照組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB和HO-1水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB和HO-1水平顯著低于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,山藥對(duì)照組與中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組及UC模型組與低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中NF-κB和HO-1水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;這說(shuō)明,與單獨(dú)山藥干預(yù)比較,干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑能顯著降低UC模型小鼠的NF-κB和HO-1表達(dá),且呈一定量效關(guān)系,說(shuō)明其抗炎機(jī)制與NF-κB/HO-1信號(hào)通路有關(guān)[13]。此外,本研究結(jié)果顯示,空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,空白對(duì)照組與高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量顯著高于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,山藥對(duì)照組與中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組及UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠結(jié)腸組織中claudin 1、ZO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,說(shuō)明,干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑能顯著促進(jìn)UC模型小鼠腸道組織中ZO-1[14]和claudin 1[15]蛋白的表達(dá),降低腸黏膜通透性、維持腸上皮內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、有效保護(hù)腸黏膜屏障,從而修復(fù)腸道組織[16]。

腸道最重要的益生菌是雙歧桿菌和乳酸桿菌[17-18]。臨床研究發(fā)現(xiàn),UC患者腸道中雙歧桿菌和乳酸菌數(shù)量顯著少于健康人群,說(shuō)明腸道益生菌群失衡與UC具有重要關(guān)系[19]。有研究也證實(shí),補(bǔ)充雙歧桿菌可顯著降低中度活動(dòng)期潰瘍性腸炎老年患者結(jié)腸組織中IL-6、TNF-α表達(dá),說(shuō)明腸道內(nèi)有益菌增加可緩解或改善UC的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示,空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌數(shù)及B/E值顯著高于UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,擬桿菌、腸桿菌數(shù)顯著低于UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組;空白對(duì)照組與高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌數(shù)及B/E 值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乳酸桿菌數(shù)及B/E值顯著高于UC模型組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組,擬桿菌、腸桿菌數(shù)顯著低于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組;山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、腸桿菌數(shù)及B/E值比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;這說(shuō)明,干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑能顯著提高UC小鼠腸道中雙歧桿菌和乳酸桿菌,降低擬桿菌、腸桿菌數(shù),使其B/E值恢復(fù)到正常水平,從而調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。

益生菌通過(guò)代謝能合成多種生物酶和氨基酸等人體必需營(yíng)養(yǎng)元素,參與腸道中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[20-21]。本研究結(jié)果顯示,UC模型組、山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乙酸、丙酸、丁酸水平顯著低于空白對(duì)照組和高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組;空白對(duì)照組與高劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乙酸、丙酸、丁酸水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;山藥對(duì)照組、低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組、中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乙酸水平顯著高于UC模型組;山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中丙酸水平顯著高于UC模型組;中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中丁酸水平顯著高于UC模型組;山藥對(duì)照組和中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乙酸、丙酸水平顯著高于低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組;山藥對(duì)照組與中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中乙酸、丙酸水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;中劑量復(fù)合發(fā)酵劑組小鼠腸道中丁酸水平顯著高于山藥對(duì)照組和低劑量復(fù)合發(fā)酵劑組;這說(shuō)明,干酪乳桿菌-山藥復(fù)合發(fā)酵劑較單一山藥干預(yù)能更顯著地促進(jìn)乙酸、丙酸、丁酸等氨基酸分泌,調(diào)節(jié)腸道菌群。因此認(rèn)為,干酪乳桿菌SJP6841L2與山藥體外發(fā)酵,可促進(jìn)山藥的分解并提高營(yíng)養(yǎng)成分吸收,從而提高山藥膳食利用價(jià)值,但該作用機(jī)制有待進(jìn)一步深入探討。

總之,本研究制備的干酪乳桿菌與山藥發(fā)酵復(fù)合發(fā)酵劑,能顯著抑制腸道組織中IL-8、TNF-α表達(dá)及MPO活性,促進(jìn)腸道上調(diào)緊密連接蛋白表達(dá)及短鏈脂肪酸產(chǎn)生,調(diào)節(jié)UC腸道菌群平衡,從而達(dá)到改善UC的目的,這為制定根除治療UC的山藥營(yíng)養(yǎng)膳食策略提供依據(jù)。