林燕雯，張 玲，尹佳璇，潘繼紅,

（1. 山東第一醫(yī)科大學 生物醫(yī)學科學院暨山東省醫(yī)藥生物技術(shù)中心生物化學教研室，山東 濟南 250000；2. 山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院 類風濕關(guān)節(jié)炎科，山東 濟南 250000；3. 國家衛(wèi)健委生物醫(yī)藥重點實驗室，山東 濟南 250000；4. 山東省罕見病防治重點實驗室生物化學教研室，山東 濟南 250000）

類風濕關(guān)節(jié)炎（RA）是一種全身性自身免疫性疾病，導致嚴重的炎癥和骨骼組織的形態(tài)變化，包括骨骼和關(guān)節(jié)損傷、軟骨退化、滑膜增生、成纖維樣滑膜細胞向軟骨和骨表面浸潤、軟骨下骨侵蝕等，這些都是RA的病理標志[1]。全世界每200名成年人中大約1人受累，女性的發(fā)病率是男性的2～3 倍。主要發(fā)病年齡在50～59歲[1]。RA滑膜成纖維細胞（RASF）已成為RA發(fā)病機制中的關(guān)鍵參與者，具有轉(zhuǎn)化細胞的表型和分子特征。RASF能分泌細胞因子、趨化因子和關(guān)節(jié)損傷酶，從而促成RA的炎癥狀態(tài)和關(guān)節(jié)損傷。RASF具有的凋亡抗性及對巨噬細胞和淋巴細胞等炎癥細胞的招募是RA關(guān)節(jié)滑膜組織過度增生的主要原因。此外，RASF具有侵襲性和遷移性，可導致疾病傳播到未受影響的關(guān)節(jié)。

盡管進行了廣泛的研究工作，但RA的病因尚未確定，發(fā)病機制復雜。目前的治療方法在控制癥狀方面大多有效，但部分患者仍對多種治療方法，包括抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）治療無效。因此，對現(xiàn)有治療方案的醫(yī)療需求尚未得到滿足，仍缺乏理想的治療藥物和治療策略。最近研究表明小分子藥物尋找新藥靶可能為RA治療提供新方法[2-4]。

CPI-203是一種強效的BET bromodomain抑制劑，也是一種新型的細胞滲透性小分子藥物，在口服給藥時顯示出良好的生物利用度。已有研究報道表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白的小分子抑制劑可阻斷與類風濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的致病機制，具有分子量小且毒性低等優(yōu)點[5-6]。近期小分子藥物通過保護藥物靶點從而發(fā)揮治療或緩解疾病研究仍被持續(xù)關(guān)注[2-4]，然而CPI-203在 RASF中存在的其他潛在藥物靶點仍未可知，有被進一步開發(fā)為新的、安全的藥物，以在功能上治愈RA的潛力。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Eclipse E100 顯微鏡（日本尼康）；SpectraMax iD3酶標儀（Molecular Devices）；20R低溫高速離心機（德國Backman）；Quantum GX Micro-CT（日本Perkin Elmer）；iCAN細胞培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific）；1384超凈工作臺（Thermo）；Light Cycler 480熒光定量檢測儀（瑞士Roche）；SDS-PAGE電泳儀（美國Bio-Rad公司）；HH-1水浴鍋（常州國華）；ECL Plus檢測系統(tǒng)（美國Thermo Scientific）。

1.2 試劑

DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibico）；胎牛血清（美國Gibico）；青霉素鏈霉素雙抗（美國Gibico）；PBS（美國Gibico）；EDTA-胰酶（美國Gibico）；Ⅱ型膠原酶（索萊寶）；Ⅲ型膠原酶（索萊寶）；二甲基亞砜（索萊寶）；IL-1β（Abbkine）；TRIzol（諾唯贊）；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（諾唯贊）；SYBR Mixture（康維公司）；4 %組織細胞固定液（索萊寶）；結(jié)晶紫/龍膽紫混合染色液（索萊寶）；小室（BD）；基質(zhì)膠（Corning）；ELISA試劑盒（聯(lián)科生物）；引物（華大基因）；CPI-203（Selleck生物公司）；Bradford蛋白濃度測量試劑盒（碧云天）。

