張朝暉, 李振守, 李慧芳, 胡小芳, 郭春輝, 姚潤(rùn)娟, 李俊曉

1.平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院,河南 平頂山 467000; 2. 鄭州市婦幼保健院,河南 鄭州 450000

尖銳濕疣是一種最常見的性傳播疾病,也是一種發(fā)生在生殖道的良性腫瘤,由人乳頭瘤病毒(human papillomavirus,HPV)感染引起[1]。尖銳濕疣患者病情進(jìn)展通常較快、傳染能力較強(qiáng),盡管其治療并不十分困難,但因復(fù)發(fā)率較高,常對(duì)患者身心健康造成嚴(yán)重影響[2]。尖銳濕疣的發(fā)生不僅與HPV感染有關(guān),而且與免疫失衡、基因表達(dá)失調(diào)等有關(guān),尖銳濕疣患者機(jī)體內(nèi)的免疫系統(tǒng)受到嚴(yán)重抑制,尤其是細(xì)胞免疫功能低下使得HPV感染機(jī)體后在人體內(nèi)大量且長(zhǎng)期持續(xù)復(fù)制[3]。miR-34a-5p是一種具有抑癌基因作用的miRNA,在多種疾病中較正常組織低表達(dá),且與HPV感染的宮頸癌密切相關(guān)[4]。JAG1是Notch信號(hào)通路中重要的配體,與受體結(jié)合后可激活相應(yīng)信號(hào)通路,通過調(diào)節(jié)下游效應(yīng)物影響細(xì)胞的病理和生理過程[5]。而Notch信號(hào)通路是一種與免疫炎癥密切相關(guān)的信號(hào)通路,其異常激活與免疫疾病有重要聯(lián)系[6]。因此,本研究分析miR-34a-5p、JAG1 mRNA在尖銳濕疣患者組織中的表達(dá)情況及其與預(yù)后、HPV分型的關(guān)系,以期為臨床治療提供思路。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年3月—2022年3月本院治療的101例尖銳濕疣患者,其中男59例,女42例;年齡30～64歲,平均(43.79±10.15)歲;疣體位于生殖器40例、肛周29例、會(huì)陰18例、混合14例;病灶面積均為1～3 cm2。同期選取98例行包皮環(huán)切術(shù)或外陰整形術(shù)的患者作為對(duì)照組,其中男50例,女48例;年齡31～64歲,平均(44.19±10.28)歲;HPV陽性6例,均為低危型。兩組性別(2=1.10,P=0.295)、年齡(t=0.28,P=0.783)比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

尖銳濕疣組納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)皮膚性病學(xué)分會(huì)制定的《中國(guó)尖銳濕疣臨床診療指南(2021完整版)》[7];②HPV陽性;③病歷資料均齊全。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前行醋酸白試驗(yàn)篩查后未發(fā)現(xiàn)異常;②無配偶發(fā)病史或不潔性交史,無尖銳濕疣發(fā)病史及生殖器皰疹等;③病歷資料均齊全。

兩組排除標(biāo)準(zhǔn)：①哺乳期或妊娠期女性;②扁平疣、假性濕疣等其他疣患者;③4周內(nèi)接受過物理或藥物治療者;④有其他病毒或病原菌感染、腫瘤、糖尿病等影響免疫系統(tǒng)疾病者。

本研究患者均由主治醫(yī)師明確診斷,試驗(yàn)經(jīng)研究對(duì)象本人同意及本院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)20190213)。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol試劑(南京森貝伽生物科技有限公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司);HPV基因分型檢測(cè)試劑盒(上海羽哚生物科技有限公司)。ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)擴(kuò)增儀(美國(guó)ABI公司)。

1.3 方法

1.3.1 臨床資料收集 收集并記錄尖銳濕疣患者疣體直徑、病程、疣體數(shù)目等資料。

1.3.2 樣品采集及保存 尖銳濕疣組收集患者治療時(shí)留存的典型皮損組織,對(duì)照組收集女性行外陰整形手術(shù)切下的外陰組織或男性行包皮環(huán)切手術(shù)切下的正常包皮組織,將采集組織保存于無菌管中,置于-80 ℃超低溫冰箱保存待測(cè)。

1.3.3 組織miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平檢測(cè) 將組織研磨后采用Trizol試劑提取總RNA,檢測(cè)其完整性及純度后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,采用qRT-PCR方法檢測(cè)miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平。引物由上海生工生物有限公司合成(表1)。參數(shù)設(shè)置：95 ℃預(yù)變性1 min;95 ℃變性30 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,共40個(gè)循環(huán)。所有樣品均重復(fù)3次,反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-34a-5p、JAG1相對(duì)表達(dá)量,二者分別以U6、GAPDH作為內(nèi)參基因。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences

