孟聰聰 張艷凱 于利利 馬 華 趙 瑞 程立鵬 張偉亞

Krüppel樣因子5(KLF5)屬于一類鋅指蛋白轉(zhuǎn)錄因子,屬于KLF家族成員之一,KLF5因子參與多種腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為,如增殖、分化、凋亡,且在多種組織中均有不同程度的表達(dá),如前列腺癌[1]、結(jié)腸癌[2]以及胰腺癌[3]等。具有PDZ結(jié)合域的轉(zhuǎn)錄共激活因子(TAZ)屬于一類14-3-3結(jié)合蛋白,可參與細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等多種生物學(xué)行為。研究發(fā)現(xiàn)[4],KLF5可介導(dǎo)Hippo信號通路與TAZ因子相互作用,進(jìn)而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展,進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)TAZ其中WW結(jié)構(gòu)域可與KLF5的PY序列結(jié)合,可預(yù)防KLF5被泛素化降解,此項(xiàng)研究進(jìn)一步表明KLF5與TAZ之間可能存在協(xié)同作用共同參與腫瘤進(jìn)展。UHRF1為一類核蛋白基因,且與細(xì)胞生長、細(xì)胞周期關(guān)系密切。研究稱[5],UHRF1在細(xì)胞增殖及細(xì)胞周期G1-S期轉(zhuǎn)換過程中具有關(guān)鍵作用。且UHRF1在多種腫瘤組織中均有表達(dá),如宮頸癌[6]、乳腺癌[7]以及胰腺癌[8]等。由此,研究KLF5、TAZ以及UHRF1在腫瘤疾病中的作用具有重要的研究價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選取2018年6月至2021年6月在我院就診的甲狀腺乳頭癌患者150例,所有研究對象均同意術(shù)中留取病灶組織標(biāo)本以及配對的癌旁組織標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn):①均經(jīng)過病理診斷確診為甲狀腺乳頭癌;②均為首次進(jìn)行手術(shù)治療;③以往均未進(jìn)行放化療及內(nèi)分泌治療。排除標(biāo)準(zhǔn):①心、肺、腎等重要臟器功能異常者;②長期采用免疫抑制劑治療者;③既往合并感染類疾病者;④合并其他臟器惡性腫瘤的患者。

甲狀腺乳頭癌(n=150):其中男性56例,女性94例,年齡(45.8±5.7)歲,臨床分期:Ⅰ期40例,Ⅱ期55例,Ⅲ期37例,Ⅳ期18例,平均腫塊大小(1.08±0.72)cm,淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移71例,多灶性52例,甲狀腺外侵犯73例。研究對象均已簽署知情同意書,且本研究已獲得我院倫理委員會的批準(zhǔn)。

1.2 免疫組織化學(xué)方法

獲取上述甲狀腺乳頭癌組織標(biāo)本及癌旁組織標(biāo)本,石蠟切片,脫蠟、水化,PBS溶液修復(fù)抗原,冷卻40 min后,采用H2O2溶液孵育,10 min后,阻斷過氧化物酶活性,山羊血清封閉結(jié)合,再分別將兔抗KLF5、TAZ、UHRF1抗體加入切片,于4 ℃環(huán)境過夜,PBS清洗,再滴加二抗抗體,孵育20 min,滴加辣根過氧化物的鏈霉卵白素溶液進(jìn)行孵育,20 min后,加DAB溶液顯色,再加入蘇木精溶液復(fù)染,不同梯度乙醇溶液脫水,二甲苯榮毅仁透明,中性樹膠溶液封片處理。

判定標(biāo)準(zhǔn)[9]:(1)細(xì)胞顯色劑深淺評分:0分為無染色;1分為淡黃色;2分為棕黃色;3分為棕褐色。(2)顯色細(xì)胞的百分率評分:隨機(jī)選取100個細(xì)胞,細(xì)胞陽性率<5%表示0分;細(xì)胞陽性率在5%～25%表示1分;細(xì)胞陽性率在26%～50%表示2分;細(xì)胞陽性率>50%表示3分。將細(xì)胞顯色劑深淺評分和顯色細(xì)胞的百分率評分相加,0分記為陰性;≥1分記為陽性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 25.0軟件統(tǒng)計分析,KLF5、TAZ、UHRF1蛋白陽性表達(dá)率均以%表示,組間比較進(jìn)行χ2檢驗(yàn),P<0.05表示組間存在意義。Pearson相關(guān)性分析KLF5、TAZ、UHRF1蛋白表達(dá)的關(guān)系,并進(jìn)行Kappa檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 KLF5、TAZ、UHRF1在甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁組織的表達(dá)

甲狀腺乳頭狀癌組織中KLF5、TAZ、UHRF1蛋白陽性表達(dá)率(75.33%、70.00%、64.00%)均高于癌旁組織,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 KLF5、TAZ、UHRF1在甲狀腺乳頭狀癌組織及癌旁組織中的表達(dá)(例,%)