1.3 動物

雄性DBA 1/J小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，8周齡，20～25 g。小鼠飼養(yǎng)于山東第一醫(yī)科大學生物醫(yī)學科學學院SPF級動物房，符合山東第一醫(yī)科大學動物飼養(yǎng)及管理條例。所有動物實驗和流程嚴格按照山東第一醫(yī)科大學實驗動物條例進行。

1.4 細胞

從RA患者中收集滑膜組織在膝關(guān)節(jié)置換手術(shù)期間（n=14，男性5例，女性9例，年齡35～75歲，平均年齡53歲）。患者均符合 1987 年美國風濕病學會修訂的類風濕關(guān)節(jié)炎診斷標準。獲得每位患者的書面知情同意書及委員會批準（批準號：2019-02）。將滑膜組織浸泡在生理鹽水中，使用II型和III型膠原酶消化6～8 h，于37 ℃，含5 % CO2細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h等待成纖維樣細胞貼壁。提取的細胞在含10 % 胎牛血清和1 %雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中進行培養(yǎng)并傳代，傳代至5～7代使用。

1.5 軟件

GraphPad Prism 9軟件包。

2 方法

2.1 RASF細胞增殖-毒性檢測

取4×104個細胞/ml的RASF 9.6 ml接種于96孔板，于細胞孵箱培養(yǎng)12 h，待貼壁后設(shè)置分組為空白組、細胞未處理組、DMSO組、CPI-20（0.5，1，2，5 μmol/L）組，每組設(shè)4個重復孔，給藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。向每孔加入 10 μl CCK-8溶液，孵育 1 h后用酶標儀測定450 nm處吸光度。計算細胞增殖率和半數(shù)抑制濃度。增殖率（%）=（加藥孔OD值-空白孔OD值）/（未加藥孔OD值-空白孔OD值）×100。

2.2 RASF侵襲、遷移、血管形成數(shù)測算

2.2.1 實驗分組及處理 取5.6×105個細胞/ml的RASF 4 ml，接種于12孔板，設(shè)置分組為正常對照組、IL-1β（10 ng/ml）誘導組、CPI-203（1 μmol/L）用藥組（有或無IL-1β 誘導），用藥組以1 μmol/L CPI-203處理24 h，IL-1β 刺激 12 h，每組設(shè)3個重復孔。

2.2.2 RASF侵襲數(shù)測算 在Transwell上室每個室中加入100 μl稀釋后的基質(zhì)膠，于細胞孵箱中靜置1 h。RASF按2.2.1項下方法處理后，按4×104個細胞/ml接種于Transwell上室（其中加入含2 % 胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)基），待細胞貼壁后，在下室添加含15 % 胎牛血清的完全培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)過夜后，將侵襲到下表面的細胞進行染色并計數(shù)，每個分組包括3個重復視圖，并計算侵襲細胞的平均數(shù)量。

2.2.3 RASF遷移數(shù)測算 按2.2.1項下方法進行實驗分組和細胞處理，用無血清無抗生素的培養(yǎng)基換液并進行劃痕，拍攝0 h和12 h細胞遷移圖片并使用 Image-J計算培養(yǎng)0 h和12 h細胞劃痕面積。創(chuàng)傷愈合率（%）=（12 h細胞劃痕面積-0 h細胞劃痕面積）/0 h細胞劃痕面積×100。

2.2.4 體外血管形成能力評估 按2.2.1項下方法進行實驗分組和細胞處理，用無血無抗培養(yǎng)基按1:3比例稀釋基質(zhì)膠，于48孔板鋪稀釋好基質(zhì)膠50 μl，置于37 ℃孵箱靜止1 h后，分別取各處理組細胞上清，按每孔105個細胞重懸后，加入鋪好基質(zhì)膠的培養(yǎng)板，于孵箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h后鏡下觀察拍攝成管情況，使用Image-J計算管形成數(shù)。

2.3 RASF中IL-6、IL-8、MMP-1/3、TIMP-3、VEGF mRNA的檢測

采用qRT-PCR方法。取5.6×105個/ml的RASF 4 ml，接種于12孔板，設(shè)置分組為正常對照組、IL-1β（10 ng/ml）誘導組、CPI-203（1 μmol/L）用藥組（有或無IL-1β誘導），用藥組以1 μmol/L CPI-203處理24 h，IL-1β刺激12 h，每組設(shè)3個重復孔。按試劑盒使用說明書，使用TRIzol試劑從培養(yǎng)的細胞中提取總RNA，再經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用Light Cycler 480進行qRT-PCR。實驗重復3 次，采用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4 RASF上清中IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3、TIMP-3水平的檢測