1.3.4 HPV基因分型檢測(cè) 采用HPV基因分型檢測(cè)試劑盒對(duì)6種低危型(包括HPV6、11、42、43、44、81)和15種高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68)進(jìn)行檢測(cè),按照試劑盒說明操作。

1.3.5 隨訪 尖銳濕疣患者采用微波聯(lián)合外用藥物治療,治療后定期復(fù)查,隨訪觀察6個(gè)月,期間若出現(xiàn)醋酸白試驗(yàn)陽性亞臨床感染病灶或出現(xiàn)新病灶,則屬于尖銳濕疣復(fù)發(fā)。根據(jù)6個(gè)月后是否復(fù)發(fā)分為復(fù)發(fā)組和未復(fù)發(fā)組。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

利用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料均符合正態(tài)分布,以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。尖銳濕疣組與對(duì)照組、不同HPV分型患者、不同預(yù)后患者組織中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平的比較行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析,進(jìn)一步組間比較行SNK-q檢驗(yàn);不同年齡、性別、疣體直徑、病程、疣體數(shù)目患者中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平的比較采用t檢驗(yàn);采用Pearson法分析患者組織miR-34a-5p與JAG1 mRNA水平的相關(guān)性;采用受試者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲線分析miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平對(duì)尖銳濕疣患者復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值,采用Z檢驗(yàn)比較AUC,以約登指數(shù)(靈敏度+特異性-1)的最大值為最佳截?cái)嘀?。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尖銳濕疣組與對(duì)照組組織miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比較

qRT-PCR結(jié)果顯示,尖銳濕疣組miR-34a-5p水平顯著低于對(duì)照組,JAG1 mRNA水平顯著高于對(duì)照組(P<0.05,圖1,表2)。

圖1 qRT-PCR檢測(cè) JAG1、miR-34a-5p的表達(dá)Figure 1 Expression of JAG1 and miR-34a-5p.

表2 尖銳濕疣組與對(duì)照組組織miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比較 (mean±SD)Table 2 Comparison of miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels between condyloma acuminatum group and the controls (mean±SD)

2.2 尖銳濕疣患者組織miR-34a-5p與JAG1 mRNA水平的相關(guān)性

Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示,尖銳濕疣患者組織miR-34a-5p與JAG1 mRNA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.67,P<0.05,圖2)。

圖2 尖銳濕疣患者組織miR-34a-5p與JAG1 mRNA水平的相關(guān)性Figure 2 Correlation between miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels in condyloma acuminatum.

2.3 尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系

經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),不同年齡、性別、病程、疣體數(shù)目的尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);與疣體直徑<10 mm患者比較,疣體直徑≥10 mm的尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p水平顯著降低,JAG1 mRNA水平增高(P<0.05,表3)。

表3 尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平與臨床病理參數(shù)的關(guān)系 (mean±SD)Table 3 Relationship between miR-34a-5p, JAG1 mRNA levels and clinicopathological parameters in condyloma acuminatum (mean±SD)

2.4 不同HPV分型尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比較

經(jīng)比較發(fā)現(xiàn),與高危型和低危型患者比較,混合型尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p水平顯著降低,JAG1 mRNA水平顯著升高(P<0.05)。高危型尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p水平顯著低于低危型患者,JAG1 mRNA水平顯著高于低危型患者(P<0.05,表4)。

表4 不同HPV分型尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比較 (mean±SD)Table 4 Comparison of miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels in condyloma acuminatum with different subtypes of HPV (mean±SD)

2.5 不同預(yù)后尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比較

治療后6個(gè)月,32例復(fù)發(fā),69例未復(fù)發(fā)。復(fù)發(fā)組miR-34a-5p水平顯著低于未復(fù)發(fā)組,JAG1 mRNA水平顯著高于未復(fù)發(fā)組(均P<0.05,表5)。

表5 不同預(yù)后尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平比較 (mean±SD)Table 5 Comparison of miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels in condyloma acuminatum with different prognosis (mean±SD)

2.6 miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平對(duì)尖銳濕疣患者復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值

以miR-34a-5p、JAG1 mRNA及二者聯(lián)合(串聯(lián)法)預(yù)測(cè)概率值為檢驗(yàn)變量,將尖銳濕疣是否復(fù)發(fā)作為狀態(tài)變量,繪制ROC曲線,結(jié)果顯示,miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平及二者聯(lián)合預(yù)測(cè)尖銳濕疣患者復(fù)發(fā)的AUC分別為0.767、0.821、0.891,二者聯(lián)合預(yù)測(cè)AUC顯著高于單獨(dú)預(yù)測(cè)AUC(Z=3.44、1.94,P<0.05,圖3、表6)。

圖3 miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平預(yù)測(cè)尖銳濕疣患者復(fù)發(fā)的ROC曲線Figure 3 The ROC curve of miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels for predicting recurrence of condyloma acuminatum.