2.2 KLF5、TAZ、UHRF1表達(dá)與甲狀腺乳頭癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系

不同臨床分期、腫瘤組織大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯的KLF5、TAZ、UHRF1表達(dá)比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),不同年齡、性別以及有無多灶性的KLF5、TAZ、UHRF1表達(dá)比較,差異均不存在統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 甲狀腺乳頭癌組織中KLF5、TAZ、UHRF1表達(dá)相關(guān)性

KLF5蛋白表達(dá)分別與TAZ、UHRF1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.594,0.491,P均<0.05),TAZ蛋白表達(dá)與UHRF1蛋白表達(dá)呈正相關(guān)(γ=0.486,P<0.05)。

3 討論

KLF5因子包括兩個結(jié)構(gòu)域,即鋅指結(jié)構(gòu)域和功能性結(jié)合結(jié)構(gòu)域,其中鋅指結(jié)構(gòu)域可以與啟動子區(qū)域GC位點(diǎn)結(jié)合,調(diào)節(jié)相關(guān)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平,另外功能性結(jié)合結(jié)構(gòu)域可以激活或者抑制轉(zhuǎn)錄活性。研究顯示[10],KLF5在多種腫瘤疾病中存在高表達(dá)現(xiàn)象,且表達(dá)水平越高患者的預(yù)后越差。在嚴(yán)云青等的研究中[11],研究結(jié)果顯示在肝癌細(xì)胞中,KLF5表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào),且其可以介導(dǎo)PI3K/Akt/Snail信號通路參與細(xì)胞的增殖及轉(zhuǎn)移。但是也有研究發(fā)現(xiàn)[12],KLF5在三陰性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)較低。也有研究報道[13],KLF5在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)較低,且結(jié)腸癌細(xì)胞中過表達(dá)KLF5可以抑制腫瘤細(xì)胞的生長。本次研究結(jié)果顯示,KLF5在甲狀腺乳頭癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁組織,表明KLF5表達(dá)與甲狀腺乳頭癌發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),KLF5表達(dá)與甲狀腺乳頭癌臨床分期、腫瘤組織大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯均有關(guān),此項(xiàng)研究結(jié)果進(jìn)一步表明KLF5在甲狀腺乳頭癌不同發(fā)展過程中均具有顯著差異,且甲狀腺乳頭癌進(jìn)展與KLF5表達(dá)有關(guān),甲狀腺乳頭癌進(jìn)展越嚴(yán)重,KLF5表達(dá)越高。

TAZ主要參與Hippo信號通路,正常生理?xiàng)l件下,在多種組織器官中均存在不同程度的表達(dá),也可以參與組織分化;病理?xiàng)l件下,可參與腫瘤細(xì)胞侵襲、增殖及轉(zhuǎn)移等過程。研究顯示[14],抑制結(jié)腸癌細(xì)胞中TAZ表達(dá)以后,結(jié)腸癌細(xì)胞活性明顯下降,同時細(xì)胞遷移及侵襲能力也顯著下降,此項(xiàng)研究表明TAZ在結(jié)腸癌中具有重要作用。本次研究結(jié)果顯示,甲狀腺乳頭癌組織中TAZ蛋白表達(dá)顯著高于癌旁組織,并且還與甲狀腺乳頭癌臨床分期、腫瘤組織大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯等均存在關(guān)系,此項(xiàng)研究表明TAZ也參與了甲狀腺乳頭癌進(jìn)展。

UHRF1在多種腫瘤疾病中均有不同程度表達(dá),如乳腺癌[15]、食管癌[16]、胰腺癌[17]等。E2F1為UHRF1上游調(diào)節(jié)因子,p53可以介導(dǎo)E2F1因子,進(jìn)而對UHRF1表達(dá)發(fā)揮抑制作用,由此表明p53基因活性下降也是造成腫瘤組織內(nèi)UHRF1異常過表達(dá)的原因之一。如耿沖等[18]研究稱,UHRF1在乳腺癌組織中表達(dá)較高,且乳腺癌患者預(yù)后復(fù)發(fā)有關(guān)。本次研究結(jié)果發(fā)現(xiàn),UHRF1在甲狀腺乳頭癌組織中表達(dá)高于癌旁組織,且與甲狀腺乳頭癌臨床分期、腫瘤組織大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯等病理參數(shù)有關(guān),表明UHRF1與甲狀腺乳頭癌浸潤程度存在關(guān)系。

上述研究結(jié)果均表明,KLF5、TAZ、UHRF1均與甲狀腺乳頭癌發(fā)生和發(fā)展存在關(guān)系,推測三者可能存在關(guān)聯(lián)性,通過Pearson相關(guān)性分析,KLF5、TAZ、UHRF1之間均存在正相關(guān)性,推測KLF5、TAZ、UHRF1三者可能共同參與了甲狀腺乳頭癌進(jìn)展。

綜上所述,甲狀腺乳頭癌組織中KLF5、TAZ、UHRF1的表達(dá)均上調(diào),并且均與臨床分期、腫瘤組織大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、甲狀腺外侵犯等病理參數(shù)存在關(guān)系。但是本次研究也存在不足,關(guān)于KLF5、TAZ、UHRF1三者共同作用參與甲狀腺乳頭癌疾病中的機(jī)制還需要深入研究。