采用ELISA法。取5.6×105個/ml的RASF 4 ml接種于12孔板，設(shè)置分組為正常對照組、IL-1β（10 ng/ml）誘導組、CPI-203（1 μmol/L）用藥組（有或無IL-1β誘導），用藥組以1 μmol/L CPI-203處理24 h，IL-1β刺激12 h，每組設(shè)3個重復孔。培養(yǎng)36 h后，收集上清，用ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3、TIMP-3分泌水平。

2.5 RASF中p-p38、p-AKT表達水平的檢測

采用Western blot法。取8.8×105個細胞/ml的RASF4 ml接種于6孔板，設(shè)置分組為正常對照組、IL-1β（10 ng/ml）誘導組、CPI-203（1 μmol/L）用藥組（有或無IL-1β誘導），用藥組以1 μmol/L CPI-203處理24 h，IL-1β刺激12 h，每組設(shè)3個重復孔。培養(yǎng)48 h后，收集細胞提取蛋白，用Bradford蛋白濃度測量試劑盒檢測蛋白濃度。經(jīng)100 ℃，7 min變性后進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，并將蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用5 %脫脂奶粉封閉1 h ，再用p-p38、p-AKT、p-38、AKT和β-tubulin 抗體過夜孵育，Tris-HCl 緩沖鹽溶液+Tween 20 （TBST）洗3遍后與二抗共孵育1.5 h。再用TBST洗3遍后使用ECL Plus檢測系統(tǒng)進行檢測。

2.6 CIA小鼠模型構(gòu)建

2.6.1 模型構(gòu)建 DBA 1/J雄性小鼠尾根部注射2 mg/ml牛II型膠原和完全弗氏佐劑1:1乳化劑200 μl，后正常飼養(yǎng)，21 d后小鼠尾根部二次免疫注射牛II型膠原和不完全弗氏佐劑1:1乳化劑200 μl。每天對小鼠進行一次關(guān)節(jié)炎癥狀監(jiān)測，待鼠爪腫脹完全，提示CIA模型建立成功。

2.6.2 分組及給藥 將18只DBA 1/J雄性小鼠隨機均分為正常對照組、誘導組、CPI-203用藥組。CPI-203用藥組構(gòu)建CIA模型后，第一次注射膠原和弗氏完全佐劑混合乳化劑后第 50 天即小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)病高峰時，腹腔注射CPI-203 30 d（200 mg/kg），每兩天注射1次，觀察并記錄小鼠鼠爪炎癥緩解情況。正常對照組不構(gòu)建CIA模型。誘導組構(gòu)建CIA模型后，腹腔注射等量DMSO。

2.7 小鼠血清中炎性因子水平測定

CPI-203治療30 d后，取小鼠血清，離心去除微粒后，按ELISA試劑盒操作步驟檢測血清中IL-6、IL-8水平。

2.8 Micro-CT 成像和蘇木精-伊紅（HE）染色

對鼠爪進行Micro-CT掃描，并對掃描結(jié)果進行二次重建分析小鼠骨關(guān)節(jié)的微觀結(jié)構(gòu)。后將鼠爪在10 %組織固定液中固定24 h，并在15 %乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣。然后將鼠爪包埋于石蠟中，并從鼠爪矢狀面以5 μm厚度連續(xù)切片，切片用HE染色。

2.9 統(tǒng)計學方法

使用GraphPad Prism 9軟件包對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計。數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，檢驗采用Shapiro-Wilk方法，符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，兩組均值比較采用t檢驗，多組間均值比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。檢驗水準=0.05（雙側(cè)），P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 CPI-203抑制RASF增殖

用藥組細胞增殖率隨藥物濃度增加而減少，表明CPI-203對細胞增殖有較好的抑制作用，且作用呈濃度依賴性。CPI-203的IC50值為1.18±0.19 μmol/L，確定后續(xù)給藥濃度為 1 μmol/L。