表6 miR-34a-5p、JAG1 mRNA水平對(duì)尖銳濕疣患者復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值Table 6 The predictive value of miR-34a-5p and JAG1 mRNA levels for the recurrence of condyloma acuminatum

3 討論

尖銳濕疣的主要癥狀是疼痛、瘙癢、陰道分泌物增多和出血,但許多病例無癥狀[8-9]。尖銳濕疣主要通過性接觸、母嬰傳播或日常間接感染等傳播,其發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)歸等均與機(jī)體免疫系統(tǒng)功能變化有關(guān)[10-11]。因此,探討與免疫炎癥相關(guān)因子的表達(dá)變化可能對(duì)改善尖銳濕疣治療效果有重要作用。

miRNA可以通過與目標(biāo)基因mRNA的互補(bǔ)配對(duì)在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)節(jié)基因,從而抑制mRNA的翻譯或降解[12-13]。研究顯示,miR-34a-5p表達(dá)與宮頸癌臨床病理參數(shù)、HPV感染及生存結(jié)局有關(guān)[14-15]。Notch信號(hào)通路活性及受體和配體的表達(dá)與多種病理生理過程密切相關(guān),其中JAG1激活Notch1信號(hào)通路在整個(gè)信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[16]。JAG1與HPV之間存在復(fù)雜的協(xié)同作用[17]。miR-34a-5p可抑制細(xì)胞發(fā)育,并通過靶向HPV感染角質(zhì)形成細(xì)胞中JAG1的表達(dá)來調(diào)節(jié)Notch1通路的活性[18]。

本研究結(jié)果顯示,尖銳濕疣患者皮損組織中miR-34a-5p低表達(dá)、JAG1 mRNA高表達(dá),在混合型和高危型HPV感染患者中miR-34a-5p低表達(dá)、JAG1 mRNA高表達(dá),二者表達(dá)呈負(fù)相關(guān),與孔玉龍等[19]研究結(jié)論部分一致。推測(cè)miR-34a-5p可能通過與基因JAG1靶向結(jié)合,負(fù)調(diào)控JAG1使其表達(dá)升高,進(jìn)而影響Notch信號(hào)通路的信號(hào)傳導(dǎo),進(jìn)一步參與尖銳濕疣病情進(jìn)展。本研究推測(cè)與Gao等[18]研究結(jié)論基本一致,但其具體作用機(jī)制有待證實(shí)。

疣體直徑≥10 mm的尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p水平較低、JAG1 mRNA水平較高,提示miR-34a-5p、JAG1 mRNA與尖銳濕疣的疾病進(jìn)展有關(guān),miR-34a-5p水平越低、JAG1 mRNA水平越高的患者,疣體直徑可能越大。此外,尖銳濕疣復(fù)發(fā)患者中miR-34a-5p降低,JAG1 mRNA水平升高,且ROC曲線顯示二者聯(lián)合對(duì)尖銳濕疣復(fù)發(fā)有較高預(yù)測(cè)效能,當(dāng)miR-34a-5p水平低于0.57,JAG1 mRNA水平高于2.03時(shí),復(fù)發(fā)概率較高,提示臨床可通過檢測(cè)皮損組織中二者表達(dá)水平來輔助預(yù)測(cè)預(yù)后。

綜上所述,本研究顯示,尖銳濕疣患者組織中miR-34a-5p表達(dá)水平降低,JAG1 mRNA表達(dá)水平升高,且混合型HPV感染患者中miR-34a-5p水平低于高危型和低危型患者,JAG1 mRNA水平高于高危型和低危型患者。miR-34a-5p、JAG1 mRNA均與HPV分型有關(guān),兩者聯(lián)合檢測(cè)更有利于尖銳濕疣患者復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)。但本研究未能檢測(cè)尖銳濕疣患者血清中miR-34a-5p、JAG1 mRNA表達(dá)情況,且研究樣本量相對(duì)較少,后期需增大樣本量、增加檢測(cè)樣本種類進(jìn)一步探究二者的預(yù)測(cè)價(jià)值。