3.2 CPI-203降低IL-1β誘導的RASF侵襲、遷移、血管形成數(shù)

正常對照組、I L-1 β 誘導組、C P I-2 0 3（1 μmol/L）用藥組、CPI-203+IL-1β組細胞侵襲數(shù)目分別為（84.60±2.966），（63.80±1.643），（134.6±3.362），（75.60±4.393）個。與正常對照組相比，IL-1β誘導組侵襲細胞數(shù)目增多（P＜0.001）；且CPI-203可降低IL-1β誘導的RASF侵襲數(shù)目增多（P＜0.001），見圖1A。各組遷移細胞創(chuàng)傷愈合結(jié)果見圖1B。與IL-1β誘導組比較，CPI-203+IL-1β組細胞的遷移能力下降（P＜0.001）。正常對照組血管形成數(shù)為（82.67±8.021），IL-1β誘導組血管形成數(shù)為（171.3±3.05），CPI-203（1 μmol/L）用藥組血管形成數(shù)為（53.67±12.86），CPI-203+IL-1β組血管形成數(shù)為（133.7±10.07）。與IL-1β誘導組相比，CPI-203+IL-1β組血管形成數(shù)減少（P＜0.005），見圖1C。

圖1 CPI-203對RASF侵襲（A）、遷移（B）、血管形成數(shù)（C）的影響（n=3）

3.3 CPI-203作用后逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導的IL-6、IL-8、MMP-1/3、CCL-2、VEGF的mRNA表達及TIMP-1/3的抑制

與正常對照組相比，CPI-203對RASF中炎癥介質(zhì)因子IL-6、IL-8、MMP-1/3、VEGF的表達具有顯著抑制作用（P均＜0.03），同時誘導了TIMP-1/3的表達（P＜0.0007）。不同處理組 IL-6、IL-8、MMP-1/3、TIMP-1/3、CCL-2、VEGF表達水平見圖2。

3.4 CPI-203作用后RASF上清中IL-6、IL-8、MMP-1/3、TIMP-3的分泌水平變化

結(jié)果見圖3。由圖3可見，CPI-203降低IL-1β誘導的IL-6、IL-8、MMP-1/3表達（P均＜0.001），同時逆轉(zhuǎn)IL-1β誘導的TIMP-3的抑制（P＜0.001）。

3.5 CPI-203對CIA模型小鼠關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的影響

結(jié)果見圖4。由圖4可見，與DMSO處理的小鼠相比，CPI-203處理的小鼠表現(xiàn)出明顯改善，關(guān)節(jié)炎評分明顯降低。鼠爪厚度和腫脹程度、受累關(guān)節(jié)的組織學及影像學分析顯示滑膜增生、軟骨降解和骨破壞減少。與陽性對照組相比，實驗組小鼠血清IL-6、IL-8蛋白水平降低（P＜0.001），差異有高度統(tǒng)計學意義。以上結(jié)果表明，CPI-203可改善CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展。

圖4 CPI-203對CIA小鼠關(guān)節(jié)炎的影響（n=6）

3.6 CPI-203對IL-1β誘導的MAPK、AKT通路的影響

p38 MAPK及AKT通路激活后轉(zhuǎn)錄因子p-p38和p-akt在炎癥方面發(fā)揮重要作用。Western blot結(jié)果顯示CPI-203顯著抑制IL-1β誘導的p-p38和p-akt磷酸化水平，表明CPI-203對炎癥具有抑制作用，這與細胞及小鼠血清中炎癥因子水平變化的結(jié)果一致。

圖5 CPI-203 對 MAPK、AKT 通路的影響（n=3）

4 討論與結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)CPI-203可抑制RASF的炎癥、基質(zhì)降解、增殖和趨化因子表達，表明在RA中CPI-203的治療潛力。體外研究結(jié)果表明，CPI-203可在體外抑制RA的促炎因子表達、侵襲、遷移和血管生成行為。體內(nèi)研究表明，經(jīng)CPI-203治療的小鼠的關(guān)節(jié)腫脹、炎癥和滑膜增生、骨侵蝕及骨降解明顯少于未治療的陽性對照組動物。

本項研究仍有一些局限性。文中僅分析了CPI-203治療過程中MAPK和AKT信號通路的變化。推測可能有其他重要通路可調(diào)節(jié)這一過程。因此，計劃在未來使用高通量測序等方法研究其他潛在的關(guān)鍵通路和藥物靶點，以冀為小分子抑制劑的發(fā)展和應用做出貢獻。